李 超，宋 偉，彭 冰，雷 章，盧宏達(dá)，孔慶志△

1.湖北省荊門(mén)市第二人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(荊門(mén)448000);2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院腫瘤科(武漢430061)

放射治療是胸部惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、食管癌等的重要治療手段之一，放射性肺炎是其治療的常見(jiàn)并發(fā)癥，發(fā)病率為13%～37%，嚴(yán)重影響腫瘤患者的療效及生活質(zhì)量[1]。近年來(lái)，“TLR4/NF-κB”信號(hào)通路已被證實(shí)和抗炎免疫機(jī)制關(guān)系密切。TLRs(Toll-like receptor,TLR)屬于病原相關(guān)分子模式，目前研究較多的是該家族的TLR4,外源性刺激作為危險(xiǎn)信號(hào)被TLRs所識(shí)別，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，從而啟動(dòng)與炎癥免疫相關(guān)的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-4等基因的表達(dá)，產(chǎn)生瀑布效應(yīng)，也就是所謂的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)[2]。前期研究顯示，養(yǎng)陰清熱化瘀方治療放射性肺炎取得了較好地臨床療效和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且對(duì)患者血漿炎癥細(xì)胞因子有一定影響[3]。本研究旨在干預(yù)放射性肺炎的模型大鼠的過(guò)程中，以TLR4、NF-κB為切入點(diǎn)，觀察大鼠肺組織TLR4、NF-κB p65的含量及mRNA活性，探討?zhàn)B陰清熱化瘀方防治放射性肺炎的作用機(jī)制。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：PF級(jí)Wistar大鼠48只，雌、雄各24只，均購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，體重(180±20)g，8周齡，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(鄂)2015-0018，于湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。室溫20 ℃～22 ℃，濕度40%～70%，明暗各12 h。

1.2 藥 品：養(yǎng)陰清熱化瘀方(YHF)：以《醫(yī)門(mén)法律》清燥救肺湯為基本方，加減而成，藥物組成：桑葉10 g，太子參、麥冬、黃芪、連翹、北沙參各15 g、當(dāng)歸20 g等。各藥物均經(jīng)過(guò)生藥鑒定，水煎煮2次，過(guò)濾，濃縮成0.97生藥/ml藥液。

1.3 主要儀器和試劑：PRECISE直線加速器(瑞典ELEKA公司)、TB-718D石蠟包埋機(jī)(湖北泰維科技公司)、RM2235石蠟切片機(jī)(徠卡公司)、Western blotting電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra Cell4-gel handcasting system)、S IX51光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、酶標(biāo)儀(Diatek公司，DR-200Bs)、實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，TLR4、NF-κB抗體均由CST公司提供，TLR4、NF-κB引物均由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成并純化。

1.4 PCR引物：大鼠β-actin、TLR4、NF-κB p65引物經(jīng)Pubmed核酸數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST檢索為基因特異性引物。β-actin：上游5’- CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3’，下游：5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3’；TLR4引物：上游5’-AACATCAGAGGAAGAACAAGAAG-3’，下游：5’-AGGTCGTTGAGGTTAGAAGC-3’；NF-κB p65引物：上游5’-GAAGAAGCGAGACCTGGAG-3’，下游：5’- ATCCGGAACACAATGGCCAC-3’。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造 模：48只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(NC)、模型組(MD)、養(yǎng)陰清熱化瘀方提前干預(yù)組(YHF-EI)及養(yǎng)陰清熱化瘀方組(YHF-ST)四組，每組12只。除NC組外，其他各組大鼠于照射前用10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后呈仰臥位，固定在自制的木板上，調(diào)整照射野(上：前肢腋窩中點(diǎn)連線，下：胸骨劍突水平)，照射野約2.7 cm×4.2 cm，勾畫(huà)出射野范圍，單次20 Gy照射右側(cè)肺野。照射過(guò)程中大鼠無(wú)死亡，大鼠自然蘇醒后于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心常規(guī)飼養(yǎng)。

2.2 給 藥：除養(yǎng)陰清熱化瘀方提前干預(yù)組(YHF-EI)提前1周給藥外，其余各組于照射后第1天開(kāi)始灌胃給藥，1次/d，7次/周，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)體重變化調(diào)整用藥劑量，按照1 ml/100 g給藥。中藥組灌胃9.7 g/(kg·d)生藥藥液；空白對(duì)照組和模型組均于等量生理鹽水。于照射后4周，將各組大鼠以10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠后，固定于木板上，腹主動(dòng)脈取血，肝素鈉抗凝管取血2 ml，摘取右肺中葉，稱(chēng)重后置于凍存管，液氮保存。

3 檢測(cè)指標(biāo)

3.1 肺組織病理學(xué)：在照射后4周，肺組織進(jìn)行常規(guī)脫水-浸蠟-包埋-切片-HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，具體步驟如下：向各孔加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)品、樣品(各兩重復(fù))于每孔中央，蓋上密封條，室溫下孵育過(guò)夜。取出板架，棄去各孔液體，洗板3次，加入酶標(biāo)抗體，室溫下孵育30 min，加入顯色液后，于405 nm酶標(biāo)儀讀取吸光度，自動(dòng)計(jì)算出TNF-α、IL-6、TGF-β的濃度。

3.3 Western-blotting方法：取肺組織樣本的總蛋白，BCA法蛋白濃度測(cè)定蛋白濃度，取0.03 mg蛋白，于8%～12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，將分離后的蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成之后放入封閉液內(nèi)，在室溫環(huán)境下封閉1 h，洗膜后加入相應(yīng)的一抗，4 ℃下孵育過(guò)夜，再洗膜過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，采用ECL法進(jìn)行顯色，然后采用凝膠凸顯分析系統(tǒng)拍照，并使用Alpha Ease FC軟件分析蛋白表達(dá)量的差異。

3.4 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：總RNA的提取按照試劑盒說(shuō)明操作，在滅活RNA酶環(huán)境下將Wistar大鼠約20 mg肺組織粉碎，用Trizol提取，檢測(cè)其完整性及純度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取樣品溶液5 μl，Master Mix 25 μl，上下游引物各1 μl，蒸餾水18 μl(反應(yīng)總體積50 μl)。經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸后進(jìn)行熒光檢測(cè)，采用2-△△CT法計(jì)算各個(gè)基因相對(duì)內(nèi)參的表達(dá)量。

結(jié) 果

1 大鼠一般狀況 空白對(duì)照組大鼠活動(dòng)反應(yīng)、皮膚色澤及食量均正常，且體重增加；模型組從照射第1周開(kāi)始出現(xiàn)食量減少、皮毛倒翻、精神萎靡、活動(dòng)減少、反應(yīng)漸漸遲鈍及背毛漸漸枯槁無(wú)光澤；養(yǎng)陰清熱化瘀方組及提前干預(yù)組精神、食量、活動(dòng)度、毛發(fā)光澤度均明顯好于模型組，模型組有1例大鼠死亡。

2 各組肺組織病理學(xué)改變 空白對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰、肺泡壁薄、毛細(xì)血管完整，且無(wú)充血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肺組織可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞及萎縮，可見(jiàn)肺泡間隔增寬，并出現(xiàn)少許梭形成纖維細(xì)胞。養(yǎng)陰清熱化瘀方提前干預(yù)組及養(yǎng)陰清熱化瘀方組大鼠肺組織可見(jiàn)毛細(xì)血管充血，間質(zhì)輕度水腫及增厚，少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，但均較模型組減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織病理圖片(HE染色，×200)

3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清中的TNF-α、IL-6、TGF-β含量 模型組TNF-α、IL-6、TGF-β含量較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；養(yǎng)陰清熱化瘀方組干預(yù)治療后，兩組的TNF-α、IL-6、TGF-β含量均較模型組下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但養(yǎng)陰清熱化瘀方提前干預(yù)組(YHF-EI)與養(yǎng)陰清熱化瘀方組(YHF-ST)TNF-α、IL-6、TGF-β含量含量比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清的TNF-α、IL-6、TGF-β含量比較

注：與NC組比較，★P<0.05;與MD組對(duì)比，*P<0.05

4 大鼠NF-κB p65和TLR4蛋白表達(dá)水平 模型組NF-κB p65和TLR4蛋白含量較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；養(yǎng)陰清熱化瘀方同步干預(yù)治療后，兩組的NF-κB p65和TLR4蛋白含量均下降，與模型組對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但養(yǎng)陰清熱化瘀方提前干預(yù)組與養(yǎng)陰清熱化瘀方組NF-κB p65和TLR4的含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 各組肺組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)情況

5 大鼠肺組織NF-κB p65、TLR4 mRNA的表達(dá)水平 與空白對(duì)照組比較，模型組TLR4 mRNA、NF-κB p65表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；同模型組比較，養(yǎng)陰清熱化瘀方干預(yù)后，兩組NF-κB p65、TLR4 mRNA均不同程度下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但養(yǎng)陰清熱化瘀方提前干預(yù)組與養(yǎng)陰清熱化瘀方組NF-kB p65、TLR4 mRNA的表達(dá)水平比較，未見(jiàn)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 大鼠肺組織血清中NF-κB p65、TLR4 mRNA表達(dá)變化(ng/ml)

注：與NC組比較，★P<0.05;與MD組對(duì)比，*P<0.05

討 論

放射性肺炎是胸部惡性腫瘤放射治療最為常見(jiàn)的不良反應(yīng)。其病理機(jī)制為放射線損傷肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管通透性改變和肺泡換氣功能損傷，形成細(xì)胞因子瀑布效應(yīng)，釋放。TNF-α、IL-6、TGF-β在放射性肺炎的發(fā)生和維持過(guò)程中占有非常重要的地位，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可早期預(yù)測(cè)放射性肺炎的發(fā)生[4-5]。研究[3]已證實(shí)養(yǎng)陰清熱化瘀方能夠降低胸部惡性腫瘤放療患者血漿中TNF-α、IL-6、TGF-β的表達(dá)水平，降低放射性肺炎發(fā)生率。研究表明急性放射性肺損傷大鼠肺組織TNF-α、IL-6、TGF-β表達(dá)水平顯著升高，沉默或下調(diào)TNF-α、IL-6、TGF-β表達(dá)可以減輕放射性肺損傷的發(fā)生，且可以逆轉(zhuǎn)照射引起的肺纖維化[6-8]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、TGF-β表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組，提示射線會(huì)引起炎癥的炎癥反應(yīng)綜合征；養(yǎng)陰清熱化瘀方組血清中TNF-α、IL-6、TGF-β顯著低于模型組，但養(yǎng)陰清熱化瘀方提前干預(yù)組未優(yōu)于養(yǎng)陰清熱化瘀方，提示養(yǎng)陰清熱化瘀方能減弱急性放射性肺損傷的炎癥反應(yīng)。

TLR樣受體4(TLR4)是Toll樣受體超家族的一員，能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，研究證實(shí)干擾TLR4相關(guān)信號(hào)通路可能促進(jìn)DNA的修復(fù)，調(diào)節(jié)輻射誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[9]。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB通路是與抗炎免疫機(jī)制密切相關(guān)的信號(hào)通路，TNF-α、IL-6、IL-10是由TLR4/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控的。NF-κB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，位于TLR4下游信號(hào)的樞紐位置，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)TLR4被激活后，與其配體結(jié)合，能夠通過(guò)髓系分化蛋白MyD88依賴(lài)性途徑激活NF-κB，IκB被IκB激酶(IKKα/β等)磷酸化、泛素化，二聚體解離后 NF-κB p50/p65進(jìn)入細(xì)胞核，其中p65能被檢測(cè)，因此，NF-κB p65作為NF-κB 活性標(biāo)志，啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而合成和釋放多種炎癥蛋白基因的表達(dá)。研究證實(shí)在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)主要受TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活釋放[10]。已有文獻(xiàn)顯示以NF-κB激活依賴(lài)TLR4信號(hào)途徑為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB作為非小細(xì)胞肺癌RP臨床血清樣標(biāo)志物，可以預(yù)測(cè)RP發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11-12]。

研究發(fā)現(xiàn)清燥救肺湯能抑制肺癌細(xì)胞增殖，與降低NF-κB表達(dá)有關(guān)[13]，清燥救肺湯可通過(guò)調(diào)控TLR2/NF-κB信號(hào)通路抗肺炎的發(fā)生。養(yǎng)陰清熱、潤(rùn)肺止咳驗(yàn)方主要通過(guò)下調(diào)TLR4上、下游信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，降低炎癥因子的表達(dá),從而延緩甚至阻斷放射性肺炎的發(fā)生發(fā)展[14]。有研究證實(shí)化瘀類(lèi)方劑可減少肝纖維化肝組織中TLR4、MyD88及NF-κB基因的表達(dá)[15]，也可下調(diào)肺組織輻射損傷過(guò)程中NF-κB的表達(dá)。養(yǎng)陰清熱化瘀方源自喻嘉言的《醫(yī)門(mén)法律》清燥救肺方，結(jié)合急性放射性肺損傷病機(jī)加減而成，具有益氣養(yǎng)陰清熱活血之功。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致，模型組NF-κB p65和TLR4蛋白含量及mRNA水平較空白對(duì)照組顯著升高，給藥組肺組織中NF-κB p65和TLR4含量較模型組明顯下降，TLR4和NF-κB p65mRNA活性也被顯著抑制，與大鼠一般情況、病理形態(tài)血變化具有一致性，提示該方可能通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)抵抗放射性肺炎的發(fā)生。

綜上所述，養(yǎng)陰清熱化瘀方能夠減輕放射性肺炎大鼠炎癥損傷，推測(cè)這一作用是通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路，從而抑制TNF-α、IL-6、TGF-β的產(chǎn)生，為放射性肺炎的治療提供了新的思路。但本研究中提前1周給藥，未顯示更優(yōu)地防治效果，考慮與樣本量及干預(yù)時(shí)間有關(guān)。