曾 靜，曲 栗,2，古淑青*，鄧曉軍，伊雄海，張 晶，丁 濤，柳 菡

(1.上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135；2.復(fù)旦大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200433；3.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京 100013；4.南京海關(guān)動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210001)

雙酚類化合物(BPs)主要有雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)、雙酚S(BPS)、雙酚A-二縮水甘油醚(BADGE)及其衍生物、雙酚F-二縮水甘油醚(BFDGE)及其衍生物等。由于在生產(chǎn)和生活中的廣泛使用，BPs已成為一種環(huán)境污染物，在空氣、水、土壤和食品中均有檢出[1-4]。雙酚類化合物通過環(huán)境、包裝材料及包裝器皿等遷移到食品和中藥材等產(chǎn)品中，許多國家通過法律法規(guī)控制或禁止使用這類物質(zhì)[5]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定在食品或食品模擬物中雙酚S的遷移量不能超過0.05 mg/kg[6-7]；歐盟法規(guī)(EC/1895/2005號指令)規(guī)定，自2006年1月1日起在食品接觸材料中禁止使用BFDGE，并規(guī)定BADGE、雙酚A-(2,3-二羥丙基甘油醚)(BADGE-H2O)、雙酚A-雙(2,3-二羥丙基甘油醚)(BADGE-2H2O)在食品或食品模擬物中的遷移總量不超過9 mg/kg，單一各類在食品或食品模擬物中的遷移量不超過1 mg/kg[8]。近年來，雙酚類化合物的測定一直是研究熱點。

目前，關(guān)于雙酚類化合物的研究主要集中于水、土壤、玩具、食品包裝材料、罐頭食品、嬰兒食品中BPA、BPF和BPS的測定[9-12]。食品中雙酚類化合物的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜-紫外可見光譜法(HPLC-UV)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等，但GC-MS法操作繁瑣且耗時長，HPLC-UV法的靈敏度較低。LC-MS/MS法分析時間短且具有較高的靈敏度，被廣泛用于食品及食品包裝材料中雙酚類化合物的定性及定量測定[13-14]。雙酚類化合物的萃取方法主要有液-液萃取、固相萃取、超聲輔助萃取等，但上述方法耗時長，且目標(biāo)物易損失[15-19]。加速溶劑萃取(ASE)是近年發(fā)展起來的一種萃取技術(shù)，在較高壓力和溫度下，利用一定配比的有機溶劑作為萃取液對樣品進(jìn)行萃取，具有自動化程度高、溶劑用量少、耗時短的特點[20-21]。QuEChERS法由于操作簡單，被廣泛用于農(nóng)、獸藥殘留分析[22]，近年來也被用于雙酚類化合物的測定[23]。

藥食同源性食品既可作為藥物，又可用作食品原料，具有較大的商業(yè)價值，但在生產(chǎn)、加工和運輸過程中，雙酚類化合物可能會經(jīng)包裝材料遷移其中。目前，藥食同源性食品的研究主要集中于有效成分分析[24-26]。由于藥食同源性食品基質(zhì)中含有黃酮、氨基酸等化合物，用傳統(tǒng)的QuEChERS法提取藥食同源性食品中的雙酚類化合物回收率較低，而將ASE和QuEChERS聯(lián)用能大大提高前處理效率和回收率。本實驗將ASE與QuEChERS法結(jié)合，對藥食同源性食品山銀花、葛根、沙棘中的雙酚類化合物進(jìn)行提取和凈化,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本方法操作簡單、快速，靈敏度高，滿足藥食同源性食品中雙酚類化合物的同時快速檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Nexera X2液相色譜(日本Shimadzu公司)，QTRAP 6500三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；Vortex2渦旋混合器(德國IKA公司)；ASE-350加速溶劑萃取儀(美國ThermoFisher公司)；Milli-Q超純水一體機(美國Millipore公司)；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation 公司)；Allegia X-22R高速冷凍離心機(Beckman公司)；0.22 μm有機相濾膜(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)(純度>95.0%，日本TCI公司)；雙酚A-二縮水甘油醚(BADGE)、雙酚A-(2,3-二羥丙基甘油醚)(BADGE-H2O)、雙酚A-雙(2,3-二羥丙基甘油醚)(BADGE-2H2O)、雙酚A-(3-氯-2-羥丙基甘油醚)(BADGE-HCl)、雙酚A-雙(3-氯-2-羥丙基甘油醚)(BADGE-2HCl)、雙酚A-(3-氯-2-羥丙基)(2,3-二羥丙基)醚(BADGE-H2O-HCl)、雙酚F-雙(3-氯-2-羥丙基甘油醚)(BFDGE-2H2O)(純度>98%，瑞士Fluka公司)；雙酚F-二縮水甘油醚(BFDGE)(純度>95%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；雙酚S(BPS)(純度>99%，美國Admas公司)；雙酚A內(nèi)標(biāo)(BPA-D16)、雙酚S內(nèi)標(biāo)(BPS-13C12內(nèi)標(biāo))(純度>96%，上海市化工研究院)。

甲酸(色譜純，美國Fluka公司)；乙腈、甲醇(色譜純，美國Merck公司)；乙酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；山銀花、葛根、沙棘樣品購于各大型超市及藥店。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別準(zhǔn)確稱取待測11種BPs的標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，分別得到質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃下保存。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液50 μL，用甲醇定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度為5.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃下保存。

1.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液分別準(zhǔn)確吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL，用甲醇定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度為50.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于4 ℃下保存。

1.2.4 內(nèi)標(biāo)工作液用甲醇分別將BPA-D16和BPS-13C12配成質(zhì)量濃度為100 μg/L的同位素內(nèi)標(biāo)工作液，于4 ℃下保存。

1.2.5 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液分別準(zhǔn)確吸取50.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1.0 mL，100 μg/L的內(nèi)標(biāo)工作液0.4 mL，用空白基質(zhì)配成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中BPA-D16和BPS-13C12內(nèi)標(biāo)溶液的質(zhì)量濃度為40.0 μg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提 取準(zhǔn)確稱取5 g(精確至0.01 g)經(jīng)粉碎過篩后的樣品，分別加入400 μL 100 μg/L的內(nèi)標(biāo)工作液BPA-D16和BPS-13C12，加入1 g氯化鈉和適量硅藻土混勻后，裝入34 mL不銹鋼樣品萃取池中，以乙腈-乙酸-水(89∶1∶10，體積比)為溶劑進(jìn)行萃取。ASE條件：萃取溫度為80 ℃，萃取壓力為10.3 MPa，加熱時間為5 min,靜態(tài)萃取時間為6 min，沖洗體積為80%，氮氣吹掃90 s，靜態(tài)循環(huán)2次。收集全部萃取液于雞心瓶中，于40 ℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇-水(1∶1，體積比)洗滌殘渣，轉(zhuǎn)移至帶刻度的試管中，以甲醇-水(1∶1)定容至25 mL，待凈化。

1.3.2 凈 化取5 mL上述待凈化樣液，加入300 mg乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、300 mg C18、750 mg 無水MgSO4、600 mg胺丙基鍵合硅膠(-NH2),渦旋1 min，振蕩5 min，于4 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL氮吹至近干，用初始流動相復(fù)溶并定容至1 mL，過0.22 μm有機相濾膜，待上機分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司)；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)，B為甲醇(含0.1%甲酸)。梯度洗脫條件：0～5 min，40% B；5～8 min，40%～60% B；8～10 min，60%～80% B；10～13 min，80% B；13～16 min，80%～40% B。進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.25 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧電離源(ESI)，正模式(ESI+)和負(fù)模式(ESI-)同時掃描;電噴霧電壓：5 500 V(ESI+)和-4 500 V(ESI-)，霧化氣壓力(GS1)：50.0 kPa；氣簾氣壓力(CUR)：25.0 kPa；輔助氣壓力(GS2)：50.0 kPa;離子源溫度(TEM)：600 ℃；碰撞氣電壓(CAD)：Medium；掃描時間：50 ms；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。11種雙酚類化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 11種雙酚類化合物及2種同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for 11 BPs and 2 isotopic internal standards

(續(xù)表1)

CompoundCAS No.ESI modeIon pairsDP(V)CE(eV)BADGE-H2O-HCl227947-06-0Positive412.2>227.1*,412.2>135.063,5523,47BFDGE2095-03-6Positive330.2>163.2*,330.2>133.250,5618,23BFDGE-2H2O72408-26-9Positive366.3>181.2*,366.3>107.038,5320,46BPS80-09-1Positive251.1>157.2*,251.1>93.180,8023,34BPS-13C12-Positive263.1>163.2*,263.1>99.272,7224,37BPA80-05-7Negative227.1>212.1*,227.1>132.9-70,-70-25,-32BPA-D1696210-87-6Negative241.3>223.3*,241.3>142.3-85,-85-33,-28BPF620-92-8Negative199.0>93.1*,199.0>105.0-77,-77-29,-29

*quantitative ions；DP:declustering potential;CE:collision energy

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 ASE條件的選擇萃取溶劑和萃取溫度是ASE技術(shù)的關(guān)鍵，因此本實驗主要對這兩個條件進(jìn)行優(yōu)化?？紤]到雙酚類化合物的結(jié)構(gòu)中均含2個及2個以上的苯環(huán)，易溶于乙腈，且乙腈中加酸有利于提高雙酚類化合物的提取率[4]，因此考察了乙腈、乙腈-甲酸(99∶1)、乙腈-乙酸(99∶1)、乙腈-乙酸(95∶5)、乙腈-乙酸-水(89∶1∶10)5種萃取溶劑的提取效率(見圖1)。結(jié)果表明，乙腈-甲酸(99∶1)、乙腈-乙酸(99∶1)、乙腈-乙酸(95∶5)、乙腈-乙酸-水(89∶1∶10)的萃取效率均優(yōu)于乙腈，當(dāng)增加乙酸比例時，BADGE、BPF的萃取效率明顯降低。其中乙腈-乙酸-水(89∶1∶10)的萃取效率最高，可能是由于加適量水能夠增強乙腈滲透到基質(zhì)中的能力，從而提高目標(biāo)物的提取率。因此，實驗選擇乙腈-乙酸-水(89∶1∶10)為最佳萃取溶劑。

圖1 5種萃取溶劑對空白加標(biāo)樣品中雙酚類化合物提取效率的影響Fig.1 Effect of 5 extraction solvents on the extraction efficiencies of bisphenols spiked in blank sample

考察了不同萃取溫度(60、80、90、100 ℃)下的提取效率。結(jié)果顯示，當(dāng)溫度從60 ℃升至80 ℃時，目標(biāo)化合物的提取效率隨之提高，這是因為溫度的增加降低了萃取溶劑的粘度，提高了溶劑對基質(zhì)的浸潤能力。但當(dāng)溫度增至90 ℃時，所有化合物的提取效率開始降低，當(dāng)溫度增至100 ℃時，所有化合物的提取效率明顯降低。因此，本實驗選取80 ℃作為萃取溫度。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，循環(huán)萃取2次和3次的結(jié)果無顯著差異，考慮到萃取時間，選擇循環(huán)2次。綜上，本實驗的最佳萃取條件如“1.3.1”所示。

2.1.2 凈化填料的優(yōu)化QuEChERS法的凈化填料種類很多，其中乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)主要用于吸附糖類和有機酸等弱酸性成分，C18主要去除蛋白質(zhì)和脂類成分，胺丙基鍵合硅膠(-NH2)能有效凈化色素。由于藥食同源性食品基質(zhì)的提取液中可能含有色素、糖類、蛋白質(zhì)和脂類等雜質(zhì)，因此分別考察了上述 3種凈化填料單獨使用以及組合使用的凈化效果。結(jié)果表明，3種凈化填料組合使用的凈化效果明顯優(yōu)于單一使用。此外，本實驗選用300 mg C18、300 mg PSA和600 mg-NH2組合的凈化方式，以增強凈化能力，減小基質(zhì)干擾和離子抑制作用，提高方法的準(zhǔn)確度。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化比較了ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和Thermo Aquasil C18(4.6 mm×100 mm,3.0 μm)2種色譜柱對11種雙酚類化合物的分離效果。結(jié)果表明，在本實驗條件下，T3柱對11種雙酚類化合物的峰形和響應(yīng)值優(yōu)于C18柱，這是因為T3柱的內(nèi)徑和填料粒徑均較小，能夠達(dá)到良好的分離度。因此本實驗選擇T3柱進(jìn)行分析。

由于雙酚類化合物易溶于乙腈和甲醇，實驗比較了乙腈-水和甲醇-水作為流動相的分離效果。結(jié)果表明，以乙腈-水為流動相時目標(biāo)物的分離效果不佳，且響應(yīng)值較低；以甲醇-水作為流動相時，11種目標(biāo)物均能很好分離，目標(biāo)峰響應(yīng)值明顯增大，且峰形均較好。此外，在流動相中加入0.1%甲酸有助于待測物母離子峰的形成，可提高待測物的離子化效應(yīng)和靈敏度；在含0.1%甲酸的水相中加入5 mmol/L乙酸銨有助于消除鈉鹽的干擾，改善峰形拖尾。文獻(xiàn)報道，梯度壓縮效應(yīng)可得到更窄的色譜峰，同時有利于提高方法的靈敏度[28]。故本研究采用甲醇(含0.1%甲酸)-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)作為流動相，梯度洗脫的方式進(jìn)行液相色譜分離。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化取50.0 μg/L雙酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在ESI+和ESI-模式下進(jìn)行電離監(jiān)測，結(jié)果表明，BPA、BPF在ESI-模式下的響應(yīng)更好，其余9種雙酚類化合物在ESI+模式下有更好的響應(yīng)。負(fù)模式下BPA和BPF在一級全掃描質(zhì)譜圖中得到[M-H]-，正模式下其余9種雙酚類化合物在一級全掃描質(zhì)譜圖中得到[M+NH4]+。通過Q3掃描確定子離子對，再優(yōu)化各化合物的碰撞能量(CE)、去簇電壓(DP)等參數(shù)。11種雙酚類化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1，正、負(fù)模式同時掃描的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖2。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評價

按照本方法對空白樣品進(jìn)行提取凈化，得到空白基質(zhì)樣液，向其中添加雙酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成質(zhì)量濃度為0.5～50.0 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時配制相同質(zhì)量濃度范圍的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析，按照下式計算ME:ME=B/A×100%。其中，A和B分別為溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中雙酚類化合物的峰面積。當(dāng)ME大于100%時，表明存在離子化增強效應(yīng)；當(dāng)ME小于100%時，表明存在離子化抑制效應(yīng)。

結(jié)果表明，ME為33.6%～126%，說明樣品中存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，可能是由于化合物競爭離子化所致。因此本實驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法以減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，同時采用同位素內(nèi)標(biāo)法以更加準(zhǔn)確地定量。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限用空白基質(zhì)樣液配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，以化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/L)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性擬合。結(jié)果表明，11種雙酚類化合物在0.5～50.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好線性，相關(guān)系數(shù)(r2)均不小于0.996 0；分別以3倍信噪比(S/N>3)和10倍信噪比(S/N>10)計算得到檢出限(LOD)為0.1～0.5 μg/kg，定量下限(LOQ)為0.3～1.5 μg/kg(見表2)。

表2 11種雙酚類化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 11 BPs

*IS:internal standard

2.4.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別對葛根、山銀花和沙棘3種空白樣品進(jìn)行2.0、10.0、25.0 μg/kg 3水平的加標(biāo)回收實驗，每個水平測定6次，按照本方法進(jìn)行測定，通過內(nèi)標(biāo)法計算加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。由表3可知，11種雙酚類化合物的平均回收率為72.4%～108%，RSD為1.7%～15%。

表3 11種雙酚類化合物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 11 BPs(n=6)

圖3 葛根樣品檢出BFDGE的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of BFDGE in Pueraria lobata

2.5 實際樣品測定

采用建立的方法對30批次的山銀花、葛根和沙棘進(jìn)行11種雙酚類化合物的測定，其中1批次的葛根樣品檢出BFDGE，含量為0.5 μg/kg(見圖3)，其余雙酚類化合物均未檢出。雖然目前我國未將食品及食品模擬物中BFDGE列入限量要求,但歐盟在EC/1895/2005號指令中明確禁止BFDGE在食品接觸材料中使用，因此該產(chǎn)品存在一定的安全風(fēng)險。

3 結(jié) 論

本文建立了一種基于ASE結(jié)合QuEChERS的前處理技術(shù)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定藥食同源性食品中11種雙酚類化合物的檢測方法。與傳統(tǒng)方法相比，該方法自動化程度高、操作簡單、檢測時間短、靈敏度高、回收率較好，滿足相關(guān)法規(guī)要求，可用于藥食同源性食品中雙酚類化合物的快速定性和定量分析。