李洪亮 李 丹 張 超 張東杰

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

水稻中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要包括淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、脂類(lèi)物質(zhì)等[1]。鮮食水稻指在乳熟期至成熟期之間收獲、利用的水稻，此時(shí)水稻籽粒營(yíng)養(yǎng)素含量與活性最佳，這時(shí)采收可以提升水稻的利用價(jià)值[3]。

2013年，中國(guó)的行業(yè)專(zhuān)家創(chuàng)造性地提出了基于“全谷物”的“鮮食全谷物”的新概念?！磅r食全谷物”是通過(guò)對(duì)谷物整粒加工進(jìn)行徹底和即時(shí)的冷凍，不需經(jīng)過(guò)破碎、研磨等加工處理，可極大程度保留稻谷天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和功能成分。但中國(guó)開(kāi)發(fā)鮮食全谷物新產(chǎn)品發(fā)展進(jìn)程緩慢，僅局限于傳統(tǒng)意義上的鮮食產(chǎn)品例如玉米和豆類(lèi)。目前有關(guān)于水稻鮮食的報(bào)道還很少。

近幾年各類(lèi)谷物多糖功效被報(bào)道，玉米多糖具有減肥降脂，降血糖，提升免疫力，抗衰老作用等功效[3-4]；大豆多糖對(duì)自由基有明顯的清除效果，具有抗腫瘤作用，并可以調(diào)節(jié)血糖、血脂、改善腸道活性、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)元素吸收等[5-6]；大麥多糖具有降血糖活性，對(duì)羥基自由基有良好的清除效果[7]。與稻米有關(guān)的多糖研究表明，糙米發(fā)芽后多糖、米糠多糖均具有較好的抗氧化活性[8-9]；水稻灌漿后16～24 d所含生物活性物質(zhì)最為豐富[10]，但其中發(fā)揮重要作用的組分有待深入研究。試驗(yàn)擬以不同成熟時(shí)期的鮮食水稻籽粒為原料，探索鮮食水稻籽粒中多糖的單糖組成與抗氧化能力，為鮮食水稻的加工利用提供參考，并為開(kāi)發(fā)新型水稻產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鮮食水稻：型號(hào)龍粳-31，分別采集乳熟(前、中、后)期、蠟熟期與完熟期的水稻樣品，采收地點(diǎn)為黑龍江省鶴崗寶泉嶺名山農(nóng)場(chǎng)；

無(wú)水乙醇、苯酚：分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司；

硫酸、正丁醇、三氯甲烷：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

過(guò)硫酸鉀、硫酸亞鐵、抗壞血酸：分析純，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；

甲醇、乙腈、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、三氟乙酸：色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

單糖標(biāo)準(zhǔn)品(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超聲—微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀：CW-2000型，上海新拓分析儀器科技有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1260 LC型，安捷倫科技有限公司；

電子天平：AR323CN型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU-1810PC型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 鮮食水稻籽粒多糖提取 參考超聲—微波協(xié)同萃取法[11]，并稍加修改。將鮮食水稻經(jīng)60 ℃烘干至恒重，脫殼，粉碎，過(guò)100目篩得鮮食水稻干粉，鮮食水稻干粉石油醚回流除脂，以料液比1∶10 (g/mL)加入蒸餾水，在超聲波功率50 W，微波功率600 W，溫度65 ℃條件下超聲—微波萃取30 min，3 200 r/min離心15 min，重復(fù)提取2次合并上清液。通過(guò)Molish試驗(yàn)檢測(cè)所提物成分[12]，酶法除淀粉，用4倍體積無(wú)水乙醇在4 ℃下沉淀12 h，3 200 r/min離心15 min，蒸餾水溶解沉淀，Sevage法除蛋白質(zhì)，膜法除去小分子物質(zhì)[13-14]，冷凍干燥12 h，得鮮食水稻籽粒多糖粉。

1.2.2 鮮食水稻籽粒多糖測(cè)定

(1) 配制6%苯酚溶液：稱(chēng)取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，常壓蒸餾，收集(180±2) ℃餾分。精密稱(chēng)取該餾分6 g于100 mL容量瓶中，再加入94 g蒸餾水，搖勻后轉(zhuǎn)置于棕色試劑瓶中，即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液，將其置于冰箱中備用[15]。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg溶解于100 mL容量瓶中。搖勻配制成1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液置于25 mL具塞比色管中，各加蒸餾水至2 mL，分別加入6%苯酚試劑1 mL，搖勻后立刻加入濃硫酸5 mL，立刻搖勻后靜置30 min。于490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程[16-17]。

(3) 鮮食水稻籽粒多糖測(cè)定：將提取的樣品稀釋后按照1.2.2(2)的方法進(jìn)行測(cè)定，得到所提樣液含糖量。

1.2.3 鮮食水稻籽粒多糖分子組成測(cè)定 取20 mg鮮食水稻籽粒多糖樣品于10 mL具塞試管中，加1 mL蒸餾水溶解多糖，加入4 mol/L三氟乙酸1 mL，密封，在110 ℃條件下水解5 h，冷卻后，用甲醇蒸餾4 次，除去多余的酸，蒸干后取2 mg干物質(zhì)，溶解于0.3 mol/L NaOH溶液(200 μL)中，加入0.5 mol/L PMP—甲醇溶液200 μL，混勻，70 ℃條件下反應(yīng)1 h，加入0.3 mol/L HCl溶液(200 μL)，混勻，加入1 mL氯仿，用力振搖，4 000 r/min離心5 min，棄掉氯仿層[18-19]，將上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取10 μL濾液準(zhǔn)備上樣。參照馬麗萍[20]的方法，稍作修改，使用1260型高效液相色譜儀，其中HPLC條件為：C18柱；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A為pH 6.7的KH2PO4—Na2HPO4溶液(83%)，流動(dòng)相B為乙腈(17%)；DAD檢測(cè)器，波長(zhǎng)245 nm。

1.2.4 鮮食水稻籽粒多糖抗氧化能力測(cè)定

(1) ABTS+自由基清除能力：使用2.45 mmol/L K4S2O8溶液配制2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS+)溶液，得到7 mmol/L ABTS+儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液在室溫、避光條件下放置16 h，取適量?jī)?chǔ)備液，用pH 7.4 PBS(phosphate buffer saline)緩沖液稀釋至734 nm波長(zhǎng)下OD值為0.70±0.02，作為ABTS+工作液。將樣品稀釋得到不同濃度梯度待測(cè)液，取0.5 mL樣品，加入3.5 mL ABTS+工作液，均勻混合，避光反應(yīng)20 min后在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[21]。根據(jù)式(1)計(jì)算得到ABTS+自由基清除率。

(1)

式中：

R——清除率，%；

A0——空白組吸光度值；

A1——樣品吸光度值；

A2——對(duì)照組吸光度值。

(2) DPPH自由基清除能力：用無(wú)水乙醇配制0.1 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液于棕色容量瓶中，避光保存。將稀釋成不同濃度梯度的樣品分別取2 mL于試管中，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，避光條件下反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[22]。根據(jù)式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(3) 羥基自由基清除能力：分別配制質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL鮮食水稻籽粒多糖溶液置于不同燒杯中，然后分別加入9 mmol/L FeSO4溶液1 mL、9 mmol/L水楊酸—乙醇溶液1 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL并啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水為參比，在510 nm下測(cè)量各濃度的吸光度[23]。根據(jù)式(1)計(jì)算羥基自由基清除率。

(4) 超氧陰離子清除能力：取50 mmol/L Tris-HCl 溶液(pH 8.2)3 mL于10 mL具塞試管中，分別加入0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL樣品2 mL，混勻，在25 ℃水浴條件下反應(yīng)10 min，加入提前在等溫度下預(yù)熱的30 mmol/L鄰苯三酚溶液200 μL，混勻后反應(yīng)4 min，加入0.5 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，在320 nm處測(cè)量吸光度[24]。根據(jù)式(1)計(jì)算超氧陰離子清除率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS分析軟件進(jìn)行處理，差異顯著性P<0.05表示有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組數(shù)據(jù)平均值(Mean)均采用：均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3，作為最終參考比較值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮食水稻籽粒多糖含量

將在5個(gè)不同成熟階段采集的鮮食水稻樣品進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線所得到的回歸方程y=0.284 5x-0.022 5(R2=0.998 9)得到各采集時(shí)間多糖含量以及變化規(guī)律如圖1所示。隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮食水稻籽粒中多糖含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中乳熟后期多糖含量最多，達(dá)46.89 mg/g。水稻灌漿初期，籽粒中的多糖組分處于蓄積狀態(tài)，在乳熟后期多糖含量達(dá)到最大值，籽粒逐漸變堅(jiān)硬，隨后多糖逐漸合成淀粉儲(chǔ)存于籽粒中，以至于多糖含量降低，成熟后多糖含量變化趨于平穩(wěn)。

圖1 不同采集時(shí)期鮮食水稻籽粒多糖含量

Figure 1 Polysaccharides content of immature rice seeds in different collecting periods

2.2 鮮食水稻籽粒多糖Molish試驗(yàn)分析

糖在濃H2SO4或濃鹽酸的作用下脫水形成糠醛及其衍生物與α-萘酚作用形成紫紅色復(fù)合物。如圖2所示，添加淀粉的b管中幾乎無(wú)顏色變化，與空白相近，c～h管中均產(chǎn)生顏色反應(yīng)，結(jié)果表明通過(guò)超聲—微波協(xié)同萃取出的物質(zhì)確為非淀粉多糖。

a. 水 b. 淀粉 c. 葡萄糖 d～h. 分別為乳熟前期、乳熟中期、乳熟后期、臘熟期及完熟期鮮食水稻提取出的多糖

圖2 Molish法鑒別鮮食水稻籽粒多糖

Figure 2 Identification of fresh edible rice seeds polysaccharides by Molish method

2.3 鮮食水稻籽粒多糖結(jié)構(gòu)組成

由圖3可知，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖9種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別為12.495，17.224，18.114，20.827，25.390，28.977，30.627，31.835，36.943 min。將不同濃度單糖對(duì)照品測(cè)定后進(jìn)行分析得到回歸方程如表1所示。

由表1可以看出，各單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線均有較好的擬合度。根據(jù)各單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出不同時(shí)期的鮮食水稻籽粒中多糖所含的各單糖含量，單糖含量如表2所示。

從表2可以得出，鮮食水稻籽粒中的多糖，均含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖，但在蠟熟期、完熟期這兩個(gè)時(shí)期的鮮食水稻提取出的多糖中，未檢測(cè)出甘露糖和巖藻糖，其原因可能是水稻在成熟后期甘露糖和巖藻糖不能穩(wěn)定的存留在籽粒內(nèi)部導(dǎo)致的。隨著鮮食水稻籽粒逐漸成熟，半乳糖含量呈下降趨勢(shì)，葡萄糖含量相對(duì)較多，且呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明葡萄糖為鮮食水稻籽粒中多糖的主要組成部分。

a. 甘露糖 b. 鼠李糖 c. 葡萄糖醛酸 d. 半乳糖醛酸 e. 葡萄糖 f. 半乳糖 g. 木糖 h. 阿拉伯糖 i. 巖藻糖

圖3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

Figure 3 HPLC chromatogram of monosaccharide standard

2.4 鮮食水稻籽粒多糖抗氧化能力

2.4.1 ABTS+自由基清除能力 由圖4可知，鮮食水稻籽粒多糖對(duì)ABTS+自由基有一定清除能力，且呈明顯的濃度依賴(lài)性；當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí)，乳熟后期鮮食水稻籽粒多糖清除率最強(qiáng)，達(dá)86.18%，其活性已趨近于VC的活性，較其他時(shí)期存在顯著差異(P<0.05)?？梢?jiàn)在乳熟后期鮮食水稻籽粒多糖清除ABTS+自由基能力更強(qiáng)。有研究[25-26]表明，小米糠多糖、燕麥多糖對(duì)ABTS+自由基清除率約為57.84%，50.62%，均低于試驗(yàn)中乳熟后期鮮食水稻籽粒多糖。

2.4.2 DPPH自由基清除能力 如圖5所示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，鮮食水稻籽粒多糖對(duì)DPPH都有一定的清除作用，其清除效果與多糖濃度呈正相關(guān)。在測(cè)定范圍內(nèi)濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH的清除率最高；乳熟后期鮮食水稻籽粒多糖與其他4個(gè)成熟階段的多糖存在差異顯著(P<0.05)。雖然與VC相比還存在一定差異，但是與相關(guān)研究中大豆多糖(19.19%)[27]、納豆多糖(18.33%)[28]相比還存在一定優(yōu)勢(shì)。

表1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 鮮食水稻籽粒多糖的單糖百分含量?

? ND為未檢出；與完熟期相比較，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

圖4 不同成熟時(shí)期鮮食水稻中多糖的ABTS+自由基

Figure 4 ABTS+radical scavenging ability of polysaccharides in immature rice at different developing stages

2.4.3 羥基自由基清除能力 如圖6所示，乳熟后期鮮食水稻籽粒清除能力均比同一濃度下不同生長(zhǎng)階段的鮮食水稻籽粒多糖的清除能力高，達(dá)75.62%。說(shuō)明鮮食水稻籽粒在乳熟后期至蠟熟期的生長(zhǎng)階段，其羥自由基清除能力更強(qiáng)。

2.4.4 超氧陰離子清除能力 從圖7可以看出，VC和鮮食水稻籽粒多糖對(duì)超氧陰離子都有一定的清除能力；其中乳熟后期鮮食水稻籽粒多糖對(duì)超氧陰離子的清除率最高，達(dá)41.49%，但仍略遜色于VC的清除能力。有研究[29]表明，粳米蛋白肽對(duì)超氧陰離子的清除能力為42.00%，與試驗(yàn)結(jié)果相似。說(shuō)明試驗(yàn)所獲原料同樣具有清除超氧陰離子的能力。

圖5 不同成熟時(shí)期多糖的DPPH自由基清除能力

Figure 5 DPPH radical scavenging ability of polysaccharides in immature rice seeds at different developing stages

圖6 不同成熟時(shí)期鮮食水稻籽粒多糖的羥基自由基清除能力

Figure 6 OH radical scavenging ability of polysaccharides on immature rice at different developing stages

圖7 不同成熟時(shí)期鮮食水稻籽粒多糖的超氧陰離子清除能力

Figure 7 Superoxide anion scavenging ability of polysaccharides in immature rice at different developing stages

3 結(jié)論

以不同成熟時(shí)期的鮮食水稻籽粒為原料，通過(guò)超聲—微波協(xié)同萃取技術(shù)，得到非淀粉多糖，進(jìn)一步研究了多糖的組成及抗氧化活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，乳熟后期，鮮食水稻中多糖的含量最高，達(dá)46.89 mg/g，而且其組分主要為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖等，而完熟期鮮食水稻的多糖組分中并未檢出甘露糖和巖藻糖；研究發(fā)現(xiàn)，乳熟后期的鮮食水稻籽粒多糖對(duì)ABTS+自由基、DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除率分別為86.18%，56.81%，75.62%，41.69%，均強(qiáng)于其他時(shí)期，但與VC相比仍顯遜色。