盧冰霞 周英寧 梁家幸 趙碩 蔣冬福 陳忠偉 何穎秦毅斌 李斌 段群棚 劉磊，3 趙武＊

（1. 廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001；2. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530005；3. 廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧 530007）

抗生素被廣泛使用于動(dòng)物疾病的防治中，然而大量使用會(huì)導(dǎo)致藥物殘留從而威脅人類健康。“生物藥物”是替代抗生素的理想選擇之一[1]。在動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的乳酸桿菌可抑制腸致病菌的增殖，參與胃腸道微生態(tài)的平衡，調(diào)節(jié)胃腸道功能[2]。目前已成為養(yǎng)殖業(yè)替抗類益生菌制劑中的主要菌株。乳酸菌在我國是34 種可添加于動(dòng)物飼料中的益生菌[3]。雞微生態(tài)制劑中的乳桿菌可提高雞免疫力并減少抗生素使用。

由于不同來源的益生菌常因在動(dòng)物消化道內(nèi)定殖難而不能發(fā)揮其作用[4]。目前來源于雞的乳酸菌菌種還較少，因此迫切需要開展本動(dòng)物源益生菌的篩選與研發(fā)。本研究從某市場購買健康雞的腸道中分離獲得一株乳酸桿菌，并鑒定了其種屬及部分生物學(xué)特性，為下一步開發(fā)禽用微生態(tài)制劑提供安全高效菌種資源和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品

健康肉雞和20 g左右實(shí)驗(yàn)小鼠分別購自養(yǎng)雞場及廣西醫(yī)科大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

MRS（乳酸菌細(xì)菌培養(yǎng)基）、LB（溶菌肉湯培養(yǎng)基）、明膠液化，糖醇發(fā)酵、蛋白水解用于鑒定細(xì)菌生化特性培養(yǎng)基。V-P試劑（2酰甲基甲醇試劑）。

1.3 乳酸菌的分離鑒定

1.3.1 樣品采集 健康肉雞，用2%戊二醛消毒溶液進(jìn)行體表消毒，割斷勁動(dòng)脈放血致死，無菌操作取出其腸道，使用無菌的PBS小心沖洗黏膜層后，用無菌刀片刮下腸黏膜上皮，置于滅菌三角燒瓶中，加20mL 滅菌MRS 液體培養(yǎng)基混勻，以1000r/min 離心10min，取上清液進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.3.2 細(xì)菌分離 取1.3.1上清液10倍連續(xù)稀釋，取各稀釋度劃線接種MRS平板，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)48h。挑單菌落，分別接種LB及MRS平板進(jìn)行純培養(yǎng)，24h后挑菌革蘭氏染色鏡檢。

1.3.3 生理生化鑒定 按照《乳酸細(xì)菌的分類鑒定與實(shí)驗(yàn)方法》及《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行初步鑒定。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定 按核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行分離菌DNA 提取并PCR 擴(kuò)增其16SrDNA。引物信息見表1，反應(yīng)體系見表2，擴(kuò)增程序見表3。

對PCR 陽性產(chǎn)物序列測定，用Meglin 6.0 對序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，并運(yùn)用MAGA6.06 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，確定分離菌株的種屬。

表1 引物信息

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)程序

1.4 發(fā)酵乳桿菌的生物學(xué)特性研究

1.4.1 耐酸性研究 使用pH值從9.0遞減至1.5，共計(jì)13個(gè)酸堿度的MRS肉湯分別接種分離菌（接種后分離菌濃度約為1×106CFU/mL），37℃培養(yǎng)24h 后檢測其OD600值。

1.4.2 耐膽鹽性研究 將分離菌（接種后分離菌濃度約為1×106CFU/mL）接種于含牛膽鹽0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%、0.70%、0.80%、0.90%及1.00%的MRS肉湯中，37℃培養(yǎng)24h后檢測其OD600值。

1.4.3 耐熱性能研究 將菌株接種于MRS 液體培養(yǎng)基活化（活化后分離菌濃度約為2×108CFU/mL），后分別置于37至80℃共計(jì)7個(gè)溫度梯度的水中放置1h，然后按照1:200 的比例分別轉(zhuǎn)管接種于MRS 肉湯中，37℃培養(yǎng)24h后檢測其OD600值。

1.5 動(dòng)物安全性試驗(yàn)

設(shè)置試驗(yàn)組和對照組，每組5 只小鼠。試驗(yàn)組灌胃分離菌液1 mL（分離菌含量約為2×107CFU），每周兩次；對照組灌胃生理鹽水。連續(xù)4 周觀察小鼠的狀況并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征及染色結(jié)果

在MRS平板上從雞盲腸中分離培養(yǎng)出的菌落均呈圓形，乳白色，邊緣整齊，表面濕潤有光澤，容易挑起。革蘭氏染色鏡檢，呈單個(gè)、成對或者成鏈狀排列的革蘭氏陽性桿菌，無芽孢和鞭毛。符合乳酸菌的特征。

圖1 分離菌在MRS平板上的菌落形態(tài)

圖2 分離菌油鏡下的菌體形態(tài)

2.2 生理生化鑒定結(jié)果

按《乳酸細(xì)菌的分類鑒定與實(shí)驗(yàn)方法》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果見表4，初步判斷為乳酸桿菌，命名為J4。

表4 雞腸道分離菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物大小約1466bp（見圖3）。核苷酸同源性比對顯示，分離菌與發(fā)酵乳桿菌同源性為99.70%。用MEGA6.06 軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，其與發(fā)酵乳桿菌（KT780434 和LC065036）親緣關(guān)系最近，在同一進(jìn)化樹分支上（見圖4）。因此鑒定分離菌J4株為發(fā)酵乳桿菌。

圖3 菌株J4 16SrDNA PCR擴(kuò)增電泳圖

圖4 菌株J4 16SrDNA遺傳進(jìn)化樹

2.4 生物學(xué)特性研究

2.4.1 耐酸性 從圖5 可見：菌株J4 在pH 值為2～8的MRS 培養(yǎng)基中均能生長，其中適宜pH 值為5～7，在pH值為2～5之間菌株J4 OD600nm值隨著pH值降低而明顯降低，表明低pH 值對菌株J4 的活性有較大影響，但其仍能有少量細(xì)菌生長，表明菌株J4 具有較強(qiáng)的耐酸性能。

圖5 發(fā)酵乳桿菌J4在不同pH值MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的OD600nm值

2.4.2 耐膽鹽性 從圖6 可見：菌株J4 的OD600nm值隨著膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降，但濃度為1.0%時(shí)仍有細(xì)菌增殖，顯示分離菌J4株耐膽鹽能力較強(qiáng)。

圖6 發(fā)酵乳桿菌J4在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的OD600nm 值

2.4.3 耐熱性 從圖7 可見：菌株J4 在37，40，50，60，65，70，80℃水浴1 h 后再進(jìn)行37 ℃培養(yǎng)24 h 的OD600nm值隨著水浴溫度的增加而下降，且70℃處理后仍有細(xì)菌生長，表明菌株J4具有較強(qiáng)的耐熱性能。

圖7 菌株J4在不同溫度處理后培養(yǎng)的OD600nm值

2.5 動(dòng)物安全性試驗(yàn)結(jié)果

兩組小鼠實(shí)驗(yàn)過程中精神狀態(tài)良好、采食正常，兩組小鼠無明顯差異。表明分離菌J4 株安全性良好。

3 討論

直接從動(dòng)物的消化道分離是獲得乳酸桿菌的常用手段[5]。本試驗(yàn)獲得的J4株乳酸桿菌分離于健康肉雞盲腸，其細(xì)菌學(xué)綜合鑒定結(jié)果與杜志琳[6]、劉鴿[7]等報(bào)道研究結(jié)果相符，為發(fā)酵乳桿菌。分離菌J4 株具有生長快速，耐熱（70℃）；耐酸（pH 值2）；耐膽鹽（耐0.6%膽鹽）的能力，具備優(yōu)良益生菌的條件。

益生菌作為安全高效的新型替抗產(chǎn)品，是解決養(yǎng)殖業(yè)中濫用抗生素的一種有效手段[4]，但實(shí)際臨床應(yīng)用時(shí)往往遇到很多難題，其中最為主要的是異源菌株在動(dòng)物腸道內(nèi)定植難或者定殖后不分泌活性物質(zhì)而不能發(fā)揮其作用[8]。章文明[9]等的研究表明，必須添加同源益生菌才能很好的發(fā)揮其益生效應(yīng)，且其還應(yīng)具有安全性好和較低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。因此，從雞腸道內(nèi)分離、篩選出高效、安全的益生菌菌株是目前雞飼料添加劑研究的研究方向[10]。目前養(yǎng)雞場使用抗生素防治細(xì)菌病的現(xiàn)象十分普遍，但抗生素的大量、長期使用不僅使病原菌的耐藥率升高，還影響腸道內(nèi)的正常菌群平衡而影響生產(chǎn)效益以及造成藥物殘留威脅人類健康。雞源益生菌的使用能有效減少抗生素的使用，有助于維持雞的腸道菌群平衡[11]，使雞的自身免疫力得到提高[12]。同時(shí)，腸道菌群得到優(yōu)化后，腸道內(nèi)的有害菌顯著減少，從而減輕腸道損傷，使雞生長性能得到明顯提升[13]等。另外，雞腸道中存在膽鹽且pH 值較低，因此在雞腸道中定植和發(fā)揮作用的益生菌必須耐酸、耐膽鹽。本試驗(yàn)分離獲得的菌株具有耐熱、耐酸、耐膽鹽等特點(diǎn)，同時(shí)對動(dòng)物機(jī)體安全無毒，可作為雞源發(fā)酵乳桿菌益生菌的優(yōu)良候選株。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)分離獲得的J4 株乳酸桿菌為發(fā)酵乳桿菌，具有耐熱、耐酸、耐膽鹽，安全無毒等特點(diǎn)，為雞源微生態(tài)制劑的研制提供了優(yōu)良候選株。