唐新華 張輝宏 吳冬梅 李橋

慢性阻塞性肺病是一種以持續(xù)存在的氣流受限為主要的常見呼吸系統(tǒng)疾病，多呈進(jìn)行性發(fā)展[1]。慢阻肺的發(fā)展與細(xì)胞免疫功能紊亂及 T 淋巴細(xì)胞亞群比例失衡有關(guān)，輔助性 T 細(xì)胞1((T helper 1 cell, Th1)參與調(diào)控慢阻肺的炎性反應(yīng)[2-3]。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain 3, Tim3)選擇性表達(dá)于活化的輔助性T細(xì)胞1(T helper 1 cell, Th1)表面，可以抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[4]。研究表明Tim3與哮喘等氣道高反應(yīng)密切相關(guān)[5-6]。提示從外周血中探索Tim3與慢阻肺的關(guān)系成為一種思路。本研究初步探討慢阻肺中Tim3的表達(dá)，及其與慢阻肺輕、中、重程度和轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。

資料與方法

一、 研究對象

根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，選擇2018年1月至2019年6月在干休所就診的慢阻肺患者63例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有嚴(yán)重心腦血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病活動期及使用免疫調(diào)節(jié)藥物者；②合并重癥肺結(jié)核、肺部腫瘤、支氣管擴(kuò)張、哮喘等其它呼吸系統(tǒng)慢性疾病者；③檢查資料不全者。按臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)分級：輕度組：FEV1/FVC<70%，F(xiàn)EV1≥80%預(yù)計值；中度組：FEV1/FVC<70%，50%≤FEV1<80%預(yù)計值；重度組：FEV1/FVC<70%，F(xiàn)EV1<30%預(yù)計值或FEV1<50%預(yù)計值，伴有慢性呼吸衰竭。研究對象分為：輕度組24例，中度組19例，重度組20例。其中男34例，女29例，年齡45～79歲，平均年齡61.34±14.21歲，以同期健康體檢者26例作為對照組[8]。各組間年齡、性別構(gòu)成比均無統(tǒng)計學(xué)意義。本試驗研究通過北京衛(wèi)戍區(qū)海淀第二十八離職干部休養(yǎng)所倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽訂知情同意書。

二、 標(biāo)本收集

患者空腹條件下采集肝素抗凝血5mL，經(jīng)抗生素為主的治療后，結(jié)合患者癥狀(咳嗽、呼吸困難、喘息、發(fā)熱等)和血常規(guī)、胸部影像學(xué)等檢查結(jié)果再次空腹抽取肝素抗凝血5mL。對照組體檢時空腹抽取肝素抗凝血5mL。

三、 PBMCs的分離及培養(yǎng)

將健康志愿者外周血用1640培養(yǎng)基1 ∶1稀釋，密度梯度離心后收集單個核細(xì)胞層細(xì)胞，然后用1640培養(yǎng)基洗滌兩次，所得沉淀物為PBMCs。TRIzol 法提取總RNA,并根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時熒光定量RT-PCR法檢測Tim-3的表達(dá)：TIM3基因引物F:5′-GCAGGGCAGATAGGCATTCT-3′，R:5′-CTGCTGCTACTACTTACAAGGTC-3′; GAPDH 引物F：5′-GGAGCCAAAAGGGTCATCACTC-3′，R：5′-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3′。反應(yīng)條件: 95℃ 3 分鐘; 擴(kuò)增反應(yīng): 95℃ 5 秒，62℃30 秒，在延伸階段檢測熒光信號，35個循環(huán)。檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt計算。實(shí)驗重復(fù)3次。

四、 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、患者一般臨床特征

63例慢阻肺患者按臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)分級分為輕度組24例，中度組19例，重度組20例，臨床資料(見表1)。三組之間在年齡、性別構(gòu)成、受教育程度、體重指數(shù)、吸煙指數(shù)等方面均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表1 不同級慢性阻塞性肺疾病患者一般臨床特征分布

二、各組患者TIM3基因的表達(dá)

實(shí)時熒光定量RT-PCR法檢測各組患者外周血單個核細(xì)胞中TIM3基因的表達(dá)。對照組及輕度組患者TIM3基因mRNA表達(dá)處于較低水平，中度和重度組患者TIM3表達(dá)明顯增加，經(jīng)ANOVA檢驗有顯著性差異(F=5.132，P<0.05)(見表2)。63例患者經(jīng)過綜合治療后，57例患者病情均明顯好轉(zhuǎn)。6例重度組患者治療效果不好，未達(dá)到慢阻肺穩(wěn)定期。57例治療效果好的患者TIM3基因表達(dá)明顯下降，采用配對t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5. 795，P=0.003)(表2)。6例治療效果不好的患者TIM3基因表達(dá)明顯高于治療效果好的患者，且治療后TIM3基因表達(dá)無明顯下降，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.879，P=0.4135)。

表2 不同級慢性阻塞性肺疾病患者外周血中單個核細(xì)胞Tim3基因表達(dá)的變化

注：*代表與對照組比較差異有顯著性，△代表與治療前比較差異有顯著性。

三、TIM3基因表達(dá)水平在慢阻肺患者治療療效預(yù)測中的效能分析

Tim3表達(dá)預(yù)測慢阻肺患者治療療效的曲線下面積(AUC)為0.694 (P=0.016)，靈敏度為80%，特異度為75%，截斷值(cut off)為0.324ng/mL(表3)。

表3 Tim3在慢阻肺患者治療療效預(yù)測中的效能分析

討 論

Tim3是 Monney等人在尋找區(qū)分Th1和Th2的表面分子標(biāo)志時發(fā)現(xiàn)的一個新的分子，它通過負(fù)性調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的功能廣泛參與特異性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。Tim3選擇性表達(dá)在活化的Th1細(xì)胞表面，可以降低IFN-γ的分泌，抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)并可誘導(dǎo)外周耐受[17-18]。近期研究發(fā)現(xiàn)，Tim3也在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞表面表達(dá)。與在T細(xì)胞表面的功能不同，Tim3正調(diào)節(jié)天然免疫細(xì)胞功能，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的促炎因子IL-1和TNF-α，通過影響這些免疫細(xì)胞的功能，參與多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如移植排斥反應(yīng)、慢性病毒感染等[19-20]。有文獻(xiàn)報道Tim3在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。支氣管哮喘患者中高表達(dá)Tim3，有可能通過抑制Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答來促進(jìn)Th2細(xì)胞因子的分泌[6]。臨床上可通過應(yīng)用Tim3抗體促進(jìn)IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活化，Tim3-galectin-9信號通路可能抑制T細(xì)胞免疫，促進(jìn)T細(xì)胞耐受，控制相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。Tim3在不同細(xì)胞表達(dá)，發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，充分證實(shí)Tim3在免疫調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用[21-22]。但是目前尚無關(guān)于Tim3在慢阻肺發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制相關(guān)研究。

本研究檢測了輕、中、重度慢阻肺患者外周血單個核細(xì)胞中Tim3的基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示，中度及重度慢阻肺患者組Tim3高于輕度患者組及對照組，且重度患者組高于中度患者組。一方面，Tim3可能通過在巨噬細(xì)胞上的表達(dá)增強(qiáng)非特異性免疫反應(yīng)，促進(jìn)TNF-α、IL-6 等炎癥介質(zhì)的分泌，參與慢阻肺的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[23]。另一方面，Th17和Th1細(xì)胞在慢阻肺患者中表達(dá)失衡，Th17細(xì)胞在慢阻肺患者中具有免疫抑制作用，可起到促進(jìn)炎癥反應(yīng)的功能。而Tim3的表達(dá)可以調(diào)控Th17細(xì)胞的數(shù)量[24]，慢阻肺患者中高表達(dá)Tim3，有可能造成Th17細(xì)胞的數(shù)量和功能異常。治療后，隨著病情緩解，Tim3的表達(dá)也隨之下調(diào)，Tim3表達(dá)預(yù)測慢阻肺患者治療療效的曲線下面積(AUC)為0.694 (P=0.016)，靈敏度為80%，特異度為75%，截斷值(cut off)為0.324ng/mL，提示我們可以通過檢測Tim3的表達(dá)來預(yù)測COPD病情變化及轉(zhuǎn)歸。但本研究樣本量偏小，有待于以后我們擴(kuò)大樣本量檢測，驗證Tim3在慢阻肺中的診斷價值。