臧穎超，朱慧敏，范夏瓊，張志敏，盧紅梅

(中南大學(xué) 化學(xué)化學(xué)工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410083)

法莫替丁(FMD)是第三代H2受體拮抗劑，對(duì)胃酸分泌有明顯的抑制作用，臨床上主要用于治療十二指腸潰瘍和上消化道出血[1]。目前，法莫替丁的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[2-4]、氣相色譜法[5]、伏安法[6]和分光光度法[7]等，其中，色譜法需昂貴的儀器設(shè)備，且前處理復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的快速檢測(cè)；而伏安法和分光光度法雖然前處理簡(jiǎn)單，但其抗干擾能力較低。因此，有必要開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、快速、靈敏的法莫替丁檢測(cè)方法。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)因具有無(wú)損、快速、高靈敏度和高選擇性等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于藥物[8]、生物[9]、環(huán)境[10]和食品[11]等領(lǐng)域，其基底是影響SERS信號(hào)增強(qiáng)效果的一個(gè)重要因素。銀納米粒子(AgNPs)和金納米粒子(AuNPs)是常用的SERS基底。AgNPs具有較好的SERS活性，但不穩(wěn)定，易在空氣中被氧化。AuNPs雖具有良好的穩(wěn)定性，但增強(qiáng)效果比AgNPs弱。因此，探究同時(shí)具有高SERS活性和較好穩(wěn)定性的納米材料非常必要。由于金和銀具有晶格相匹配的特性，以金-銀核殼納米材料作為SERS的基底近年來(lái)受到關(guān)注[12]。與單獨(dú)的AuNPs或AgNPs相比，核殼Au@Ag納米粒子(Au@AgNPs)既保持了AgNPs良好的SERS活性，又具有AuNPs的穩(wěn)定性和均勻的形貌[13]。本文通過(guò)種子生長(zhǎng)的方法合成Au@AgNPs，并將其作為表面增強(qiáng)拉曼光譜的基底用于檢測(cè)法莫替丁，為藥物檢測(cè)提供了快速、簡(jiǎn)便的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-1800紫外可見(jiàn)吸收光譜儀(島津公司)；S-4800場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡(SEM)(日立公司)；透射JEM-1400 Plus電子顯微鏡(JEOL公司)；Empyrean銳影X射線衍射儀(帕納科公司)；i-Raman便攜式拉曼儀器(B & W Tek公司)；原子型1810a摩爾超純水機(jī)(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)。

硝酸銀、氯金酸、檸檬酸三鈉和法莫替丁購(gòu)自中國(guó)上海Sigma-Aldrich公司；抗壞血酸和羅丹明6G(R6G)購(gòu)自上海泰坦科技有限公司；所用化學(xué)試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水(18.2 MΩ·cm)。

圖1 Au@AgNPs的合成及對(duì)法莫替丁的檢測(cè)Fig.1 Synthesis of Au@AgNPs and its detection for famotidine

1.2 Au@AgNPs的制備

通過(guò)種子介導(dǎo)的方法合成了Au@AgNPs[14]。AuNPs種子的合成：將125 μL(0.1 mol/L)的HAuCl4稀釋至50 mL水中，加熱至沸騰，攪拌并快速加入750 μL(1%)檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌30 min，獲得金種子溶液。Au@AgNPs的制備：取3 mL AuNPs作為種子溶液，加入450 μL抗壞血酸溶液(0.1 mol/L)，邊攪拌邊逐滴加入1.35 mL AgNO3溶液(10 mmol/L)。在此過(guò)程中，可觀察到溶液的顏色由酒紅色變?yōu)槌壬?，表明金核的外層已成功地生長(zhǎng)了一層銀。Au@AgNPs的合成及對(duì)法莫替丁的檢測(cè)見(jiàn)圖1。

1.3 樣品制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液：取一定量法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)品用水配成濃度為1×10-2mol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再逐級(jí)稀釋為1×10-7～1×10-4mol/L系列濃度的法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

血漿樣品：先用水稀釋血漿以減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾，然后向稀釋后的血漿中加入不同濃度的法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成不同濃度的法莫替丁(0.45～250 μmol/L)血漿樣本。

1.4 光譜檢測(cè)

將100 μL法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液與100 μL的Au@AgNPs溶液混合，取一定量混合液滴于硅膠板上，調(diào)節(jié)合適的激光和待測(cè)樣表面距離以得到理想的光譜。光譜采集參數(shù)：激光波長(zhǎng)785 nm，積分時(shí)間為30 s，物鏡倍數(shù)20倍，光譜采集范圍為200～4 000 cm-1。

圖2 金種子(紅線)和金核銀殼納米粒子(黑色)的紫外可見(jiàn)吸收光譜Fig.2 UV-Vis spectra of Au seeds(red line) and core-shell Au@Ag nanoparticles(black line)

2 結(jié)果與討論

2.1 基底的表征

由AuNPs和Au@AgNPs的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖可見(jiàn)，AuNPs在525 nm處具有很強(qiáng)的吸收峰(圖2)。當(dāng)Ag在Au核上形成Ag殼，得到Au@AgNPs后，金核的吸收峰藍(lán)移至480 nm，并在390 nm處出現(xiàn)了一個(gè)銀殼的吸收峰。這是由于Ag和Au具有不同的等離子體共振頻率，兩者間發(fā)生了重疊和耦合。

采用SEM和TEM對(duì)合成的Au種子和Au@AgNPs的形貌進(jìn)行了分析(圖3)，由圖3(A，B，D，E)可見(jiàn)，AuNPs和Au@AgNPs主要是以球形均勻分布。通過(guò)粒徑軟件分析表明Au種子的平均粒徑為27.94 nm(圖3C)，金核表面沉積的銀殼平均厚度為8.08 nm(圖3F)。

AuNPs和Au@AgNPs的XRD譜圖見(jiàn)圖4A，圖中38.2°、44.3°、64.5°、77.5°和82.5°分別對(duì)應(yīng)于面心立方的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)[15]。由于金和銀的晶格常數(shù)相似[16]，因此峰的位置相同，很難通過(guò)衍射峰的位置比較AuNPs和Au@AgNPs，但可看出Au@AgNPs的峰更強(qiáng)。經(jīng)高分辨率TEM分析可得Au@AgNPs的兩個(gè)相鄰晶格的晶面間距為0.234 nm(圖4C)，接近Ag的(111)平面晶格，且Ag納米晶體主要沿(111)方向生長(zhǎng)[15]。

圖3 AuNPs(A、B、C)和Au@AgNPs(D、E、F)的掃描電鏡、透射電鏡、粒徑統(tǒng)計(jì)Fig.3 SEM,TEM and statistical histogram of particle size of AuNPs(A,B,C) and Au@AgNPs(D,E,F)

圖4 AuNPs和Au@AgNPs的XRD及TEM圖Fig.4 XRD and TEM of AuNPs and Au@AgNPsA:XRD of AuNPs and Au@AgNPs;B:TEM diffraction spot of Au@AgNPs;C:high-resolution TEM image taken from the Ag shell area of core-shell Au@AgNPs

圖5 Au@AgNPs(A)和法莫替丁粉末(B)的拉曼光譜及法莫替丁吸附在Au@AgNPs上的SERS光譜(C)Fig.5 Raman spectra of core-shell Au@AgNPs(A) and FMD powder(B),SERS spectrum of FMD adsorbed on the Au@AgNPs substrate(C)

2.2 法莫替丁的拉曼分析

法莫替丁、Au@AgNPs的拉曼光譜以及SRES光譜如圖5所示，其特征峰的歸屬見(jiàn)表1。從圖中可見(jiàn)，法莫替丁的拉曼特征峰主要位于547、685、739、972、1 009、1 122、1 241、1 333、1 435、1 540 cm-1處，與已有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[17]。但由于分子和基底之間的取向和作用力的不同，可看到一些峰發(fā)生紅移或藍(lán)移[18]。法莫替丁的主要特征峰歸屬于CN的平面彎曲振動(dòng)(549 cm-1)、CH2的扭轉(zhuǎn)振動(dòng)(1 134 cm-1)、CS的拉伸振動(dòng)和平面振動(dòng)(1 325 cm-1)、CN的拉伸振動(dòng)和NH2的形變振動(dòng)(1 540 cm-1)。法莫替丁分子與Ag殼通過(guò)Ag-N鍵之間的相互作用吸附在Ag殼的表面。在入射光激發(fā)下，Au@AgNPs表現(xiàn)出強(qiáng)烈的表面等離子體共振特性，具有很強(qiáng)的局域電場(chǎng)，使得處于該電場(chǎng)中的法莫替丁分子的信號(hào)被增強(qiáng)。與常規(guī)的拉曼光譜相比，SERS光譜中1 540 cm-1處的峰信號(hào)增強(qiáng)顯著，且受到的干擾小，因此選其為特征峰用于后續(xù)分析。

2.3 Au@AgNPs的增強(qiáng)因子

增強(qiáng)因子(EF)是評(píng)價(jià)基底的SERS性能的重要因素之一，為了測(cè)試Au@AgNPs作為基底的增強(qiáng)性能，以R6G為探針?lè)肿?，根?jù)公式[18]計(jì)算增強(qiáng)因子：EF=(ISERS×CRaman)/(IRaman×CSERS)，式中IRaman和ISERS分別為1 363 cm-1處增強(qiáng)前、后的拉曼強(qiáng)度，CRaman和CSERS為增強(qiáng)前、后R6G的濃度，計(jì)算得EF為6.66×105，由此可見(jiàn)，Au@AgNPs有較高的EF值，具有檢測(cè)較低濃度法莫替丁的潛力。

表1 法莫替丁的拉曼光譜和SERS光譜中主要特征峰的歸屬Table 1 Band assignment of major peaks in the normal Raman spectrum and SERS spectrum of FMD

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圖6 不同濃度法莫替丁的SERS光譜Fig.6 SERS spectra of FMD with different concentrations

2.4 法莫替丁的定量檢測(cè)

以Au@AgNPs為基底，檢測(cè)了不同濃度(0、0.4、0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50、100 μmol/L)的法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，由其SERS光譜圖可知，隨著法莫替丁濃度的降低，1 540 cm-1處特征峰的強(qiáng)度也隨之降低(圖6)，當(dāng)濃度低至0.4 μmol/L時(shí)，仍可看到明顯的特征峰。由于法莫替丁中不同的官能團(tuán)在基底表面的吸附和取向不同，隨著法莫替丁濃度的降低，不同特征峰的強(qiáng)弱變化不同。法莫替丁濃度的對(duì)數(shù)(x)在0.5～50 μmol/L范圍內(nèi)和1 540 cm-1處峰強(qiáng)度的對(duì)數(shù)(y)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=4.720 5x+0.249 1，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.978，以公式LOD=3Sb/b[19]計(jì)算檢出限(LOD)，其中Sb為特征峰1 540 cm-1處空白樣SERS強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為建立的校準(zhǔn)曲線的斜率，計(jì)算得到LOD為4.18×10-8mol/L。

2.5 血漿中法莫替丁的檢測(cè)

為評(píng)估本方法在實(shí)際樣本中的可行性，將法莫替丁溶液加入稀釋的血漿樣品中，然后與Au@AgNPs混合，考察了稀釋血漿中不同濃度(0、0.45、2.5、4.5、25、45、250 μmol/L)法莫替丁的SERS光譜。結(jié)果顯示，空白血漿光譜中無(wú)組分干擾法莫替丁的識(shí)別，稀釋血漿中法莫替丁的SERS光譜強(qiáng)度(1 540 cm-1)隨其濃度的降低逐漸減弱，峰強(qiáng)度的對(duì)數(shù)(y)與對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)數(shù)(x)在0.45～250 μmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=4.331 8x+0.218 8，r2=0.975，計(jì)算得LOD(3Sb/b)為1.11×10-7mol/L。由此可見(jiàn)，制備的Au@AgNPs可用于血漿中法莫替丁的快速檢測(cè)。

2.6 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

向血漿中加入一定量法莫替丁考察方法的準(zhǔn)確性，加標(biāo)濃度為2.5、25、250 μmol/L，每個(gè)濃度平行實(shí)驗(yàn)3次，在優(yōu)化條件下測(cè)定。計(jì)算得3個(gè)加標(biāo)濃度下法莫替丁的回收率為91.6%～122%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.6%～12%，方法準(zhǔn)確可靠，可滿足血漿中法莫替丁的測(cè)定要求。

2.7 Au@AgNPs重現(xiàn)性及選擇性

SERS信號(hào)的重現(xiàn)性是評(píng)價(jià)基底性能和SERS方法實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)因素，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)檢測(cè)了12批次法莫替丁，計(jì)算得其在1 540 cm-1處強(qiáng)度的RSD為9.5%，表明Au@AgNPs作為SERS基底檢測(cè)法莫替丁具有良好的重現(xiàn)性[15]，可用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本文建立了以Au@AgNPs為SERS基底的快速靈敏檢測(cè)法莫替丁的方法。結(jié)果表明，以Au@AgNPs檢測(cè)法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，方法在0.5～50 μmol/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，r2為0.978，LOD為4.18×10-8mol/L。使用Au@AgNPs對(duì)稀釋血漿中的法莫替丁進(jìn)行SERS檢測(cè)，線性范圍為0.45～250 μmol/L，r2為 0.975,LOD為1.11×10-7mol/L,加標(biāo)回收率為91.6%～122%。所建立的方法可用于生物樣品中法莫替丁的快速靈敏檢測(cè)。