劉冬冬 李玉婷 李慶海 張才擎 韓偉1,

惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma, MPM)是一種起源于胸膜間皮細(xì)胞的惡性侵襲性腫瘤，可發(fā)生于胸膜的任何部分，沿胸膜臟層或壁層彌漫性生長(zhǎng)，并可侵襲周圍組織。由于其惡性程度高、侵襲性強(qiáng)，確診后中位生存期僅為10～12個(gè)月。闡明MPM的病因及發(fā)病機(jī)制、尋找有效的診療措施，成為改善病人預(yù)后的重要方向。miR-183家族是近年來(lái)研究較為活躍的一類microRNA，作為家族成員之一，miR-182也參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1-3]，但miR-182與MPM發(fā)病的相關(guān)研究和報(bào)道甚少。本文通過(guò)體外轉(zhuǎn)染miR-182，觀察MPM細(xì)胞系NCI-H2452的生物學(xué)行為改變，探究其在MPM發(fā)病中的作用，為診治MPM尋求新的靶點(diǎn)。

資料與方法

一、細(xì)胞株

本實(shí)驗(yàn)所采用的人間皮瘤細(xì)胞NCI-H2452系購(gòu)自武漢普諾賽生物有限公司。

二、miR-182模擬物的構(gòu)建

miR-182 mimic及NC-mimic由 invitrogen 公司合成。

三、細(xì)胞分組

分組：(1) control組，不做轉(zhuǎn)染、完全空白組；(2) miR-182 mimic 組，將 miR-182 mimic 轉(zhuǎn)染NCI-H2452細(xì)胞；(3)NC-mimic組，將miR-NC-mimic轉(zhuǎn)染NCI-H2452細(xì)胞。

四、miRNA mimic轉(zhuǎn)染

20nM的miR-182 mimic及NC-mimic轉(zhuǎn)染NCI-H2452細(xì)胞(按Lipofectamine TM 2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，并分別于轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收集細(xì)胞提取RNA，48小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞活力、增殖、凋亡及侵襲等的檢測(cè)。

五、MTT檢測(cè)細(xì)胞的活力

將3×104的NCI-H2452細(xì)胞接種于96孔板，待轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，吸棄板孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入含10%MTT的完全培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)箱中避光孵育1～2小時(shí)，使用酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)于450 nm處測(cè)定OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

六、流式檢測(cè)細(xì)胞的增殖

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后經(jīng)胰酶消化、PBS清洗后，離心收集細(xì)胞，并加入PI染液，4℃避光標(biāo)記30 min，流式細(xì)胞儀分析(美國(guó)BD公司)上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)CM cellQuest軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞，Macquit軟件分析數(shù)據(jù)。

七、流式檢測(cè)細(xì)胞的凋亡

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，并加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染液，室溫避光標(biāo)記15 min，流式細(xì)胞儀分析上機(jī)檢測(cè)。

八、Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲

1 細(xì)胞準(zhǔn)備 在6孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞(方法同前)，轉(zhuǎn)染24h后，胰酶消化、DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

2 配制基質(zhì)膠 將人工基質(zhì)膠室溫下溶解，并用不含F(xiàn)BS 的DMEM按特定比例稀釋，均勻平鋪于8 μm 的聚碳酸酯膜上以浸沒(méi)膜上的微孔，紫外線照射消毒 30 min。

3 轉(zhuǎn)移細(xì)胞 將含人工基質(zhì)膠的小室嵌入24孔板內(nèi)，下室加入600μL含0.2%FBS的DMEM，上室加入200μL細(xì)胞懸液(含5萬(wàn)細(xì)胞、0%的FBS)。

4 結(jié)晶紫染色 繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用棉簽拭去上室面的細(xì)胞，95%乙醇溶液固定 30 min，1%結(jié)晶紫染色30分鐘，在200×顯微鏡下隨機(jī)選取 5個(gè)視野進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、miR-182 mimic可上調(diào)的miR-182的表達(dá)

在NCI-H2452細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-182 mimic 24h后，miR-182 mimic組中miR-182的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(圖1，P<0.001)，而NC mimic、Control兩對(duì)照組間無(wú)差異。

圖1 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-182的表達(dá)

***vsmiR-182 mimic組，P<0.001，n=3

二、上調(diào)miR-182對(duì)NCI-H2452活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-182 mimic組中細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組(圖2，P<0.001)，而Control、NC mimic兩對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 miR-182 mimic對(duì)NCI-H2452活力的影響

***vsmiR-182 mimic組，P<0.001，n=3

三、高表達(dá)miR-182促進(jìn)NCI-H2452的增殖

增殖指數(shù)=(S+G2M)/(G0G1+S+G2M)*100%，即“G2M+S期”的細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例，與細(xì)胞的增殖正相關(guān)。細(xì)胞周期檢測(cè)顯示：miR-182 mimic轉(zhuǎn)染組在S+G2M期的細(xì)胞比例(即增殖指數(shù))較Control組、NC-mimic組均明顯增加(圖3，P<0.001)，而增殖指數(shù)在Control組和NC-mimic組間無(wú)差異。

四、高表達(dá)miR-182對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-182 mimic組、Control、NC-mimic三組的凋亡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)。

五、高表達(dá)miR-182促進(jìn)NCI-H2452的侵襲

Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-182 mimic組穿過(guò)Transwell小室半透膜的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多，而每視野侵襲細(xì)胞數(shù)在NC mimic、Control兩對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)圖5)。

討 論

惡性胸膜間皮瘤(MPM)是一種罕見(jiàn)、惡性程度極高的腫瘤，化療、放療、手術(shù)等傳統(tǒng)方法對(duì)MPM患者療效欠佳。目前發(fā)現(xiàn)MPM發(fā)病與石棉接觸相關(guān)[4]，而我國(guó)是石棉生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，近年來(lái)MPM的發(fā)病增長(zhǎng)迅速，給個(gè)人和社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。因此，深入闡明MPM的發(fā)病機(jī)制，對(duì)發(fā)現(xiàn)該病的新靶點(diǎn)、研發(fā)新藥具有重要科學(xué)意義。

圖3 流式檢測(cè)各組細(xì)胞的周期分布

圖4 流式檢測(cè)細(xì)胞的凋亡(n=3)

圖5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞的侵襲

a.結(jié)晶紫染色并光鏡下拍照評(píng)估各組細(xì)胞的侵襲能力(200X)；b.不同刺激組細(xì)胞在200倍光鏡下觀察到的每個(gè)視野穿透transwell小室的細(xì)胞數(shù)。** vsmiR-182 mimic組，P<0.01；***vsmiR-182 mimic組，P<0.001(n=3)。

MicroRNA(miRNA)是一類受環(huán)境調(diào)控的非編碼小RNA分子，可通過(guò)負(fù)性調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄而參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5]。miR-182是miR-183的家族成員之一，位于人類7q32.2染色體上，研究發(fā)現(xiàn)它在不同腫瘤作用的反差很大。其中，miR-182作為癌基因，在肺癌[6]、結(jié)腸癌[7]、宮頸癌[8]等腫瘤中發(fā)揮促癌作用，但miR-182在MPM中的作用尚未闡明。

Balatti[9]發(fā)現(xiàn)，miR-182在MPM細(xì)胞系(含NCI-H2452)的表達(dá)較人正常間皮細(xì)胞明顯增加，但其差異表達(dá)的意義不明。本人通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-182類似物上調(diào)miR-182，發(fā)現(xiàn)可顯著提高NCI-H2452細(xì)胞的活力、增加進(jìn)入S期和G2/M期的細(xì)胞比例(圖2、3)，這說(shuō)明miR-182可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)NCI-H2452的增殖。類似的是，Chang H發(fā)現(xiàn)[10]過(guò)表達(dá)miR-182可改變H-460(非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)的周期分布進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

MPM易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，可累及肺、腦、胃腸道等多種器官。本人采用Transwell進(jìn)行細(xì)胞侵襲檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)，miR-182過(guò)表達(dá)組較對(duì)照組顯著增強(qiáng)了NCI-H2452的侵襲(圖5)，提示miR-182在MPM轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。同樣地，Li X等人發(fā)現(xiàn)miR-182可促進(jìn)結(jié)腸癌、胃癌細(xì)胞的侵襲，進(jìn)而參與相關(guān)腫瘤的轉(zhuǎn)移[11-12]。

本研究通過(guò)體外上調(diào)miR-182，觀察到MPM細(xì)胞增殖、侵襲能力顯著增強(qiáng)，首次證實(shí)miR-182對(duì)MPM而言是一種促癌基因。因人力、經(jīng)費(fèi)原因，本研究尚有不足之處：1.miR-182在MPM發(fā)揮促癌作用的下游機(jī)制尚未研究；2.miR-182在人MPM組織的表達(dá)情況及miR-182的動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)尚需進(jìn)一步完善。

綜上所述，miR-182在MPM的增殖、侵襲中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步明確MPM的發(fā)病機(jī)制和靶向治療提供了科學(xué)依據(jù)。