張麗婷，高 杉，馬 榕，李寧波，喬 潔

(1.山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 化學(xué)教研室，山西 太原 030001)

碳點(diǎn)(CDs)具有合成簡(jiǎn)單、生物相容性好、毒性低、熒光明亮且易功能化等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有發(fā)展前景的納米材料[1]，已應(yīng)用于生物成像[2-3]、光電催化[4-5]、光電器件[6-7]、生物傳感器[8-10]、染料降解[11]等領(lǐng)域。CDs的合成基本分為自上而下[12-14]和自下而上[15-17]兩種方法，其中水熱法因簡(jiǎn)單、高效而備受青睞。近年來(lái)，為了拓寬CDs的應(yīng)用領(lǐng)域，研究者提出了如表面鈍化[18]、官能團(tuán)修飾[19]、金屬元素及非金屬元素?fù)诫s[20-21]等諸多改進(jìn)方法；如Xu等[22]采用檸檬酸鈉和硫代硫酸鈉合成S-CDs用于檢測(cè)鐵離子；Luo等[23]以檸檬酸和尿素為原料采用水熱法合成氮摻雜碳量子點(diǎn)(NCQD)檢測(cè)姜黃素。

圖1 核黃素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of riboflavin

核黃素(Vitamin B2，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)是人體中一種非常重要的化合物，廣泛參與機(jī)體各種物質(zhì)和能量代謝[24-25]，核黃素缺乏將會(huì)引起皮膚粘膜損傷、疲勞、生長(zhǎng)緩慢、尖銳性唇炎和貧血等問(wèn)題[26-27]。目前用于檢測(cè)核黃素的方法有高效液相色譜法[28-30]、毛細(xì)管電泳法[31]、分光光度法[32]和電化學(xué)法[33]，但上述方法存在儀器昂貴復(fù)雜，需專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員的操作，樣品預(yù)處理復(fù)雜，且靈敏度低、選擇性差等缺陷，相比而言，熒光光譜法簡(jiǎn)單，快速，成本低，靈敏度高。

本研究以檸檬酸、L-賴(lài)氨酸和氟化鈉為原料采用水熱法合成了氮氟共摻雜碳點(diǎn)(NFCDs)，采用透射電子顯微鏡(TEM)、傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)、X-射線光電子能譜儀(XPS)、紫外-可見(jiàn)吸收光譜(UV-Vis)和熒光光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)、組成、性質(zhì)進(jìn)行了考察，并研究了溶液pH值、NFCDs的濃度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)核黃素含量檢測(cè)的影響，探討了檢測(cè)機(jī)制，為食品中微量核黃素的檢測(cè)提供了快速、靈敏的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JEM-2100 型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；Bruker Tensor Ⅱ傅立葉紅外光譜儀(德國(guó)Bremen公司)；AXIS ULTRA DLD型X-射線光電子能譜儀(英國(guó)Kratos公司)；UV-2910紫外分光光度計(jì)、F-4500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；pHSJ-3F型酸度計(jì)(上海壘固儀器有限公司)；FD-1D-50冷凍真空干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Smart-N型超純水儀(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；Olympus FV1000-MPE多光子激光掃描顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)儀器公司)。

核黃素、檸檬酸、氟化鈉、L-賴(lài)氨酸、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、Na3PO4·12H2O(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT,北京索萊寶科技有限公司)；無(wú)水乙醇(天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心)；所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 氮氟共摻雜碳點(diǎn)的制備與純化

精密稱(chēng)取0.197 0 g檸檬酸、0.197 2 g賴(lài)氨酸和0.177 4 g氟化鈉于50 mL燒杯中，加入20.0 mL蒸餾水?dāng)嚢?.5 h至其完全溶解，再將上述溶液倒入50 mL反應(yīng)釜中，于180 ℃加熱10 h，靜置冷卻至室溫，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，收集濾液用截留分子量為500 D的透析袋透析48 h，得淺黃色溶液，再冷凍干燥得粉末狀NFCDs(產(chǎn)率15.3%)，備用。

1.3 核黃素的檢測(cè)

向10 mm的石英比色皿中加入120 μL 0.5 mg/mL的NFCDs溶液，再加入不同體積的1.0 mmol/L 核黃素溶液，用10 mmol/L的PBS(pH 7.8)溶液稀釋至2.0 mL，混勻，于室溫下反應(yīng)10 min后，選擇激發(fā)波長(zhǎng)為330 nm，掃描范圍350～640 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度分別為5 nm和10 nm，測(cè)定混合溶液的熒光光譜。

1.4 樣品的處理

牛奶來(lái)自伊利，奶粉來(lái)自雀巢，檢測(cè)前用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)，以8 000 r/min離心10 min，取上清液，用10 mmol/L的PBS(pH 7.8)緩沖溶液稀釋100倍后使用。

2 結(jié)果與討論

2.1 NFCDs的表征

實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸、L-賴(lài)氨酸、氟化鈉合成NFCDs，通過(guò)優(yōu)化獲得最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間分別為180 ℃和10 h，制得的NFCDs在水中分散性良好、外觀透明，呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光，TEM圖中可見(jiàn)NFCDs呈球形，且分散性很好，平均尺寸均小于10 nm(圖2A)；高分辨透射電鏡(HRTEM)圖中顯示NFCDs的晶格間距為0.23 nm(圖2A插圖)，表明NFCDs具有類(lèi)石墨結(jié)構(gòu)[34]，經(jīng)統(tǒng)計(jì)計(jì)算得NFCDs的粒徑尺寸為1.2～4.8 nm，平均粒徑為3.3 nm(圖2B)。

圖2 NFCDs的TEM圖(A)及其粒徑分布圖(B)Fig.2 TEM(A) and size distribution(B) of the NFCDs insert:HRTEM image of NFCDs

圖3 NFCDs的FT-IR圖(A)、XPS圖(B)、紫外、熒光激發(fā)及發(fā)射圖(C)及其在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射譜圖(D)Fig.3 FT-IR(A),XPS(B),UV-Vis absorption spectra and fluorescence excitation and emission spectra(C) and fluorescence emission spectra under different excitation wavelength spectra(D) of NFCDsinsert C:photograph of NFCDs aqueous solution under visible light(left) and UV light(365 nm)(right);insert D:corresponding normalized spectra

2.2 NFCDs的熒光穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)考察了NFCDs在4 ℃下貯存不同時(shí)間的熒光強(qiáng)度及其在365 nm處輻射不同時(shí)間下的熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貯存時(shí)間和紫外輻射對(duì)NFCDs的熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)影響，表明NFCDs具有良好的熒光穩(wěn)定性。

2.3 核黃素檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.3.1 pH值的影響實(shí)驗(yàn)考察了PBS緩沖溶液體系pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、7.8、8.0、9.0、10、11)對(duì)核黃素檢測(cè)的影響。結(jié)果顯示，無(wú)核黃素時(shí)，隨著體系pH值的增加，NFCDs的熒光強(qiáng)度變化不大。但加入核黃素后，NFCDs的熒光強(qiáng)度顯著下降，且在pH值為7.8時(shí)，熒光強(qiáng)度比值F0/F425最大，靈敏度最高，因此實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.8的PBS緩沖溶液。

2.3.2 NFCDs質(zhì)量濃度的影響實(shí)驗(yàn)考察了不同質(zhì)量濃度NFCDs(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)對(duì)核黃素檢測(cè)的影響。結(jié)果顯示，加入0.3 mg/mL NFCDs時(shí)，體系的響應(yīng)靈敏度最高，因此實(shí)驗(yàn)選擇NFCDs溶液質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL。

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間的影響研究發(fā)現(xiàn)，在NFCDs溶液中加入核黃素后，體系的熒光強(qiáng)度迅速降低然后升高，10 min后保持不變，因此選擇反應(yīng)時(shí)間為10 min。

2.4 線性方程與檢出限

研究了不同濃度(0.0、5.5、8.0、10.5、13.0、15.5、18.0、20.5、23.0、25.5、29.0、31.5、34.0、36.5、39.0、41.5、46.5、51.5、56.5、61.5、66.5、71.5 μmol/L)核黃素對(duì)NFCDs熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，隨著核黃素濃度增大，425 nm處的熒光強(qiáng)度下降，而531 nm處的熒光強(qiáng)度上升(圖4A)，圖4B為F531/F425與核黃素濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中F531與F425分別代表加入核黃素后NFCDs在波長(zhǎng)為531 nm和425 nm處的熒光強(qiáng)度。由圖可見(jiàn)，核黃素濃度(x)在3.0～66.5 μmol/L范圍內(nèi)與F531/F425(y)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.046 06x-0.037 17，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.992 3，以3倍信噪比計(jì)算得核黃素的檢出限為0.26 μmol/L。

圖4 不同濃度的核黃素對(duì)NFCDs的熒光光譜(A)及NFCDs相對(duì)熒光強(qiáng)度F531/F425與核黃素濃度的線性關(guān)系(B)Fig.4 Fluorescence spectra of NFCDs on the different riboflavin concentrations(A) and linear relationship curve between F531/F425 and the concentration of riboflavin(B)

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

常見(jiàn)的陽(yáng)離子、氨基酸、食品添加劑可能會(huì)對(duì)NFCDs的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響，因此選擇常見(jiàn)的金屬鹽溶液、氨基酸和食品添加劑(MgCl2、NaCl、MnCl2、CaCl2、AlCl3、BaCl2、ZnCl2、NH4Cl、CoCl2、CdCl2、ZrCl4、Hg(NO3)2、LiNO3、PbCl2、AgNO3、Cr(NO3)3、FeCl2、FeCl3、NiCl2、CuCl2、KCl以及Trp、Thr、Phe、Ile、Lys、Glu、Pro、Gly、His、Ala、Met等)代替核黃素加入待測(cè)體系中，考察其對(duì)NFCDs熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，濃度等于100 μmol/L的上述陽(yáng)離子、氨基酸及食品添加劑等對(duì)檢測(cè)核黃素(70 μmol/L)基本無(wú)影響，表明該熒光探針對(duì)核黃素具有良好的選擇性。

2.6 機(jī)理探討

本文通過(guò)核黃素(受體)的紫外吸收光譜、熒光發(fā)射光譜圖和NFCDs(供體)的熒光激發(fā)、發(fā)射光譜圖探討檢測(cè)機(jī)理。結(jié)果顯示，受體的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖與供體的激發(fā)和發(fā)射光譜之間有一定的重疊，這將有利于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的發(fā)生[38]。在此過(guò)程，受體也是一種熒光發(fā)射體，核黃素對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)為527 nm，由此可推斷531 nm處的熒光發(fā)射峰是由核黃素引起的(圖5A)。通過(guò)考察不同濃度(0、6.0、6.5、7.5、8.0 μmol/L)的核黃素對(duì)NFCDs紫外吸收光譜的影響(圖5B)發(fā)現(xiàn)，加入核黃素后，體系的紫外吸收在NFCDs的基礎(chǔ)上有所增加，但最大吸收峰的位置和形狀未發(fā)生變化，表明核黃素與NFCDs之間未生成新物質(zhì)。故推斷核黃素與NFCDs間通過(guò)偶極-偶極耦合作用發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移[38]，其相互作用如圖6所示。

圖5 核黃素的紫外吸收、熒光發(fā)射光譜圖和NFCDs的熒光激發(fā)、發(fā)射光譜圖(A)及不同濃度的核黃素對(duì)NFCDs紫外吸收光譜的影響(B)Fig.5 UV-Vis absorption spectra,fluorescence emission spectra of riboflavin and fluorescence excitation,emission spectra of NFCD(A) and UV-Vis absorption spectra of NFCDs solution in the presence of various concentrations of riboflavin(B)

圖6 核黃素與NFCDs相互作用示意圖
Fig.6 Schematic diagram of NFCDs for the detection of riboflavin

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)及加標(biāo)回收率

采用本文構(gòu)建的NFCDs熒光探針對(duì)實(shí)際牛奶和奶粉樣品中的核黃素進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。將不同濃度的核黃素加入牛奶和奶粉中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，在優(yōu)化條件下平行測(cè)定3次，核黃素的回收率為96.7%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4%～3.2%，表明本方法可用于牛奶和奶粉中核黃素的檢測(cè)。

表1 牛奶和奶粉中核黃素的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of riboflavin in milk and milk powder

圖7 MTT測(cè)定NFCDs的細(xì)胞存活率Fig.7 Cell viability of HeLa cells in the presence of different concentrations of the NFCDs

圖8 NFCDs在HeLa細(xì)胞中的共聚焦熒光圖像在明亮的區(qū)域(A)、藍(lán)色通道熒光圖(B)以及NFCDs和核黃素在HeLa細(xì)胞中的共焦熒光圖像在明亮的區(qū)域(C)、藍(lán)色通道熒光圖(D)Fig.8 Confocal fluorescence image of HeLa cells were incubated with NFCDs in bright field(A),fluorescence image of blue channel(B),confocal fluorescence images of NFCDs and riboflavin in HeLa cells were incubated in bright fields (C),fluorescence image of blue channel(D)

2.8 細(xì)胞毒性測(cè)試

采用MTT法測(cè)定不同濃度NFCDs對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性。取HeLa細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞鋪滿瓶壁后，消化后傳代至96孔板，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)錄細(xì)胞數(shù)目。過(guò)夜,待細(xì)胞貼壁，再加入不同質(zhì)量濃度的NFCDs(0、10、40、80、200、300、400、500 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用PBS洗滌3次，之后每孔加入20 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL)，放置在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。再用PBS洗滌3次，在每孔中加150 μL的DMSO(二甲基亞砜)，室溫振蕩混勻15 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定。結(jié)果表明，NFCDs的質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率高于80%(圖7)，表明NFCDs具有良好的生物相容性、低毒性，在活細(xì)胞中核黃素的監(jiān)測(cè)方面具有巨大潛力。

2.9 細(xì)胞成像

HeLa細(xì)胞被置于35 mm，底部有10 mm孔的Petridish培養(yǎng)皿中，在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。用PBS緩沖液洗滌后，HeLa細(xì)胞在37 ℃與0.4 mg/mL NFCDs孵育1.5 h，使細(xì)胞攝取。為了監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中核黃素濃度的變化，將細(xì)胞洗滌3次，加入60 μmol/L的核黃素，孵育15 min后進(jìn)行熒光成像。圖8A為NFCDs與HeLa細(xì)胞孵育后在明亮區(qū)域的共聚焦熒光圖像，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)正常，說(shuō)明合成的NFCDs與HeLa細(xì)胞孵育后對(duì)細(xì)胞的毒性很?。籋eLa細(xì)胞經(jīng)過(guò)NFCDs孵育后呈現(xiàn)出藍(lán)色的熒光(圖8B)。經(jīng)NFCDs孵育后，HeLa表現(xiàn)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，表明NFCDs能穿透細(xì)胞膜，通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞；圖8C為NFCDs、核黃素與HeLa細(xì)胞共孵育后在明亮區(qū)域的熒光圖像。其細(xì)胞形態(tài)正常，說(shuō)明合成的NFCDs、核黃素與HeLa細(xì)胞孵育后對(duì)細(xì)胞的毒性很?。划?dāng)HeLa細(xì)胞、NFCDs和核黃素在37 ℃共孵育1.5 h后，采用激光共聚焦顯微鏡對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，未觀察到熒光(圖8D)。細(xì)胞的熒光消失，表明核黃素對(duì)NFCDs的熒光有猝滅作用。由此可見(jiàn)，合成的NFCDs既可用于細(xì)胞成像，也可用于細(xì)胞中核黃素的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

通過(guò)一步水熱法制備得到具有明亮藍(lán)色熒光的NFCDs，量子產(chǎn)率為15.3%，該納米粒子平均粒徑為3.3 nm，生物相容性好，且NFCDs的相對(duì)熒光強(qiáng)度與核黃素的濃度呈良好的線性關(guān)系，濃度范圍3.0～66.5 μmol/L，檢出限為0.26 μmol/L。用于牛奶和奶粉實(shí)際樣品中核黃素的檢測(cè)，結(jié)果令人滿意。