張典 ?；?王曉曉 李春霞 程靜 張立志 張雅青

冠狀病毒(Coronaviruses，CoVs)是一類具有廣泛天然宿主的正鏈RNA病毒。在過去的幾十年中，新進(jìn)化的CoVs已對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。在CoVs感染期間，宿主的免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)病毒感染觸發(fā)免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)對(duì)于控制和消除CoVs感染至關(guān)重要，免疫調(diào)節(jié)機(jī)制異?？梢鹈庖叻磻?yīng)失控，導(dǎo)致肺組織細(xì)胞損傷及肺功能受損。了解CoVs和宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用，可以明確肺組織炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度，揭示肺部炎癥反應(yīng)的演變和發(fā)展方向[2]。本文對(duì)CoVs的病原學(xué)特征及宿主免疫系統(tǒng)在CoVs感染期間的調(diào)控機(jī)制予以綜述。

CoVs的病原學(xué)特征

近年來，在世界各地多次出現(xiàn)CoVs相關(guān)性感染，例如，2002年由CoVs引發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS-COV)，2012年CoVs引發(fā)的中東呼吸綜合征(MERS-COV)，2019年底和2020上半年多個(gè)國家和地區(qū)報(bào)告的人類新型冠狀病毒感染(COVID-19)。流行病學(xué)表明，突發(fā)冠狀病毒感染傳播可能帶來災(zāi)難性后果，對(duì)人類健康和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3]。

CoVs是有包膜非節(jié)段的正義單鏈RNA病毒，電子顯微鏡下可觀察到表面有許多規(guī)律排列的顆粒狀突起，病毒直徑約80～120nm，基因組包含2700～3200個(gè)堿基，是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒[4]。CoVs病毒體由基因組RNA和膜蛋白組成，膜蛋白包含三種不同類型的糖蛋白，即刺突糖蛋白(Spike Protein，S)、小包膜糖蛋白(Envelope Protein，E)和膜糖蛋白(Membrane Protein，M)，某些種類還有血凝素糖蛋白(Haemaglutinin-esterase，HE)。病毒糖蛋白含有受體結(jié)合位點(diǎn)、主要抗原表位，具有對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸、新生病毒出芽釋放、形成病毒外包膜等作用。CoVs分為四個(gè)基因型，即α、β、γ和δ亞型。α-CoVs和β-CoVs是人類常見的病原體，30%～60%的中國人群血清抗CoVs抗體呈陽性反應(yīng)。β-冠狀病毒又可以進(jìn)一步分為四個(gè)病毒譜系，即A～D。目前已知感染人的CoVs共有7種，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1在人群中較為常見，一般致病性較低，可引起呼吸道感染癥狀，類似普通感冒；另外三種是MERS-CoV、SARS-CoV和COVID-19，傳染性及致病性強(qiáng)，嚴(yán)重病例可導(dǎo)致肺炎、嚴(yán)重急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡[5]。除感染人類外，CoVs還可感染蝙蝠、老鼠、貂、駱駝、刺猬等多種哺乳動(dòng)物以及多種鳥類。CoVs對(duì)熱敏感，溫度達(dá)35℃則可抑制病毒生長。紫外線、來蘇水、0.1%過氧乙酸等消毒液可在短時(shí)間內(nèi)將病毒殺死。

CoVs感染與宿主先天免疫應(yīng)答

病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)是病原微生物表面特異存在的，由多種病原微生物所共享，結(jié)構(gòu)恒定且進(jìn)化保守的分子結(jié)構(gòu)。PAMP是病原體賴以生存，變化較少的主要部分，使病原體很難產(chǎn)生突變而逃脫固有免疫的作用。非甲基化寡核苷酸CpG DNA、單鏈RNA、雙鏈RNA均為病毒相關(guān)的PAMP。宿主先天免疫系統(tǒng)通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)識(shí)別CoVs。已知的PRR主要包括toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、RIG-1樣受體(RIG-I-like receptor，RLRs)、NOD樣受體(NOD-like receptor，NLRs)、C型凝集素樣受體(C-type lectin-like receptor，CLR)等。與干擾素(Interferons，IFN)產(chǎn)生有關(guān)的PRRs主要包括TLRs、RLRs和NLRs[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，TLRs識(shí)別CoVs的病毒核酸，通過激活不同的銜接蛋白(如MyD88，TIRAP，TRIP和TRAM)誘導(dǎo)不同的生物學(xué)反應(yīng)。MyD88是第一個(gè)被鑒定的Toll/白細(xì)胞介素-I受體(TIR)家族成員，主要激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)途徑，以誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)[10]。與MyD88不同，TRIF是TLR3和TLR4的銜接蛋白，可激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3和NF-kB誘導(dǎo)I型干擾素和免疫炎癥因子的表達(dá)。TRAM和TIRAP的功能是將TRIF分子募集到TLR4受體，并將MyD88募集到TLR2和TLR4受體。MyD88依賴性通路可激活免疫炎癥因子，而TRIF依賴性通路可激活I(lǐng)型干擾素和炎癥性細(xì)胞因子。通過相應(yīng)的PAMP激活TLR后，MyD88募集busy-1受體相關(guān)的激酶IRAK4、IRAKI、IRAK2和IRAK-M。IRAK4在激活MyD88下游的NF-kB和MAPK中起重要作用。IRAK與TRAF6相互作用，導(dǎo)致K-63泛素化，進(jìn)一步促進(jìn)NEMO泛素化以激活NF-kB、IRF3和干擾素β[11]。

RLRs包括H家族成員RIG-1(DDX58)，MDA5(IFIH)和LGP2，主要識(shí)別CoVs病毒核酸。RNA具有DExD / H-box RNA解旋酶結(jié)構(gòu)和C末端終止結(jié)構(gòu)(CTD)，而RIG-1和MDA5具有N末端半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)，可與下游銜接子MAVS相互作用。C端RNA解旋酶和CTD結(jié)構(gòu)可以識(shí)別RNA，其構(gòu)象變化需要ATP才能使CARD結(jié)構(gòu)與MAVS相互作用。病毒RNA的共同特征是具有三磷酸結(jié)構(gòu)的短雙鏈，互補(bǔ)末端和/或富含聚U/UC的結(jié)構(gòu)。RIG-I可以識(shí)別5'端含有三磷酸RNA的病毒核衣殼蛋白。當(dāng)CTD結(jié)構(gòu)識(shí)別出病毒的5'端三磷酸時(shí)，引起ATP依賴的構(gòu)象變化，使CTD結(jié)構(gòu)形成雙鏈RNA復(fù)合物，然后CARD結(jié)構(gòu)從自我抑制中釋放出來并與MAVS相互作用[12]。NLRs是另一類模式識(shí)別受體，其識(shí)別CoVs病毒成分中包含保守的NOD結(jié)構(gòu)。NLRs受體家族成員根據(jù)不同功能劃分為三類。第一類與多種蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這些復(fù)合物包含至少八個(gè)NLR蛋白的炎癥小體，包括NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRC4、NLRC5W和AY2 等。第二類對(duì)于生殖和胚胎再生至關(guān)重要。第三類由調(diào)節(jié)性NLR組成。這些NLRs是陽性或陰性條件性炎癥信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的重要途徑。NLRs對(duì)CoVs的識(shí)別作用機(jī)制尚不明確[13]。

CLR是一類可溶性跨膜模式識(shí)別受體，在髓樣細(xì)胞中廣泛表達(dá)。由于其在細(xì)胞內(nèi)區(qū)域具有多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的基序結(jié)構(gòu)，CLR受體具有廣泛的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞粘附、組織修復(fù)、血小板活化和自然免疫反應(yīng)等。細(xì)胞中CLR主要由巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的Mincle和CLEC4E受體直接激活，以及受體細(xì)胞內(nèi)HAM樣基序來激活受體，涉及募集酸化的脾酪氨酸激酶，進(jìn)而促進(jìn)CARD9、B細(xì)胞淋巴樣組織10和Maltl復(fù)合物的形成。同時(shí)，凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白，被SyK和JNK酸化后，激活了下游分子，包括NF-kB和MAPKs，并引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞吞噬、DC細(xì)胞成熟和細(xì)胞趨化性等[14]。

研究發(fā)現(xiàn)，CoVs入侵宿主時(shí)，PRR最初會(huì)識(shí)別病毒核酸，收集特定的信號(hào)銜接蛋白，激活I(lǐng)FN3和IRF7，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并促進(jìn)IFN-I合成。IFN-I激活下游JAK-STAT信號(hào)通路，促進(jìn)IFN刺激因子ISG的表達(dá)。作為宿主的主要抗病毒分子，IFN可抑制病毒復(fù)制和傳播，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，以促進(jìn)抗原的巨噬細(xì)胞吞噬作用，以及NK細(xì)胞對(duì)受感染靶細(xì)胞和T/B細(xì)胞的抑制作用。PRRs中TLRs、RLRs和NLRs與IFN產(chǎn)生有關(guān)，IFN異?？芍苯佑绊懖《驹谒拗黧w內(nèi)增值[15]。另外，血漿樹突狀細(xì)胞激活后，TLR7/ TLR9識(shí)別病毒核酸，以誘導(dǎo)由NF-κB和IRF7介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子和IFN-I的產(chǎn)生。樹突狀細(xì)胞在先天性免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。作為生物體中最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，成熟的樹突狀細(xì)胞可以有效激活T細(xì)胞，在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、調(diào)節(jié)和維持發(fā)揮中心作用[16]。與健康對(duì)照組相比，COVID-19感染患者初始血漿IL-1β、IL-1Rα、IL-7、IFNγ、TNF-α等細(xì)胞因子和血管內(nèi)皮生長因子濃度更高。重癥COVID-19患者的血漿IL-2、IL-7、IL-10和TNF-α的水平顯著高于輕癥患者。因此，免疫病理學(xué)在不同嚴(yán)重程度的COVID-19感染中發(fā)揮了重要作用[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV編碼一種核衣殼(nucleocapsid，N)蛋白，N蛋白可以抑制poly(I：C)或仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的IFN-β生成。然而，N蛋白不能抑制TLR3和RIG-I依賴途徑信號(hào)分子過表達(dá)誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生。研究認(rèn)為，SARS-CoV的N蛋白可作為免疫逃逸蛋白，N蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域?qū)FN誘導(dǎo)產(chǎn)生拮抗作用，使SARS-CoV保持高致病性，影響宿主的先天性免疫應(yīng)答的效果[18]。

CoVs感染與適應(yīng)性免疫反應(yīng)

B細(xì)胞亞群具有天然記憶細(xì)胞和抗體分泌細(xì)胞的表型特征，可在CoVs中大量聚集。使用特異性的9-mer肽CYSSLILDY，檢測到針對(duì)MERS-CoV的抗原結(jié)合位點(diǎn)，位于S糖蛋白區(qū)域內(nèi)的437～445位點(diǎn)。該序列具有最強(qiáng)的B細(xì)胞抗原性，在計(jì)算機(jī)模擬中與MHC I類等位基因的相互作用最大[23]。研究顯示，體液免疫對(duì)于控制持續(xù)的CoVs感染至關(guān)重要，從MERS-CoV感染康復(fù)的患者分離出多種抗體，包括MCA1、CDC-C2、MERS-GD27和MERS-GD33等。研究發(fā)現(xiàn)，CoVs患者體內(nèi)的抗體反應(yīng)涉及復(fù)雜的單克隆抗體混合物，可作用于病毒包膜糖蛋白上的不同抗原結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20多種人類抗體或人源化單克隆抗體，在針對(duì)MERS-CoV感染的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。此外，MERS-CoV利用S蛋白作為粘附因子，通過二肽基肽酶-4(Dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)受體進(jìn)入宿主細(xì)胞。DPP4是信號(hào)傳遞以及獲得性和先天性免疫應(yīng)答激活的關(guān)鍵受體，針對(duì)DPP-4的靶向單克隆抗體可能具有與疫苗相似的保護(hù)作用[24]。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，由噬菌體源制備的人單克隆抗體m336，可與MESS-CoV病毒刺突蛋白的受體結(jié)合區(qū)相互作用，體外實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)MES-CoV具有較強(qiáng)的中和活性，抗體m336可使肺組織中病毒RNA滴度降低40000～90000倍[25]。用MERS-CoV感染模型猴后，分別用高滴度超免疫血漿或單克隆抗體m336進(jìn)行處理，兩組的臨床癥狀均可得到明顯緩解，但僅在超免疫血漿組中發(fā)現(xiàn)呼吸道病毒載量降低。研究表明，抗體m336可顯著降低兔肺組織中的病毒RNA滴度和與病毒相關(guān)的病理變化。但兩種療法均未能完全阻斷MERS-CoV感染，不同模型動(dòng)物對(duì)MERS-CoV感染引起適應(yīng)性免疫反應(yīng)存在差異，MERS-CoV 感染可能存在種屬特異性[26]。此外，接種S納米顆粒的小鼠產(chǎn)生了針對(duì)同源病毒的高水平中和抗體，該抗體與異種病毒無交叉保護(hù)作用[27]。在受到SARS-CoV感染后，免疫雪貂比對(duì)照組產(chǎn)生更快更強(qiáng)的中和抗體反應(yīng)，在肝組織中也觀察到強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[28]。研究顯示，SARS-CoV 的S蛋白與肝組織的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。也有學(xué)者研究了SARS-CoV病毒血癥和抗體應(yīng)答的時(shí)間分布。在SARS患者病毒血癥的高峰期，診斷前1-2周血液樣本中75%可以檢測到病毒RNA，但均未在恢復(fù)期患者的血液樣本中檢測到。研究認(rèn)為，在SARS-CoV急性期的體液免疫反應(yīng)和疾病恢復(fù)過程中，持續(xù)存在的IgG抗體對(duì)于控制病毒血癥及清除病毒具有重要意義[29]。

綜上所述，CoVs引起宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，適度的免疫反應(yīng)對(duì)于抗CoVs感染至關(guān)重要，免疫調(diào)節(jié)機(jī)制異?？稍斐擅庖叻磻?yīng)失衡及靶器官的結(jié)構(gòu)和功能損傷。明確CoVs與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，了解CoVs逃避先天性免疫系統(tǒng)的途徑，選擇應(yīng)用CoVs靶向單克隆抗體，將為完善CoVs感染的抗病毒策略及改善預(yù)后提供依據(jù)。盡管COVID-19感染的流行時(shí)間較短，但傳播速度快，擴(kuò)散范圍廣，感染人數(shù)及死亡人數(shù)多，可能與COVID-19 獨(dú)特的病原學(xué)特征有關(guān)，需要更多的臨床與基礎(chǔ)研究予以明確。