邢 倩 鄭溜豐 甘 婷 肖 婷 鄧澤元 劉小如

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

由肥胖、糖尿病等導致的心血管疾病已成為全球死亡的首要原因[1]。根據《中國心血管病報告2018》指出，過去10年中國死于心血管疾病的居民占總構成比的40%以上，居于首位，高于腫瘤及其他疾病[2]。雖然心血管疾病的病因和發(fā)病機制復雜，但慢性低水平炎癥是包括心血管疾病在內的多種慢性病發(fā)生發(fā)展的典型特征之一[3]。炎癥本身是人體重要的免疫性防御機能，但是長期過剩的慢性低水平炎癥會造成人體功能受損，最終直接導致慢性病的發(fā)生[4-5]。更有研究[6]指出，動脈粥樣硬化最有潛質的干預靶點是低水平炎癥。另外，血管內皮細胞損傷是心血管疾病發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，其中炎癥是其重要誘因[7]。因此，通過抑制低水平炎癥導致的血管內皮細胞損傷是防治心血管疾病的重要手段[8]。

近年來發(fā)現，藥食兼用植物以安全、低耐藥、特異性強等優(yōu)勢對于炎癥有良好的治療作用[9]。三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)是中國民間常用的中草藥，有藥食兩用功效，主要分布于江西、安徽、浙江及西南地區(qū)[10]，以安全無副作用、低耐藥性的特點被廣泛應用[11]。作為中草藥，三葉青具有祛風化痰，清熱解毒等多種活性。三葉青臨床應用歷史悠久，對于治療惡性腫瘤、炎癥反應、抗病毒、保肝的效果尤為顯著[12-13]。三葉青的抗癌作用已被廣泛研究[14]，其可抑制癌細胞的生長與繁殖。Peng等[15]發(fā)現三葉青乙酸乙酯提取物可激活線粒體途徑，誘導人肝癌細胞HepG2的凋亡。試驗主要探究三葉青的抗炎活性成分，為三葉青的藥用價值尋找新靶點。Liu等[16]報道了以10～160 μg/mL的三葉青根部黃酮粗提物處理細胞，可以顯著降低一氧化氮、IL-1β、TNFα等促炎因子的產生，抑制NF-κB通路活性，并上調抗炎細胞因子IL-10的表達，從而緩解炎癥反應。這些提示除抗癌外，三葉青有望成為安全有效的藥食兩用抗炎中草藥。此外，課題組[17]從三葉青的根部和葉片中鑒定出了133種天然產物，其中根部中山奈酚-3-O-蕓香糖苷、蘆丁、異槲皮素含量較多；而葉片中富含的成分有5-咖啡酰奎寧酸、葒草苷、異牡荊苷、異葒草苷、牡荊苷，但具體何種成分發(fā)揮抗炎作用及其機制有待于進一步研究。核轉錄因子NF-E2相關因子(Nuclear factor NF-E2 related factor，Nrf2)是被廣泛關注的藥效靶標，參與對慢性病下細胞損傷的保護作用，激活Nrf2可成為防治心血管疾病的有效方法[18-19]。最新的研究指出，Nrf2是抗炎網路中的關鍵節(jié)點[20]，在正常條件下，Nrf2主要存在于細胞質中，與泛素連接酶肌動結合蛋白Keap1結合并促進自身泛素化及降解[21]。值得注意的是，與Keap1的結合是植物活性物質促使Nrf2解離并入核發(fā)揮作用的關鍵環(huán)節(jié)[22]。

試驗擬基于與Keap1蛋白的分子對接，從三葉青中篩選了可能具有潛在抗炎活性的成分，同時在腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNFα)聯合白細胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)誘導的血管內皮細胞低水平炎癥模型下深入探究具體何種活性成分能強效抗炎，并分析該活性成分在培養(yǎng)基及緩沖鹽溶液中的穩(wěn)定性及細胞中的攝取，同時揭示其抗炎機制，旨在為三葉青發(fā)揮強效抗炎作用提供有力的依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

人臍靜脈血管內皮細胞(Human umbilical vein endothelial，HUVEC)：武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 試劑

細胞因子IL-17、腫瘤壞死因子TNFα：美國Peprotech公司；

Ham's F-12K (Kaighn's) Medium(F-12K)培養(yǎng)基：武漢普諾賽生命科技有限公司；

胎牛血清(FBS)：以色列Biolnd公司；

胰蛋白酶：美國Sigma公司；

山奈酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、蘆丁、5-咖啡?？鼘幩?新綠原酸)、牡荊苷、葒草苷標準品：>98%，中國索萊寶科技有限公司；

Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)、BCA蛋白濃度測定試劑盒：中國碧云天生物科技公司；

RIPA裂解液：加拿大Thermo Fisher公司；

一抗：英國Abcam公司；

二抗：北京全式金生物有限公司；

TRIzolTMReagent：加拿大Thermo Fisher公司；

PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)：日本TaKaRa公司；

Bestar?qPCR mastermix(SYBR Green)：德國DBI?Bioscience公司。

1.1.3 儀器與設備

超高效液相色譜儀：1290型，美國Agilent公司；

三重四級桿液質聯用儀：6470型，美國Agilent公司；

生物安全柜：BHC-1300A/B3型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

低溫高速離心機：Neofuge 15R型，香港力康公司；

細胞破碎儀：Qsonica Sonicator Q500型，加拿大Thermo Fisher 公司；

CO2細胞培養(yǎng)箱：Forma series II型，加拿大Thermo Fisher公司；

化學發(fā)光成像儀：ChemiDocTMXRS+型，美國伯樂公司；

蛋白質電泳儀：DYCZ-24DN型，北京六一生物科技有限公司；

轉膜儀：Criterion系，美國伯樂公司；

倒置顯微鏡：37XC(XDS-1A)型，上海蔡康光儀器公司；

震蕩混合器：WH-866型，中國太倉科教器材廠；

實時定量PCR：CFX96 Touch型，美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 Keap1蛋白的同源建模和分子對接 采用同源模型服務軟件SWISS-MODEL預測人源Keap1蛋白的三維結構，選擇相似度且評分最高的模型作為蛋白的三維晶體結構[23]。采用Ramachandran plot和Profile-3D方法對模型進行評估，進一步采用分子對接軟件AutoDockTools將Keap1與成分進行對接，使用Flexible Docking模塊計算兩者相互作用的位點及對接能。成分的分子結構從Automated Topology Builder上下載。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)及0.1%雙抗的F-12K培養(yǎng)基中。待細胞長滿后棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞兩次，加入含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶液消化細胞，顯微鏡下觀察到游離細胞后棄去消化液，加入培養(yǎng)液反復吹打，稀釋后裝入新培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕箱中培養(yǎng)。

1.2.3 Western blot測定細胞蛋白表達水平 將山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、蘆丁、5-咖啡奎寧酸、牡荊苷、葒草苷標準品分別用二甲基亞砜溶解，配成200 mmol/L的母液，用培養(yǎng)基稀釋至試驗需求濃度。將HUVEC細胞用胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)基稀釋。取6 cm小皿，每皿加入3 mL細胞，放進37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h至貼壁。倒掉培養(yǎng)基，每皿加入不同濃度的標準品孵育2 h，再用1 ng/mL TNFα聯合100 ng/mL IL-17誘導細胞低水平炎癥，37 ℃培養(yǎng)12 h。結束后參考Zheng等[24]的方法制備細胞全蛋白裂解液，BCA法測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳及轉膜，最終發(fā)光顯影拍照，導入軟件分析得到蛋白表達量。

1.2.4 CCK8方法測定細胞存活率 96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液，待細胞貼壁。在進行牡荊苷自身的細胞毒性試驗時加入不同濃度的牡荊苷，每個濃度8個復孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。在進行牡荊苷緩解內皮細胞炎癥的試驗時先加入不同濃度的牡荊苷孵育2 h，再用1 ng/mL TNFα聯合100 ng/mL IL-17誘導細胞低水平炎癥，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后倒掉培養(yǎng)基，加入CCK8，1 h后用酶標儀測定OD450 nm值。按式(1)計算細胞存活率。

(1)

式中：

c——細胞存活率，%；

OD1——試驗組OD450 nm值；

OD2——對照組OD450 nm值。

1.2.5 熒光定量PCR檢測mRNA表達 細胞接種到24孔板中，貼壁后加入不同濃度牡荊苷培養(yǎng)24 h。使用Trizol試劑提取法[24]提取細胞中總RNA，按照逆轉錄試劑盒操作得到所需cDNA，取2 μL進行擴增。引物序列：Nrf2，上游5'-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3'，下游5'-GGAATGTCTGCGCCAAAAGCTG-3'；白細胞介素-1β(IL-1β)，上游5'-GCATCCAGCTACGAATCTCC-3'，下游5'-GAACCAGCATCTTCCTCAGC-3'；細胞間黏附分子(ICAM)，上游5'-GGAAATACTGAAACTTGCTGCCTAT-3'，下游5'-ACACATGTCTATGGAGGGCCAC-3'；β-actin，上游5'-CCTGACTGACTACCTCATGAAG-3'，下游5'-GACGTAGCACAGCTTCTCCTTA-3'。配置好反應混合液，加入96孔反應板中，使用熒光定量PCR儀進行擴增。

1.2.6 藥物穩(wěn)定性的測定 用F-12K培養(yǎng)基或Hank's平衡鹽溶液(HBSS)稀釋牡荊苷標準品至60 μmol/L。放入37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0.0，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，12.0 h后取出，過0.22 μm的濾膜，利用超液相色譜檢測牡荊苷的含量。

液相條件：色譜柱型號為Zorbax Eclipse Plus C18(5 μm，3.0 mm×100 mm)；流動相0.1% 甲酸—乙腈(A)和0.1% 甲酸—水(B)。梯度洗脫條件為：0～2 min，20%～25% A；2～7 min，25%～30% A；7～8 min，30%～20% A。流速0.3 mL/min，色譜柱溫度25 ℃，參比波長280 nm，收集波長340 nm，進樣量10 μL。

以0 h培養(yǎng)基中牡荊苷的含量作為100%，將不同處理時間下牡荊苷的含量與0 h的含量對比分析，得到牡荊苷隨時間變化在培養(yǎng)基中殘留的百分率。

1.2.7 細胞吸收的測定 HUVEC細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，貼壁后加入不同濃度牡荊苷培養(yǎng)2 h。棄去細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌兩遍，加入1.5 mL PBS收集細胞至離心管中，取1/10測蛋白濃度，剩下的部分2 000 r/min離心5 min。棄上清，5%甲酸—甲醇復溶，冰水浴超聲處理5 min使細胞破碎，結束后放入-80 ℃冰箱過夜。第2天取出室溫溶解，渦旋2 min，2 000 r/min離心10 min，收集上清。再用1 mL 5%甲酸—甲醇重復提取兩次。上清液合并，氮吹后用250 μL甲醇復溶，過0.22 μm濾膜，用液相色譜-質譜聯用儀檢測分析細胞中牡荊苷的含量。

質譜條件：采用三重串聯四級桿質譜儀，裝備電噴霧離子源(ESI)，負離子+MRM模式定量分析。牡荊苷的定量條件為：母離子m/z431.1，子離子m/z311.1，裂解電壓160 V，碰撞能18 eV；進樣量5 μL[25]。

1.2.8 數據處理與分析 每個樣品指標測定3次，以均值±標準偏差(mean±SD)形式表示。以SPSS軟件中的單因素方差分析處理，Duncan比較進行顯著性分析，P<0.05(*)、P<0.01(**)、P<0.001(***)表示與未處理的對照組有顯著性差異。P<0.05(#)、P<0.01(##)、P<0.001(###)表示與1 ng/mL TNFα聯合100 ng/mL IL-17誘導的低水平炎癥組有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 三葉青中6種候選成分與Keap1蛋白的分子對接

分子對接是一種在分子層面預測配體和受體之間結合模式和親合力的一種理論模擬方法。試驗采用分子對接方法初步對比分析了三葉青根部和葉片中幾十種含量豐富的成分與Keap1蛋白的結合能力，篩選出了6種成分可與Keap1蛋白顯著結合，分別是山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、蘆丁、5-咖啡奎寧酸、牡荊苷和葒草苷。由圖1可知，這6種成分均結合在Keap1蛋白分子的活性空腔之中，并且主要的結合位點是纈氨酸殘基。該活性空腔恰恰是Keap1與Nrf2結合的區(qū)域，提示這6種成分與Keap1的結合很可能阻斷了Keap1與Nrf2的相互作用，進而使Nrf2解離活化。另外，白藜蘆醇具有良好的抗炎活性，通常作為陽性對照，圖1中顯示山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、蘆丁、5-咖啡奎寧酸、牡荊苷和葒草苷6種成分的對接能均小于白藜蘆醇的，證明與Keap1蛋白的結合能力均強于白藜蘆醇；其中最強的是山柰酚-3-O-蕓香糖苷，其次是牡荊苷。以上提示，三葉青中的這6種成分可能均具有良好的抗炎效果。

圖1 三葉青中6種候選成分與Keap1蛋白的分子對接

Figure 1 Molecular docking betweensix candidate ingredients inTetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg and Keap1 protein

2.2 三葉青中6種候選成分對血管內皮細胞炎癥的抑制作用

研究使用濃度為100 μmol/L或50 μmol/L的成分處理細胞，聯合低劑量TNFα與IL-17誘導低水平血管內皮細胞炎癥，采用Western blot法檢測山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、蘆丁、5-咖啡奎寧酸、牡荊苷和葒草苷6種成分對促炎因子和黏附分子表達的影響。如圖2所示，聯合低劑量TNFα與IL-17可升高各類炎癥相關因子的蛋白表達，6種成分可不同程度的下調炎癥因子表達量。當濃度為100 μmol/L時，異槲皮苷、蘆丁、葒草苷、牡荊苷對于ICAM的抑制作用更為顯著，而牡荊苷可更加顯著地抑制血管細胞黏附分子(VCAM)的表達。當濃度為50 μmol/L時，牡荊苷更明顯地下調了白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-8(IL-8)的蛋白表達。綜上所述，牡荊苷的抗炎效果最明顯。

2.3 牡荊苷對血管內皮細胞炎癥損傷的保護作用

CCK8試驗測定了牡荊苷對HUVEC細胞的毒性作用以及在血管內皮細胞中牡荊苷對低劑量TNFα與IL-17誘導低水平炎癥的緩解作用，結果見圖3。圖3(a)為牡荊苷對血管內皮細胞的毒性作用，與未處理的空白對照組細胞相比，牡荊苷濃度<80 μmol/L時，對細胞活性沒有影響，高于80 μmol/L后對細胞表現明顯的抑制生長作用。因此，選用20，40，60 μmol/L作為試驗組濃度。圖3(b)顯示，與對照組相比，聯合低劑量TNFα和IL-17降低細胞存活率，但以20，40，60 μmol/L牡荊苷對血管內皮細胞預孵2 h后，細胞存活率呈濃度依賴性的升高，證明牡荊苷對低劑量TNFα與IL-17誘導的低水平炎癥具有緩解作用。

圖2 三葉青中6種候選成分的抗炎活性

圖3 牡荊苷對HUVEC細胞炎癥損傷的保護作用

2.4 牡荊苷激活Nrf2信號通路

從Nrf2-Keap1復合物上解離的Nrf2能在細胞內富集并活化，為了在細胞水平進一步驗證分子對接結果，即牡荊苷與Keap1的結合可活化Nrf2，試驗檢測了牡荊苷處理細胞后Nrf2信號通路活性。圖4(a)～(c)顯示，20～60 μmol/L牡荊苷以濃度依賴方式顯著增加Nrf2的基因和蛋白表達水平，相反降低Keap1蛋白的表達水平，故而Nrf2/Keap1比值會逐漸升高[見圖4(d)]，表明Nrf2通路被激活。

2.5 牡荊苷抑制血管內皮細胞炎癥相關因子的基因表達

為檢測牡荊苷對HUVEC細胞中炎癥相關因子表達的影響，采用熒光定量PCR法檢測了20，40，60 μmol/L牡荊苷調節(jié)細胞炎癥相關因子表達的作用，結果見圖5。20，40，60 μmol/L牡荊苷均可下調促炎因子IL-1β和黏附分子ICAM的基因表達，隨著牡荊苷濃度的加大基因表達量下降，證明牡荊苷可緩解血管內皮細胞炎癥。因此，牡荊苷對血管內皮細胞中低劑量TNFα與IL-17誘導低水平炎癥有抑制作用。

圖4 牡荊苷激活Nrf2信號通路

圖5 牡荊苷抑制HUVEC細胞炎癥相關因子的基因表達

2.6 牡荊苷抑制血管內皮細胞炎癥相關因子的蛋白表達

采用Western blot方法研究了20，40，60 μmol/L牡荊苷對HUVEC細胞中炎癥相關因子蛋白表達的影響。細胞發(fā)生炎癥之后，引起炎癥相關因子的基因表達升高，由基因進一步翻譯成蛋白質，炎癥相關因子的蛋白表達如圖6所示。20，40，60 μmol/L牡荊苷可逐漸下調炎癥相關因子的蛋白表達，其中促炎因子IL-6表達水平與低水平炎癥組比有顯著性下降，IL-1β無顯著差異。證明牡荊苷可抑制促炎因子的蛋白表達，其結果與基因表達結果一致，更好地說明了牡荊苷具有良好的抗炎效果。Lu等[26]證明在C57BL/6小鼠中，牡荊苷抑制脂多糖引起的TNFα、IL-6以及IL-1β表達增加，發(fā)揮抗炎作用。

2.7 牡荊苷抑制血管內皮細胞NF-κB信號通路的活性

核因子-κB(NF-κB)調控著細胞的炎癥水平，抑制NF-κB信號通路可以阻止產生過多的炎癥介質。利用Western blot法檢測了牡荊苷對NF-κB p65蛋白磷酸化的影響，結果如圖7所示。20，40，60 μmol/L牡荊苷可以逐漸降低磷酸化p65蛋白水平，呈劑量依賴關系。證明了牡荊苷可以抑制NF-κB信號通路的活性，從而進一步降低促炎因子的基因和蛋白表達。

圖6 牡荊苷抑制HUVEC細胞炎癥相關因子的蛋白表達

圖7 牡荊苷對NF-κB p65蛋白磷酸化的影響

2.8 牡荊苷在細胞培養(yǎng)基及緩沖鹽溶液中的穩(wěn)定性

藥物的作用與其在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性有緊密聯系，經不同時間處理后，牡荊苷在HBSS及F-12K培養(yǎng)基中殘留的液相圖及計算結果見圖8。結果表明，牡荊苷在F-12K細胞培養(yǎng)基及HBSS緩沖液中均表現為很強的穩(wěn)定性，尤其是12 h后在F-12K細胞培養(yǎng)基中的保留率達80%以上。牡荊苷的強穩(wěn)定性源于自身結構中存在8號位點糖基化[27]，而在培養(yǎng)基中穩(wěn)定性更高可能是由于細胞培養(yǎng)基中含有血清蛋白。Tang等[28]報道，多酚化合物可以與蛋白質相互作用，使得多酚的穩(wěn)定性增強。

2.9 牡荊苷在血管內皮細胞中的攝取

研究[27]表明，藥物的抗炎效果與其細胞內的吸收有關。試驗利用了液相三重串聯四極桿液相質譜聯用系統(HPLC-QqQ-MS)檢測了20，40，60 μmol/L牡荊苷在血管內皮細胞內的含量。由圖9可知，血管內皮細胞可以原型形式攝取牡荊苷，且隨著牡荊苷的濃度增加，血管內皮細胞對牡荊苷的攝取程度加大，在細胞內的牡荊苷含量增多。特別是以60 μmol/L牡荊苷刺激細胞之后，牡荊苷在細胞內的含量達到了(3.03±0.79) pmol/mg·蛋白。說明吸收的牡荊苷含量增多，所以逐漸下調了各類炎癥相關因子的表達，增加了抗炎效果。

圖8 牡荊苷在細胞培養(yǎng)基及緩沖鹽溶液中的穩(wěn)定性

圖9 牡荊苷在HUVEC細胞中的含量

3 結論

三葉青中山柰酚-3-O-蕓香糖苷等6種候選成分均具有抗炎活性，其中活性最強的是牡荊苷。牡荊苷主要富含于山楂、牡荊草等植物中，且在三葉青中含量也達到了(8.28±2.03) mg/g干物質[17]。目前牡荊苷主要用于治療心血管疾病，并且還能發(fā)揮明顯的防癌抗腫瘤作用[29]。研究通過血管內皮細胞試驗證實了牡荊苷的抗炎效果，這也許解釋了其為何能降低心血管疾病風險。

Nrf2是在抗炎反應中發(fā)現的新機制，其活化機理主要包括兩個方面：① 親電子化合物以共價鍵的方式與Keap1蛋白的半胱氨酸殘基結合，使Keap1蛋白發(fā)生構象改變，結構變得松散，促進Nrf2從Nrf2-Keap1復合物上解離[22]。Mills等[20]報道衣康酸通過烷化Keap1蛋白上的半胱氨酸殘基使得Nrf2解離活化。② 小分子化合物以非共價鍵的方式與Keap1蛋白結合，通過占據Nrf2與Keap1蛋白結合的活性空腔使Nrf2解離活化[22]。研究篩選出的牡荊苷等小分子植物化學物正是結合在Keap1蛋白的活性空腔中，促使Nrf2活化。

牡荊苷能夠激活轉錄因子Nrf2，抑制血管內皮細胞低水平炎癥，有望成為防治慢性炎癥乃至慢性疾病的新契機。試驗還有待進一步完善與探索。