張景禹 解萬(wàn)翠,2,3,4 車紅霞,2 楊錫洪,2

(1. 青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266042；2. 山東省生化工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266042；3. 青島智科檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，山東 青島 266002；4. 尚好科技有限公司，山東 青島 266002)

金烏賊(Sepiaesculenta)墨黑色素是天然色素的重要來(lái)源，是一種高度聚合的生物大分子，存在于墨囊中，是烏賊在防御和躲避危險(xiǎn)時(shí)噴出墨汁的主要成分，具有光保護(hù)作用[1]、抗氧化作用[2]、清除自由基[3]、金屬離子螯合作用[4]、抗炎作用[5]等功能。目前，黑色素在調(diào)節(jié)免疫低下[6]、保護(hù)糖尿病腎病對(duì)腎臟損傷[7]、治療侵襲性肺曲霉病[8]、保護(hù)急性酒精肝損傷[9]等方面具有良好的效果。

研究表明，氧化應(yīng)激與糖尿病[10]、阿爾茨海默病[11]和腸道炎癥[12]等慢性疾病密切相關(guān)。氧化應(yīng)激可使自由基、活性代謝物(ROS)和保護(hù)機(jī)制(抗氧化劑)之間失衡[13]，損傷重要的生物分子和細(xì)胞，導(dǎo)致疾病。

關(guān)于墨黑色素抗氧化能力的研究多為化學(xué)法[14-16]，而在細(xì)胞水平上的功效研究鮮有報(bào)道。已有的報(bào)道[17]僅通過(guò)測(cè)定細(xì)胞增殖活性探究墨黑色素對(duì)細(xì)胞的影響，無(wú)法反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的變化?；瘜W(xué)法只能簡(jiǎn)單測(cè)定抗氧化劑的抗氧化能力，不能真實(shí)模擬或反映機(jī)體內(nèi)部生理環(huán)境，不能有效評(píng)價(jià)其抗氧化活性與藥理作用的關(guān)系。相比于水洗、酶解、酸堿等提取法，Guo等[18]通過(guò)超聲輔助方法制備可溶性黑色素，說(shuō)明超聲法在改善黑色素溶解性方面具有很好的效果。試驗(yàn)擬以金烏賊為原料，采用超聲輔助法提取制備黑色素，并利用叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型，同時(shí)將不同濃度的黑色素溶液加入細(xì)胞中進(jìn)行提前干預(yù)，研究金烏賊墨黑色素在Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的保護(hù)作用，為黑色素作為一種食補(bǔ)或者營(yíng)養(yǎng)性的外源抗氧化劑的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

冷凍金烏賊：山東青島航?？凸荆?/p>

人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞：美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；

高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液：美國(guó)Hyclone公司；

胎牛血清：上海依科賽生物制品有限公司；

叔丁基過(guò)氧化氫(TBHP)：美國(guó)Sigma公司；

四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、BCA法總蛋白定量測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶SOD測(cè)定試劑盒、丙二醛MDA測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；

其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超聲波細(xì)胞破碎儀：JY92-IIN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-1800PC型，上海翱藝有限公司；

冷凍離心機(jī)：Happy-TL18型，山東濟(jì)南福的機(jī)械有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：FD-1A-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

傅里葉紅外光譜儀：Nicolet iS10型，賽默飛世爾科技有限公司；

掃描電子顯微鏡：JSM-6700F型，日本電子公司；

酶標(biāo)儀：BIO-RAD680型，美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱：MCO-15AC型，日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 超聲輔助提取及制備墨黑色素 參考Guo等[19]的方法并略作修改。取0.5 g干燥的黑色素樣品，溶于100 mL NaOH溶液(1 mol/L)中。超聲細(xì)胞破碎儀振幅80%，溫度上限30 ℃，超聲1 s，間歇1 s，總作用時(shí)間1 h，冷卻，加入1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值，8 000 r/min離心15 min，取上清液，真空冷凍干燥，得黑色素樣品。

1.2.2 紫外—可見光光譜和FT-IR光譜 將黑色素樣品充分溶解，配置成10 mg/L的溶液，使用紫外—可見光分光光度計(jì)在200～700 nm范圍內(nèi)掃描。稱取0.5 mg黑色素樣品，與KBr均勻混合并壓制成片劑，使用傅立葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.2.3 掃描電子顯微鏡和粒徑統(tǒng)計(jì) 黑色素樣品于真空噴金，通過(guò)掃描電子顯微鏡掃描圖像，掃描電壓5.0 kV/10 kV，工作距離8.4～8.8 mm。使用Nano meterer 1.2軟件對(duì)黑色素粒徑分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng) 在含有Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入含10%的胎牛血清(經(jīng)熱滅活處理)和雙抗(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)為單層后，對(duì)其進(jìn)行消化傳代。

1.2.5 黑色素對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，以密度5×104Cells/mL接種至96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后開始試驗(yàn)。試驗(yàn)組每孔加入200 μL樣品溶液，黑色素最終濃度分別為5，20，40，60，80，100 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組為正常細(xì)胞組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，采用MTT法[19]檢測(cè)，并按式(1)計(jì)算Caco-2細(xì)胞存活率。

(1)

式中：

C——Caco-2細(xì)胞存活率，%；

A1——黑色素干預(yù)組的吸光度；

A0——空白組吸光度；

A3——黑色素溶液吸光度；

A2——對(duì)照組吸光度。

1.2.6 TBHP誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，以密度5×104Cells/mL接種至96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后開始試驗(yàn)。細(xì)胞貼壁后孵育不同濃度梯度的TBHP(0，50，100，200，300，400 μmol/L)，孵育時(shí)間4 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，選擇半抑制濃度(IC50)為后續(xù)試驗(yàn)作用劑量。

1.2.7 不同濃度黑色素溶液對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的影響 細(xì)胞布板同1.2.6，細(xì)胞貼壁后分別加入5，20，40，60，80，100 μg/mL的黑色素溶液，每孔200 μL，每組5個(gè)復(fù)孔。孵育24 h后棄去上清，加入TBHP損傷4 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.2.8 細(xì)胞中SOD活性和MDA含量的測(cè)定 將Caco-2細(xì)胞以密度5×105Cells/mL接種至6孔板中。經(jīng)不同濃度黑色素溶液和TBHP處理后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，從平板上刮入到冷PBS中，采用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行均質(zhì)化。將勻漿液于4 ℃，5 000 r/min離心20 min，收集上清液。通過(guò)BCA分析試劑盒測(cè)定上清液樣品中的蛋白質(zhì)濃度，按測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行SOD、MDA測(cè)定[20]。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。使用SPSS 18.0和GraphPad Prism 8軟件分析，采用T檢驗(yàn)法對(duì)試驗(yàn)組和模型組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)處理，ns表示差異無(wú)顯著性，*表示P<0.05，**表示P<0.01；采用T檢驗(yàn)法對(duì)模型組和對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，##表示P<0.01；采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行試驗(yàn)組內(nèi)比較，字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外—可見光光譜和FT-IR光譜

由圖1可知，金烏賊墨黑色素在215 nm處有一個(gè)最大吸收峰，并且隨波長(zhǎng)的增加吸光度逐漸降低。這是由于黑色素分子中含有復(fù)雜的共軛結(jié)構(gòu)，因此寬光譜范圍內(nèi)的強(qiáng)吸收和隨波長(zhǎng)逐漸降低是黑色素的典型特性[21]。此外，260，280 nm處均未觀察到吸收峰，表明諸如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的雜質(zhì)含量少。

由圖2可知，3 420 cm-1處的強(qiáng)而寬的譜帶為—OH和—NH拉伸振動(dòng)；2 926，2 852 cm-1處的小峰和尖峰分別對(duì)應(yīng)于CH3、CH2的拉伸振動(dòng)；1 620 cm-1處的強(qiáng)吸收峰對(duì)應(yīng)芳族C═C和C═O基團(tuán)的拉伸振動(dòng)；1 372 cm-1處的吸收峰歸屬于酚O—H基團(tuán)的O—H變形和C—O拉伸；800～600 cm-1處的弱吸收峰表明芳香環(huán)的某些位置已被取代形成低芳族氫含量的共軛體系，與報(bào)道的真黑色素標(biāo)準(zhǔn)品[22]和天然魷魚黑色素[18]高度一致。其中，3 420，1 620 cm-1處的吸收峰被認(rèn)為是黑色素的代表特征，說(shuō)明超聲輔助提取的黑色素保留了黑色素特征基團(tuán)和吲哚結(jié)構(gòu)。

圖1 黑色素紫外—可見光譜圖

圖2 黑色素FT-IR光譜圖

2.2 掃描電子顯微鏡及粒徑統(tǒng)計(jì)

由圖3可知，金烏賊墨黑色素呈納球狀，具有不同的粒徑，主要分布于80～210 nm的范圍內(nèi)，顆粒表面輕微的凸起。黑色素單體顆粒并不代表保持其功能的最小基本單位，而只是代表一種擴(kuò)展的聚集[23]。超聲破碎后，黑色素部分顆粒發(fā)生形變，圓形顆粒的物理結(jié)構(gòu)遭到一定程度地破壞，使黑色素產(chǎn)生了更小顆粒并釋放更多的活性基團(tuán)[18]。

圖3 黑色素的顯微結(jié)構(gòu)

2.3 黑色素對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

由圖4可知，黑色素組的細(xì)胞存活率高于正常組，表明金烏賊墨黑色素對(duì)Caco-2細(xì)胞沒(méi)有毒性，還可在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。雷敏[17]研究發(fā)現(xiàn)不同分子量的水溶性魷魚墨黑色素在48 h內(nèi)顯著地促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。楊亞杰等[24]研究發(fā)現(xiàn)烏骨雞黑色素對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響。當(dāng)濃度為5～100 μg/mL時(shí)，金烏賊墨黑色素干預(yù)Caco-2細(xì)胞24 h未發(fā)現(xiàn)毒性作用，可在此條件下進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 黑色素對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

2.4 TBHP誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型的建立

由圖5可知，當(dāng)叔丁基過(guò)氧化氫濃度為0～400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率逐漸下降。當(dāng)叔丁基過(guò)氧化氫濃度為300～400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率緩慢降低。當(dāng)叔丁基過(guò)氧化氫濃度為400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率最低(10%)，細(xì)胞嚴(yán)重受損，此時(shí)叔丁基過(guò)氧化氫細(xì)胞損傷的IC50值為146.2 μmol/L。故后續(xù)采用150 μmol/L的叔丁基過(guò)氧化氫建立Caco-2細(xì)胞損傷。

圖5 TBHP對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

2.5 不同濃度黑色素溶液對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的影響

由圖6可知，叔丁基過(guò)氧化氫組的細(xì)胞存活率為59%，顯著低于正常組(P<0.05)，說(shuō)明采用150 μmol/L叔丁基過(guò)氧化氫能成功建立細(xì)胞損傷模型。黑色素組的細(xì)胞存活率均高于叔丁基過(guò)氧化氫組，且差異顯著(P<0.05)。其中，黑色素濃度為60 μg/mL的存活率與黑色素濃度為5，20，80 μg/mL的差異顯著，而與黑色素濃度為100 μg/mL的無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。綜上，金烏賊墨黑色素具有保護(hù)Caco-2細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)損傷的能力。

圖6 黑色素濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的影響

2.6 細(xì)胞中SOD活性和MDA含量的測(cè)定

由圖7可知，叔丁基過(guò)氧化氫能顯著提升Caco-2細(xì)胞中MDA含量(P<0.05)；經(jīng)40，60，80，100 μg/mL黑色素提前干預(yù)后，受損細(xì)胞中MDA含量下降，且與模型組差異顯著(P<0.05)。而黑色素組間MDA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)黑色素濃度為60 μg/mL時(shí)，Caco-2細(xì)胞中MDA含量為0.933 nmol/mg·Pro，為模型組的60%。經(jīng)叔丁基過(guò)氧化氫氧化損傷的Caco-2細(xì)胞中SOD酶活性顯著降低(P<0.05)；而經(jīng)40，60，80，100 μg/mL黑色素干預(yù)后，細(xì)胞中的SOD酶活顯著升高(P<0.05)，其中，黑色素濃度為60 μg/mL的細(xì)胞中SOD酶活為39.37 U/mg·Pro，為叔丁基過(guò)氧化氫模型組的1.86倍。綜上，黑色素可以通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物來(lái)降低細(xì)胞氧化損傷的程度；同時(shí)提高細(xì)胞中抗氧化物酶的活性，從而降低細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷水平。黑色素對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)機(jī)制可能與其他天然活性物質(zhì)并不相同，但都可通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化物酶活性、降低自由基對(duì)細(xì)胞損傷來(lái)提高細(xì)胞的存活率[25]。

3 結(jié)論

以叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人克隆結(jié)腸腺癌Caco-2細(xì)胞建立氧化損傷模型，研究了金烏賊墨黑色素對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，金烏賊墨黑色素可以通過(guò)提高Caco-2細(xì)胞中超氧化物歧化酶SOD活性和降低丙二醛MDA含量，清除過(guò)量的活性氧自由基和減少脂質(zhì)過(guò)氧化程度來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。由于細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的復(fù)雜性，烏賊墨黑色素的抗氧化應(yīng)激損傷分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

圖7 黑色素對(duì)叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞中MDA含量和SOD活性的影響

Figure 7 Effect of melanin on MDA content and SOD activity in Caco-2 cells induced by TBHP