曹麗娜 章建浩 王曉婷魏巧云 王藝月 嚴(yán)文靜

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095； 2. 江蘇省肉類加工與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095； 3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

檳榔(Arecacatechu)因具有獨(dú)特的風(fēng)味口感，在湖南乃至全中國發(fā)展規(guī)模迅速。由于檳榔產(chǎn)品的生產(chǎn)加工環(huán)境開放度高、包裝及從業(yè)人員手工操作，易導(dǎo)致檳榔成品微生物超標(biāo)，這是影響檳榔產(chǎn)品合格率的主要原因[1-2]。目前，檳榔的殺菌研究主要集中在初生產(chǎn)環(huán)節(jié)，如熱殺菌、SO2熏蒸、添加防腐保鮮劑等[3-4]，而關(guān)于檳榔成品的有效殺菌方法研究較少,主要有輻照殺菌、微波殺菌、脈沖強(qiáng)光殺菌[5-7]，但這些方法或?qū)壚破焚|(zhì)造成負(fù)面影響，或存在設(shè)備價(jià)格高、操作要求嚴(yán)格等問題。高壓電場低溫等離子體冷殺菌(cold plasma cold sterilization，CPCS)是一種新興的食品冷殺菌技術(shù)，該技術(shù)可與氣調(diào)包裝完美結(jié)合，具有溫升小、能耗低、無污染、無殘留、作用時(shí)間短、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[8]，特別適用于熱敏性食品的殺菌。

CPCS是在電極之間放置密封包裝的樣品，通過對電極施加高壓，激發(fā)電極板內(nèi)空氣產(chǎn)生活性氧(ROS)、活性氮(RNS)和紫外線光子等活性成分[9-10]，這些活性成分具有良好的殺菌作用，可與樣品表面微生物接觸，對細(xì)胞DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜等造成損傷，從而使微生物失活死亡[11-13]。同時(shí)，這些活性成分的存留時(shí)間較短，半衰期較長的臭氧及其他活性成分在24 h內(nèi)會(huì)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榛鶓B(tài)[14]。研究[15-16]表明，低溫等離子體技術(shù)對食品具有很好的殺菌效果。Misra等[17]研究發(fā)現(xiàn)低溫等離子體處理電壓60 kV，處理草莓5 min就能有效減少草莓的菌落總數(shù)。喬維維等[18]發(fā)現(xiàn)介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體在電壓強(qiáng)度72 kV的條件下處理牛肉86 s，殺菌率高達(dá)93.75%。目前，關(guān)于CPCS技術(shù)用于檳榔殺菌的研究尚未見報(bào)道，試驗(yàn)擬以湖南散裝檳榔為原材料，探究CPCS對檳榔的殺菌效果影響，在不影響其品質(zhì)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化殺菌工藝參數(shù)，為低溫等離子體技術(shù)在檳榔的冷殺菌領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

散裝檳榔：菌落總數(shù)為4.6 lg(CFU/g)左右，湖南皇爺食品有限公司；

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基 (PCA) 、氯化鈉：青島海博生物技術(shù)有限公司；

檳榔堿標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓電場低溫等離子體：CPCS-1型，南京蘇曼等離子體科技有限公司；

復(fù)合氣調(diào)包裝機(jī)：MAP-H360型，配有氣體比例檢測裝置，蘇州森瑞保鮮設(shè)備有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP-9012型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

液相色譜儀：Agilent 1260型，美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 檳榔的處理 與檳榔接觸的鑷子、包裝盒提前用75%的酒精消毒，并于超凈臺中滅菌30 min。稱取檳榔25 g于聚丙烯包裝盒(17 cm×12 cm×3.2 cm)中，隨機(jī)選取3盒，對照組為空氣包裝，處理組按不同因素水平氣調(diào)包裝后進(jìn)行CPCS處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

(1) CPCS處理頻率對檳榔殺菌率的影響：固定處理電壓70.5 kV，處理時(shí)間150 s，間隔時(shí)間30 s，氣體組成40% O2、30% CO2、30% N2，處理頻率分別為60，70，80，90，100，110，120 Hz。

(2) CPCS處理電壓對檳榔殺菌率的影響：固定處理頻率100 Hz，處理時(shí)間150 s，間隔時(shí)間30 s，氣體組成40% O2、30% CO2、30% N2，處理電壓分別為42.5，49.5，56.5，63.5，70.5 kV。

(3) CPCS氧氣比例對檳榔殺菌率的影響：固定處理電壓70.5 kV，處理頻率100 Hz，處理時(shí)間150 s，間隔時(shí)間30 s，固定N2比例30%，O2+CO2比例分別為10%+60%，20%+50%，30%+70%，40%+30%，50%+20%，60%+10%。

(4) CPCS處理時(shí)間對檳榔殺菌率的影響：固定處理電壓70.5 kV，處理頻率100 Hz，氣體組成為40% O2、30% CO2、30% N2，間隔時(shí)間30 s，處理時(shí)間分別為30，60，90，120，150，180，210 s。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以處理電壓、處理頻率、氧氣比例、處理時(shí)間為自變量，殺菌率為響應(yīng)值，對檳榔殺菌率進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化。

1.3.4 指標(biāo)測定

(1) 菌落總數(shù)：樣品經(jīng)CPCS處理后，置于自封袋中，加入225 mL無菌生理鹽水，均質(zhì)器以12次/s正反面各拍打1 min，選取合適梯度的稀釋液1 mL于平板，傾注滅菌冷卻的PCA搖晃混合均勻，每個(gè)梯度重復(fù)3次，凝固后于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。以未經(jīng)CPCS處理的檳榔為對照組，按GB 4789.2—2016方法進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù)。

(2) 殺菌率：按式(1)計(jì)算殺菌率。

(1)

式中：

Y——?dú)⒕剩?；

N0——低溫等離子體處理前菌落總數(shù)，CFU/g；

N——低溫等離子體處理后菌落總數(shù)，CFU/g。

(3) 水分含量：按GB 5009.3—2016執(zhí)行。

(4) 粗纖維含量：按GB/T 5009.10—2016執(zhí)行。

(5) 檳榔堿含量：根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果均用Excel軟件整理作圖，方差分析和顯著性檢驗(yàn)采用SAS 9.4軟件中GLM程序分析(P<0.05)，響應(yīng)曲面試驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.5軟件分析作圖，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 CPCS處理頻率對檳榔殺菌率的影響 由圖1可知，檳榔殺菌率隨CPCS處理頻率的增加先顯著(P<0.05)升高，當(dāng)處理頻率>100 Hz后趨于平緩。隨著處理頻率的增大，等離子設(shè)備的放電功率增大，增加了高能粒子的密度，低溫等離子體釋放的活性物質(zhì)等殺菌成分與食品微生物接觸，從而殺死微生物。Takaki等[20]發(fā)現(xiàn)介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體設(shè)備在放電過程中，隨著放電頻率的增大，樣品空間內(nèi)產(chǎn)生更多的活性粒子，而這些活性粒子正是殺菌的關(guān)鍵物質(zhì)，與試驗(yàn)結(jié)果一致。此外，處理頻率的變化決定整個(gè)體系溫度的變化，雖然高頻率具有更好的殺菌效果，但會(huì)使反應(yīng)體系的溫度升高，不適用于熱敏感食品的殺菌，也不利于食品品質(zhì)的保障。因此選擇處理頻率為90～110 Hz。

圖1 處理頻率對殺菌率的影響

2.1.2 CPCS處理電壓對檳榔殺菌率的影響 由圖2可知，檳榔殺菌率隨電壓強(qiáng)度的增大顯著(P<0.05)提高。一般而言，隨電壓的升高，激發(fā)產(chǎn)生的等離子體濃度越高，產(chǎn)生的活性成分更多，有利于臭氧和H2O2等殺菌成分的生成，殺菌效果越明顯[21]。Kim等[22]研究發(fā)現(xiàn)，等離子體的電壓強(qiáng)度對豬腰肉病原菌的殺菌有顯著影響，其殺菌率隨電壓的增高而增大。馬良軍等[23]研究發(fā)現(xiàn)電壓為70，80 kV時(shí)，原始菌從8 lg(CFU/mL)分別降至6，3 lg(CFU/mL)，殺菌效果隨電壓強(qiáng)度的增大而提高。試驗(yàn)中在70.5 kV的試驗(yàn)電壓下，菌落總數(shù)從4.65 lg(CFU/g)降至3.00 lg(CFU/g)，可能是因?yàn)闃悠返臓顟B(tài)(固態(tài)或液態(tài))會(huì)影響殺菌效果，液態(tài)、光滑表面的樣品經(jīng)CPCS處理后會(huì)產(chǎn)生明顯的殺菌效果，而對于一些表面粗糙的樣品如檳榔，達(dá)到相同殺菌效果則需更高的條件[24]。此外，樣品的初始菌數(shù)越多，同等條件下CPCS殺菌效果越顯著。因此選取電壓為56.5～70.5 kV。

2.1.3 CPCS氧氣比例對檳榔產(chǎn)品殺菌率的影響 目前氣調(diào)包裝技術(shù)常用的氣體是O2、N2、CO2。氣體組成會(huì)影響等離子體形成成分的組成，從而影響殺菌效果。Kim等[25]發(fā)現(xiàn)在純氬氣中加入一定量的氧氣會(huì)使活性氧的殺菌效果更高。CO2能抑制大多數(shù)腐敗細(xì)菌和霉菌生長繁殖，N2是惰性氣體，一般不與食品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，用以維持包裝外形。由圖3可知，當(dāng)氧氣比例為10%～40%時(shí)，殺菌率顯著(P<0.05)升高；當(dāng)氧氣比例>40%時(shí)，殺菌率呈下降趨勢。研究[26]表明O2有利于低溫等離子體產(chǎn)生活性氧等活性物質(zhì)，其中含氧活性成分在殺菌過程中起主要作用。馬良軍等[27]研究發(fā)現(xiàn)，低溫等離子處理單增李斯特菌時(shí)，隨著包裝內(nèi)O2濃度的提高，單增李斯特菌完全致死所需時(shí)間明顯降低。當(dāng)包裝內(nèi)O2含量較低時(shí)，激發(fā)產(chǎn)生的含氧活性成分量少，對微生物的致死作用不明顯；逐漸提高O2濃度，疊加CO2的抑菌作用導(dǎo)致殺菌率逐漸上升；當(dāng)O2含量過于飽和時(shí)，激發(fā)產(chǎn)生的活性氧等殺菌自由基量有限，即使再增大O2比例，微生物的致死率也不會(huì)有顯著變化，同時(shí)CO2的抑菌作用進(jìn)一步減弱，二者疊加會(huì)導(dǎo)致殺菌率呈緩慢降低趨勢。因此，綜合考慮選擇O2比例為20%～60%。

圖2 處理電壓對殺菌率的影響

Figure 2 Effects of processing voltage on the sterilization rate

2.1.4 CPCS處理時(shí)間對檳榔產(chǎn)品殺菌率的影響 由圖4可知，低溫等離子體殺菌效果隨處理時(shí)間的延長先顯著(P <0.05)上升，當(dāng)處理時(shí)間超過150 s后趨于平緩。Niemira等[28]利用等離子體處理蘋果時(shí)，發(fā)現(xiàn)所有處理組的殺菌率隨處理時(shí)間的增加而增加。Misra等[17]研究等離子體對櫻桃的殺菌過程，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的延長，殺菌率越高。Hu等[29]研究低溫等離子體對大腸桿菌的殺菌過程發(fā)現(xiàn)，殺菌率隨處理時(shí)間的延長先上升后趨于平緩，與試驗(yàn)結(jié)果一致。這是由于隨著處理時(shí)間的延長，產(chǎn)生的等離子體中的活性成分濃度增大，對檳榔表面微生物的鈍化效果越好；然而，當(dāng)活性成分在包裝內(nèi)累積至一定程度時(shí)，其對樣品表面微生物致死作用有限。因此選取處理時(shí)間為120～180 s。

圖3 氧氣比例對殺菌率的影響

圖4 處理時(shí)間對殺菌率的影響

Figure 4 Effects of processing time on the sterilization rate

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以處理電壓、處理頻率、處理時(shí)間和氧氣比例為影響因素，以殺菌率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，各因素水平表見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型建立及顯著性分析 利用Design-Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合分析，得殺菌率對自變量回歸方程為：

Y=-1 160.82+11.21A+16.74B+1.407C+0.378D+0.073AB-6.75×10-3AC+0.013AD-4.64×10-3BC-3.8×10-3BD+1.83×10-3CD-0.084A2-0.172B2-7.68×10-3C2-4.41×10-3D2。

(2)

表1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)因素與水平

Table 1 Box-Behnken center composite test factors and level

水平A處理頻率/HzB處理電壓/kVC氧氣比例/%D處理時(shí)間/s-19056.520120010063.540150111070.560180

表2響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 2 Experiment design and results for response surface analysis

序號ABCD殺菌率/%1-1-10057.621-10060.73-110067.24110090.8500-1-173.16001-173.5700-1182.18001186.99-100-163.110100-168.111-100168.512100189.3130-1-1058.81401-1083.2150-11064.416011086.217-10-1065.31810-1083.719-101072.820101085.8210-10060.422010-179.8230-10173.824010190.025000088.226000085.127000087.628000086.629000084.2

2.2.3 處理頻率和處理電壓的交互作用 由圖5可知，處理頻率和處理電壓的曲面傾斜程度較大，等高線呈橢圓形，表明處理頻率和處理電壓對殺菌率影響顯著，且兩因素間交互作用顯著(P<0.05)，同時(shí)，處理電壓比處理頻率的曲面斜率更大，說明處理電壓對殺菌率的影響更顯著。

由表4可知，一定電壓強(qiáng)度下，處理頻率越偏離臨界值，殺菌率越低。將處理頻率臨界值對電壓進(jìn)行線性回歸分析可知，處理頻率對低溫等離子體殺菌率影響的臨界值隨處理電壓的升高呈線性上升趨勢(y=0.434x+76.445，R2=1)，且變化顯著。當(dāng)電壓從49.5 kV上升至70.5 kV時(shí)，殺菌率從30%迅速上升至95%附近，表明殺菌率隨處理電壓的升高呈明顯的上升趨勢，當(dāng)處理電壓為70.5 kV時(shí)，殺菌率達(dá)最高值，與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

表3 方差分析結(jié)果?

由表5可知，處理電壓對等離子體殺菌率影響的臨界值隨處理頻率的升高呈線性增大趨勢(y=0.212 8x+46.459，R2=1)，殺菌率隨處理頻率的升高先上升后降低，當(dāng)處理頻率繼續(xù)上升至120 Hz時(shí)，殺菌率略有降低。低溫等離子體產(chǎn)生于密閉包裝空間內(nèi)，所產(chǎn)生的活性氧等自由基的含量在高能粒子間的復(fù)雜反應(yīng)條件下，成分發(fā)生轉(zhuǎn)變，因此在較高的處理頻率下殺菌率反而降低，表明在實(shí)際殺菌過程中，處理頻率不宜過高。

2.2.4 處理頻率和處理時(shí)間的交互作用 由圖6可知，處理頻率和處理時(shí)間的曲面傾斜程度較大，等高線呈橢圓形，表明處理頻率和處理電壓對殺菌率影響顯著，且交互作用明顯(P<0.05)。處理頻率比處理時(shí)間的響應(yīng)曲面斜率更大，說明處理頻率對殺菌率的影響更顯著。

由表6可知，處理頻率對殺菌率影響的臨界值隨處理時(shí)間的延長呈線性上升趨勢(y=0.077 5x+95.466，R2=1)。當(dāng)處理時(shí)間為150 s時(shí)，殺菌率上升趨于平緩，與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本保持一致。

圖5 處理頻率和處理電壓對殺菌率的交互作用

Figure 5 Response surface of interaction between processing frequency and processing voltage on sterilization rate

表4不同處理電壓下處理頻率對殺菌率影響的臨界值

Table 4 The critical value of the influence of processing frequency on the sterilization rate under different processing voltage

處理電壓/kV回歸方程處理頻率臨界值/Hz殺菌率/%0.0Y=-0.084 3A2+12.89A-1 148.37376.45-49.5Y=-0.084 3A2+16.51A-778.58897.9230.0656.5Y=-0.084 3A2+17.02A-794.321100.9464.7563.5Y=-0.084 3A2+17.53A-826.910104.0285.2570.5Y=-0.084 3A2+18.05A-870.280107.0595.91

表5不同處理頻率下處理電壓對殺菌率影響的臨界值

Table 5 The critical value of the influence of processing voltage on the sterilization rate under different processing frequency

處理頻率/Hz回歸方程處理電壓臨界值/kV殺菌率/%0Y=-0.172B2+15.984B-1 148.37346.46-90Y=-0.172B2+22.572B-671.10365.6169.44100Y=-0.172B2+23.304B-702.37367.7486.98110Y=-0.172B2+24.036B-749.46269.8790.26120Y=-0.172B2+24.768B-804.37172.0087.27

圖6 處理頻率和處理時(shí)間對殺菌率的交互作用

表6不同處理時(shí)間下處理頻率對殺菌率影響的臨界值

Table 6 The critical value of the influence of processing frequency on the sterilization rate under different processing time

處理時(shí)間/s回歸方程處理頻率臨界值/Hz殺菌率/%0Y=-0.084 3A2+16.10A-804.62595.49-120Y=-0.084 3A2+17.66A-842.245104.7479.94150Y=-0.084 3A2+18.05A-870.280107.0595.91180Y=-0.084 3A2+18.44A-910.672109.3797.73210Y=-0.084 3A2+18.85A-955.484111.8098.26

由表7可知，處理時(shí)間對低溫等離子體殺菌率影響的臨界值隨處理頻率的上升呈線性升高趨勢(y=1.473 9x+20.742，R2=1)。當(dāng)處理頻率為0～110 Hz時(shí)，殺菌率顯著上升；當(dāng)處理頻率為110 Hz時(shí)，殺菌率有所降低。因此，實(shí)際殺菌應(yīng)用過程中，為達(dá)到殺菌快速高效的目的，盡量選擇處理時(shí)間短且處理頻率不宜過高的條件。綜上，當(dāng)處理頻率為107.05～110.00 Hz，處理時(shí)間為150.00～182.87 s時(shí)，檳榔殺菌率達(dá)最高值。

2.2.5 CPCS工藝優(yōu)化 經(jīng)Design-Expert軟件分析可知，最佳工藝條件為處理頻率108.78 Hz、處理電壓69.17 kV、氧氣比例44.37%、處理時(shí)間180 s，此條件下殺菌率達(dá)97.32%?？紤]到實(shí)際設(shè)備操作的方便性，調(diào)整為處理頻率110 Hz、處理電壓70.5 kV、氧氣比例40%、處理時(shí)間180 s，修正后的殺菌率為97.20%(n=3)，相對誤差為0.12%，表明該模型的預(yù)測值與實(shí)際試驗(yàn)值吻合度高，響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果可靠。

表7 不同處理頻率下處理時(shí)間對殺菌率影響的臨界值

2.3 CPCS對檳榔品質(zhì)指標(biāo)的影響

由表8可知，CPCS處理后對檳榔的水分含量、粗纖維、檳榔堿無顯著影響(P>0.05)，表明高壓電場低溫等離子體殺菌處理后，對檳榔的主要品質(zhì)指標(biāo)無明顯影響(P>0.05)。

表8低溫等離子體對檳榔品質(zhì)指標(biāo)的影響

Table 8 Effects of cold plasma on the quality index of Areca catechu%

3 結(jié)論

高壓電場低溫等離子體的處理電壓、處理頻率、處理時(shí)間和氧氣比例對檳榔殺菌影響顯著(P<0.05)。處理頻率的升高與處理電壓、處理時(shí)間臨界值的變化呈正相關(guān)(R2=1)，處理頻率與處理電壓、處理頻率與處理時(shí)間的交互作用對檳榔殺菌率的影響顯著(P<0.05)；高壓電場低溫等離子體處理檳榔的最佳條件為處理頻率110 Hz、處理電壓70.5 kV、氧氣比例40%、處理時(shí)間180 s，該條件下的殺菌率為97.20%，經(jīng)殺菌后檳榔堿等主要品質(zhì)指標(biāo)含量無明顯變化。低溫等離子體的殺菌效果還受空氣濕度、氣體流速、包裝材料等因素的影響，且對不同品種的檳榔殺菌效果也不盡相同。不同空氣濕度及包裝材料對檳榔殺菌效果和品質(zhì)的影響還有待探索。