趙苑，董逸，李海波，趙麗，張武昌，肖天

（1.中國科學院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室，山東 青島 266071；2.青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，山東 青島 266237；3.中國科學院海洋大科學研究中心，山東 青島 266071）

細菌群落中的單個細菌在生理狀態(tài)、代謝活性、化學組成、基因轉(zhuǎn)錄翻譯、行為等多個方面存在差異，即細菌個體間的異質(zhì)性，區(qū)分細菌群落中不同個體特征的研究被稱為單細胞微生物學（Brehm-Stecher et al，2004；Ishii et al，2010）。海洋浮游異養(yǎng)細菌（以下簡稱浮游細菌）在海洋有機物降解和溶解有機碳轉(zhuǎn)化中起著重要作用，同時也是影響海洋凈生產(chǎn)力的重要生物因素（張異凡等2019）。它們種類繁多，胞內(nèi)含幾千種化合物，代謝反應(yīng)（途徑）極其多樣，所以自然海水中各個細菌除了種類的差別之外，也存在生理代謝和化學組成的異質(zhì)性，對浮游細菌異質(zhì)性及其影響因素的研究是理解細菌生產(chǎn)、代謝及其在生物地球化學循環(huán)中的重要作用的基礎(chǔ)。

浮游細菌生理代謝和化學組成的異質(zhì)性可以依據(jù)不同的指標進行研究（Del Giorgio et al，2008；Grégori et al，2001；Hammes et al，2011）。浮游細菌的生理代謝包括細菌的存活狀態(tài)和代謝活性。存活狀態(tài)是100 年以前使用的概念，它依賴于培養(yǎng)方法（Hammes et al，2011），將細菌涂布在瓊脂平板上能生長形成菌落的即為活的，不能生長的為死的，這曾經(jīng)是判斷細菌存活的金標準（Buysschaert et al，2016）。但很多細菌在環(huán)境中處于“具有活性但無法培養(yǎng)”的狀態(tài)（Roszak et al，1984），這些細菌無法在平板上生長，但仍保持一定代謝能力，在適宜環(huán)境條件下可以復(fù)活并繁殖。使用落射熒光顯微鏡來計數(shù)海水中浮游細菌豐度的方法是浮游細菌研究的重要突破（Hobbie et al，1977），相當一段時間內(nèi)人們認為這個方法得出的是存活的細菌豐度，然而Zweifel 等（1995）使用表面熒光顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)使用DNA 熒光染料DAPI（4＇，6-二脒 基-2 - 苯 基 吲 哚， 4＇ ， 6 -diamidino -2 -phenylindole）染色的波羅的海水樣中，僅有少數(shù)（2%～32%）細菌可以觀察到擬核（nucleoid），而大多數(shù)細菌不含擬核，可能是無活性（inactive）的，稱為幽靈細菌（ghost）。幾乎與此同時，Heissenberger 等（1996） 用電鏡法觀察到浮游細菌僅約34%具有完整的細胞結(jié)構(gòu)，多數(shù)細菌細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)受損（42%）或缺乏內(nèi)部結(jié)構(gòu)（24%），意味著這些細菌是無活性或者死亡的。目前學者可以通過檢驗細胞結(jié)構(gòu)的完整性來判斷細菌的存活狀態(tài)，主要指標有：1）是否具有擬核；2） 細胞膜是否完整；3）細胞膜是否具有極性和膜電位。

代謝活性是通過檢驗細菌對某種物質(zhì)（底物）的吸收和轉(zhuǎn)化能力來進行判斷，需要培養(yǎng)并檢測細菌體內(nèi)物質(zhì)的積累情況，所以對于底物的選擇主要考慮可吸收和可檢測兩個指標。許多物質(zhì)由于分子量或極性等原因是不能被細菌所吸收的，因此并不是所有物質(zhì)都能作為底物。根據(jù)可檢測的要求，底物主要有兩類：1）放射性標記底物，即使用有放射性標記的有機底物培養(yǎng)細菌并過濾到濾膜上，將濾膜和底片疊加放到玻片上，用熒光顯微鏡觀察細胞周圍是否有放射線造成的陰影，這項技術(shù)被稱為顯微放射自顯影術(shù)，這種有放射性標記的有機底物除了被吸收進細菌細胞內(nèi)以外，還可能部分吸附在細菌細胞外，也能出現(xiàn)所謂“放射線陰影”，造成假陽性的誤差，因此在過濾后對濾膜的清洗很重要；2）可產(chǎn)生熒光物質(zhì)的酶底物，例如，加入呼吸作用電子傳遞鏈中某種酶的底物，具有呼吸作用的細菌胞內(nèi)會積累可以產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，通過檢測胞內(nèi)有沒有熒光判定是否有呼吸作用。目前測定細菌的化學組成異質(zhì)性即細胞內(nèi)化學成分的含量，經(jīng)常檢測的三個主要指標包括：核酸含量、核糖體含量和細胞內(nèi)pH。

對于單個細菌，基本上進行其中的一種或兩種測試后，細菌就會被測定過程殺死，無法進行其他指標的測定。因為不能確定一個細菌的所有指標，所以很難確定各個指標之間的聯(lián)系。代謝活性和存活狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，但不完全代表存活狀態(tài)，根據(jù)代謝活性僅能得出活躍的細菌肯定是活的，而不活躍細菌可能是死的，也可能是活的（可能由于活躍程度低于該種方法的檢測限的細胞） （Falcioni et al，2008）。因此，不能通過測定其中的一個指標而推知其他指標。

每個細菌在上述每個指標都存在一個狀態(tài)，這些指標給出的結(jié)果基本都是二分法，即陽性或陰性，對于陽性指標，不能進一步分出強弱的等級。例如，對于細胞膜不完整的結(jié)果，無法測定這個細菌的細胞膜損壞1/4 還是1/8。除了陽性（或陰性）細菌的具體數(shù)目外，陽性（或陰性）細菌所占的比例（一般以%表示） 也是重要的表達方式。浮游細菌群落根據(jù)這些指標得出的陽性和陰性數(shù)目的比值被統(tǒng)稱為這個細菌群落的生理狀態(tài)（Howard-Jones et al，2001；Del Giorgio et al，2008；Falcioni et al，2008；Hammes et al，2011） 或 代 謝 活 性（Martin et al，2008）。因為每個指標都是細菌生理狀態(tài)的一個方面，所以學者們建議同時測定幾個不同的指標來描述細菌群落的生理狀態(tài)（Smith et al，2003；Hammes et al，2011）。

以上細菌生理指標的測定方法都有各自的問題，因此它們在浮游細菌中的應(yīng)用受到多方面的制約，有的方法技術(shù)復(fù)雜（如放射自顯影技術(shù)），有的依靠人眼觀察，人眼的敏感度和個體差異會對結(jié)果造成影響，所以這些方法在浮游細菌研究中的應(yīng)用普及程度不一樣。由于熒光染料與流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）的結(jié)合，流式細胞術(shù)方便快捷的單細胞分析優(yōu)勢使得三個指標的檢測技術(shù)在浮游細菌生理狀態(tài)研究中得到較為廣泛的應(yīng)用，包括細菌存活狀態(tài)異質(zhì)性的細胞膜完整性檢測、代謝活性異質(zhì)性的CTC （5-氰基-2，3-二（4-甲基苯基） 四唑氯化物，5-Cyano-2，3-di-（p-tolyl）tetrazolium chloride）活性檢測和細菌細胞內(nèi)化學組成異質(zhì)性的核酸含量檢測（Gasol et al，2000；Joux et al，2000；Sherr et al，2001；Czechowska et al，2008）。早期的研究大多只測定其中一個或兩個指標，隨著認識的深入和技術(shù)裝備的更新，近年來越來越多的研究同時測定這三個指標（Gasol et al，2009；Morán et al，2009；2011；Franco-Vidal et al，2011；Lefort et al，2014；Huete-Stauffer et al，2015；Baltar et al，2016；Luis et al，2019）。雖然國外學者已經(jīng)進行了大量的研究，我國在這方面的研究卻非常少，本文綜述了采用流式細胞術(shù)進行細胞膜完整性、CTC 活性和核酸含量檢測三項細菌異質(zhì)性研究的成果，為我國的相關(guān)研究提供參考。

2 浮游細菌的細胞膜完整性檢測

細胞膜完整性檢測采用NADS （核酸雙染色，nucleic acid double-staining） 方 法（Grégori et al，2001），基于熒光染料對細胞膜的穿透性不同進行檢測，原理是使用兩種熒光染料對細菌的核酸進行染色，綠色熒光染料SYTO 9 或SYBRGreenI 可以透過完整和不完整的細胞膜，使細菌呈現(xiàn)綠色熒光；紅色熒光染料PI（碘化丙啶，propidium iodide）由于分子較大，僅能穿過不完整的細胞膜，而且PI 與核酸的結(jié)合能力強于SYTO 9 或SYBRGreenI，削弱細菌的綠色熒光，使具有不完整細胞膜的細菌呈紅色熒光。計數(shù)具有不同顏色熒光的細菌即可分別得到樣品中具完整細胞膜和不完整細胞膜的細菌數(shù)目，細胞膜完整的細菌不絕對是活的，但是細胞膜不完整的細菌肯定是死的或受傷的。這個方法由Boulos 等（1999）最先與落射熒光顯微鏡結(jié)合使用，隨后Barbesti 等（2000）結(jié)合雙染色與流式細胞術(shù)對純培養(yǎng)菌株進行檢測，Grégori 等（2001）將流式細胞術(shù)用于自然海水和淡水細菌的研究中，并將這種方法命名為NADS。Falcioni 等（2008）證明了NADS 方法可以探測自然環(huán)境中細菌的死亡，并探索了NADS 方法用于浮游細菌的技術(shù)細節(jié)，Nescerecka 等（2016）對不同作者的技術(shù)細節(jié)的效果進行了比較，并提出了完整的實驗流程，標志著這一技術(shù)已經(jīng)比較成熟，NADS 的結(jié)果常用活細胞百分比例來表示。

海洋中使用NADS 方法進行的細菌存活狀態(tài)調(diào)查大多局限于幾個近岸淺海區(qū)，包括地中海西北部近岸海區(qū)（Grégori et al，2001；Alonso-Sáez et al，2006；Falcioni et al，2008；Lekunberri et al，2012；Ruiz-Gonzalez et al，2012；Lefort et al， 2014；Gomes et al，2015），大西洋比斯開灣（Morán et al，2009；Huete-Stauffer et al，2015）、美國馬薩諸塞州的Waquoit 灣河口（Morán et al，2011），南大洋的南極半島海域（Ortega-Retuerta et al，2008），北冰洋的卡拉海（Mosharova et al，2016；2017）。深海大洋海域的研究僅有地中海（Lasternas et al，2010）和大西洋的加納利群島附近 （Gasol et al， 2009； Baltar et al， 2010；Lasternas et al，2014），其中Gasol 等（2009） 和Baltar 等（2010）進行了深海采樣（＞1 000 m），其他研究僅采集200 m 以淺水樣。此外，學者們還在比斯開灣進行了晝夜變化（Lefort et al，2014） 以及周年和季節(jié)變化研究（Morán et al，2009；Huete-Stauffer et al，2015）。

根據(jù)這些調(diào)查，在表層海水中，活的細菌在總細菌豐度中占優(yōu)勢，其比例介于50%～90%之間，大洋和近岸海區(qū)沒有差異?；罴毦呢S度比例隨水深增加而下降，Gasol 等（2009）發(fā)現(xiàn)大西洋加納利群島附近海域活細菌的豐度比例從200 m 的40%～70 %降低為1 000 m 的10 %～40 %，Baltar 等（2010）在同一海區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)活細菌的豐度比例從表層的70%～79%降低為2 000 m 的25%～60%。在地中海西部到東部的一個斷面，Lasternas 等（2010）發(fā)現(xiàn)在一定溫度范圍（5 ℃～25 ℃）內(nèi)，活細菌的豐度比例與溫度呈負相關(guān)，隨溫度升高而降低。對比斯開灣的季節(jié)變化研究表明，夏季活細菌有較高的比例和生長率（Morán et al，2009；Huete-Stauffer et al，2015），而從晝夜變化上看活細菌豐度比例沒有明顯的變化（Lefort et al，2014）。

水文現(xiàn)象和生物過程對活細菌比例有一定影響，如：中尺度渦區(qū)域的活細菌比例高于渦的外部（Baltar et al，2010）；在北冰洋卡拉海的一個河口，活細菌比例隨鹽度（4.4～28.5） 增加而增加（Mosharova et al，2016）；在加納利群島海域的調(diào)查表明，當浮游植物死亡時，浮游植物向細胞外釋放的有機物增加，活細菌比例從60%上升到95%（Lasternas et al，2014）。學者們通過圍隔實驗研究影響活細菌比例的因素，添加營養(yǎng)鹽誘發(fā)水華會導(dǎo)致活細菌比例增加（Lasternas et al，2014；Baltar et al，2016），其主要原因為細菌的存活需要DOM（溶解有機物），而浮游植物發(fā)生水華時會向水體釋放大量DOM；此外培養(yǎng)實驗表明光照對活細菌比例的影響有季節(jié)性，夏季活細菌比例會降低，其他季節(jié)則影響不大（Alonso-Sáez et al，2006；Ruiz-Gonzalez et al，2012）。

3 浮游細菌的CTC 活性檢測

細菌的呼吸需要FTS （電子傳遞系統(tǒng)），CTC是一種可以滲透細胞膜的熒光染料，在海水中加入CTC 后，有活躍FTS 的細菌會還原CTC，在細菌細胞內(nèi)形成并積累具有紅色熒光的CTF（甲，CTCformazan）結(jié)晶（Rodriguez et al，1992；Schaule et al，1993），這些細菌被稱為CTC+（CTC 陽性，即活躍呼吸）的細菌（Rodriguez et al，1992）。

20 世紀90 年代中期，Gasol 等（1995） 和Lovejoy 等（1996） 首先用表面熒光顯微鏡檢測CTC 活性，隨后Kaprelyants 等（1993）用流式細胞術(shù)來分辨實驗室培養(yǎng)細菌的CTC 活性，Del Giorgio 等（1997）和Sieracki 等（1999）則將這種方法應(yīng)用于自然湖水和海水中的浮游細菌研究。

CTC 活性檢測方法是將CTC 加入含細菌的自然海水中進行培養(yǎng)，使得細菌吸收CTC 生成CTF，因此CTC 的濃度和培養(yǎng)時間是該方法的關(guān)鍵，不同的研究者使用了不同的培養(yǎng)濃度、時間。目前對于濃度已經(jīng)有了比較一致的看法，即加入海水中的CTC 的最佳終濃度為5 mmol/L，低于這個濃度得出的CTC+比例會偏低，例如Lovejoy 等（1996） 用的濃度為0.75 mmol/L，CTC+細菌的比例為1 %～2 %，這個比例被認為過低。CTC 培養(yǎng)所需水樣體積很小，只用0.5～1.5 mL 室溫培養(yǎng)即可，紅色熒光在加入CTC 后立刻產(chǎn)生（Gasol et al，2007），10 min 后就可以進行檢測，隨著這個結(jié)晶的體積增大，熒光強度也相應(yīng)增強，1 h 后，紅色結(jié)晶的數(shù)目不再增長（Gasol et al，2007），50 min 的培養(yǎng)即可得出較準確的CTC+細菌比例，此后，雖然CTC+細菌的數(shù)目不再增加，但是紅色熒光的強度還會一直增強，甚至能持續(xù)10 h（Gasol et al，2007）。

CTC+檢測方法也有一定的局限性，并非所有細菌都能夠利用CTC，雖然Sherr 等（1999）在海洋中分離的菌株都能降解CTC，但是其他生境，例如人體內(nèi)（Smith et al，1997）、厭氧環(huán)境（Bhupathiraju et al，1999）、地下水（Hatzinger et al，2003）、河流（Yamaguchi et al，1997）的證據(jù)表明有些細菌不降解CTC，所以海洋中也很可能存在不降解CTC 的細菌。CTC+細菌與其他細菌狀態(tài)的指標也有對比實驗，例如Karner 等（1997）發(fā)現(xiàn)CTC+細菌的數(shù)目低于顯微放射自顯影技術(shù)得出的活躍細菌數(shù)目。

CTF 晶體在細菌細胞內(nèi)累積可能會導(dǎo)致細菌破裂，使得CTF 釋放到水體中。Gasol 等（1995）在用表面熒光顯微鏡觀察時，注意到細菌細胞外也有CTF 顆粒，Gasol 等（2007）用SYTO13 對CTC 培養(yǎng)的細菌染色，用流式細胞術(shù)分別計數(shù)紅色和綠色（SYTO 13+）熒光顆粒，發(fā)現(xiàn)細菌破裂后釋放到海水里的CTF 結(jié)晶用流式細胞儀仍能檢測到，會被認為是一個細菌。

多項研究表明CTC 或CTF 對細菌具有毒性，例如：CTC 染色后細菌放射性標記的生長率和呼吸率分別降低了1%～14%和4%～44% （Ullrich et al，1996），用熒光細菌進行的毒性測試表明濃度為0.1～5 μmol/L 的CTC 在15 min 后熒光減少50%～100 % （Ullrich et al，1996）；加入5 mmol/L 的CTC 培養(yǎng)30 min 后，細菌的豐度平均減少22 %（Gasol et al，2007）；加入CTC 后，細菌的運動停止（Grossart et al，2001）。Gasol 等（2007） 認為CTC 作為外來物質(zhì)對細菌肯定產(chǎn)生影響，但其毒性可能很低，因為加入CTC 數(shù)小時后，CTC+細菌的數(shù)目不再增加，但是單個細菌中的CTF 熒光強度還在增加，說明仍有細菌降解CTC （Del Giorgio et al，1997），細菌并沒有被立即殺死。由于毒性要在細菌吸收和降解CTC 后才能發(fā)生，所以CTC的毒性對CTC+陽性的檢測數(shù)據(jù)沒有影響，CTC+測試是有效的。

對于CTC+細菌對細菌代謝的貢獻有兩種截然不同的觀點：第一種觀點認為CTC+細菌是細菌代謝的主要貢獻者，例如Smith （1998）發(fā)現(xiàn)雖然切薩皮克灣CTC+細菌比例平均只有14 %，但是CTC+細菌豐度和占總細菌數(shù)的比例都與細菌群落呼吸有很好的相關(guān)性；Sherr 等（1999）發(fā)現(xiàn)CTC+細菌是放射性標記物的主要吸收者。第二種觀點認為CTC+細菌的貢獻并不那么大，Servais 等（2001）用放射性底物培養(yǎng)來自法國地中海沿岸海水的細菌，然后進行CTC 染色并用流式細胞儀分選出CTC+細菌，測定其放射性標記的量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與總細菌的放射性標記相比，CTC+細菌貢獻占總細菌生產(chǎn)的比例＜60 %；Longnecker 等（2005）使用同樣的方法得出在美國俄勒岡外海CTC+細菌貢獻了總細菌生產(chǎn)的7 %～14 %。然而，Gasol 等（2007） 研究認為第二種觀點把釋放在水體中的CTF 顆粒也作為細菌進行了分選，導(dǎo)致CTC+細菌的放射性結(jié)果偏低。

CTC+細菌比例的測定最初于1995 年應(yīng)用于浮游細菌研究中（Gasol et al，1995），目前有CTC+調(diào)查資料的海區(qū)包括地中海的布拉內(nèi)斯灣（Blanes Bay） （Gasol et al，1995；Baltar et al，2016）、比斯 開 灣（Morán et al，2009；Franco-Vidal et al，2011；Huete-Stauffer et al，2015）、亞得里亞海（Paoli et al，2006）、法國近岸海域（Bernard et al，2000），大西洋的切薩皮克灣（Smith，1998）、北卡羅來納州外海陸架區(qū)（Sherr et al，2002）、馬薩諸塞州的Waquoit 灣河口（Morán et al，2011）、加拿大的圣勞倫斯灣（Lovejoy et al，1996；2000）、新斯科舍（Nova Scotia）近海（Lovejoy et al，2000）、波羅的海（Schumann et al，2003）、葡萄牙的阿威羅（Ria de Aveiro） 海灣（Almeida et al，2001）、加納利群島附近海域（Gasol et al，2009）、塞內(nèi)加爾近岸海域（Gasol et al，2009），太平洋的俄勒岡州 外 海（Choi et al，1996；Sherr et al，1999；Longnecker et al，2005）、加利福尼亞州圣莫尼卡灣（Santa Monica Bay） （Karner et al，1997），其他海區(qū)還包括澳大利亞塔斯馬尼亞外海（Davidson et al，2004）、北冰洋的卡拉海（Mosharova et al，2016；2017）和南大洋海冰（Martin et al，2008）等。

以上現(xiàn)場調(diào)查表明CTC+細菌比例一般低于10 %，內(nèi)陸架海區(qū)比外陸架海區(qū)高（Sherr et al，2002），極地CTC+細菌比例較高，平均為32%～38 %（Martin et al，2008；Mosharova et al，2017）。在北冰洋卡拉海河口，CTC+細菌比例隨鹽度（4.4～28.5） 增加而增加（Mosharova et al，2016），但在西非塞內(nèi)加爾的河口，CTC+細菌比例在一定范圍內(nèi)隨鹽度升高（0～20）而降低，當鹽度繼續(xù)升高時，CTC+細菌比例增加（Bettarel et al，2011）。CTC+細菌比例垂直分布基本為表層高、深層低，在加納利群島附近海域表層CTC+細菌比例為5%～10%，底層1 000 m 比例＜5%（Gasol et al，2009），在比斯開灣夏季表層CTC+細菌比例高，冬季上下混合均勻（Franco-Vidal et al，2011），在北卡羅來納州外海陸架區(qū)（Sherr et al，2002）和俄勒岡州外海（Longnecker et al，2005），200 m 以淺水柱內(nèi)CTC+細菌比例的垂直分布沒有明顯規(guī)律。對于CTC+細菌比例的季節(jié)和周年變化的研究很少，在比斯開灣CTC+細菌占總細菌比例周年平均為3.6%，最高值出現(xiàn)在4 月，達12 %（Morán et al，2009），而在比斯開灣另一個海區(qū)，最高值（12%） 出現(xiàn)在夏季（Franco-Vidal et al，2011）。

CTC+細菌比例可能受其攝食者鞭毛蟲豐度的影響，CTC+細菌比例與異養(yǎng)鞭毛蟲在鞭毛蟲總豐度的比例相關(guān)，異養(yǎng)鞭毛蟲在鞭毛蟲總豐度中的比例高時，CTC+細菌比例降低，說明異養(yǎng)鞭毛蟲選擇攝食活躍的細菌（Lovejoy et al，1996；2000），Del Giorgio 等（1996）的培養(yǎng)實驗也支持這一觀點。

4 浮游細菌的核酸含量檢測

根據(jù)核酸染色后的熒光強度可估算浮游細菌的核酸含量。早期研究中，熒光的強弱在高分辨率熒光顯微鏡下即可分辨（Sieracki et al，1992），Li 等（1995）最先使用流式細胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)根據(jù)散射信號（SSC，side scatter，與細胞的密度相關(guān)）和綠色熒光的相對強度（與細胞的核酸含量有關(guān)），將浮游細菌在流式圖上分為核酸含量不同的群，這種分群現(xiàn)象在淡水和海水、寡營養(yǎng)和富營養(yǎng)水體都有，因此是浮游細菌群落的普遍特征（Bouvier et al，2007）。

對這些不同核酸含量的細菌分群的用詞不同，Li 等（1995）稱它們?yōu)榻M（group），Gasol 等（1999）稱它們?yōu)閬喨海╯ubpopulations），此外也有研究稱它們?yōu)閬喗M（subgroup） （Gasol et al，2000）。在自然海水樣品中，浮游細菌經(jīng)核酸染色大多被分為兩群，通常稱為HNA（高核酸含量群，high nucleic acid）和LNA（低核酸含量群，low nucleic acid） （Lebaron et al，2001），有的研究在HNA 和LNA 之外還有VHNA（極高核酸含量群，very high nucleic acid） （Nishimura et al，2005；Girault et al，2015；Dhib et al，2017）。

用流式細胞儀分選HNA 和LNA 細胞進行分子生物學測序，不同的學者得出了相互沖突的結(jié)論：有的認為HNA 和LNA 在系統(tǒng)發(fā)生上類群組成沒有區(qū)別（Bernard et al，2000；Servais et al，2003；Longnecker et al，2005），而有的研究認為HNA 和LNA 在系統(tǒng)發(fā)生上的類群組成是不同的或有的分類類群在一個核酸類群中占主導(dǎo)，例如LNA 主要與SAR11 類群和SAR86 類群有關(guān)，HNA 則主要與γ-變形菌、紅細菌目、SAR116 類群和擬桿菌門有關(guān)（Filers et al，2000；Fuchs et al，2000；Zubkov et al，2001；2002；Fuchs et al，2005；Mary et al，2006；Schattenhofer et al，2011；Vila-Costa et al，2012）。

有浮游細菌分群研究資料的海區(qū)包括地中海西北部近岸（Gasol et al，1999；Joux et al，2005；Gomes et al，2015）、直布羅陀到塞浦路斯的斷面（Van Wambeke et al，2011）、亞得里亞海（antiet al，2014）、突尼斯海岸潟湖（Dhib et al，2017）、大西洋的加拿大近岸海區(qū)（Jellett et al，1996）、美國的馬里蘭近岸（Bouvier et al，2007）、拉布拉多海（Li et al，1995）、墨西哥灣（Jochem，2001；Jochem et al，2004）、西班牙比斯開灣（Calvo-Díaz et al， 2006； Morán et al， 2009； García et al，2014）、加納利群島附近海域（Gasol et al，2009）、波羅的海河口區(qū)（Kaartokallio et al，2016）、太平洋的俄勒岡外海（Bouvier et al，2007）、北加州外海（Sherr et al，2006）、在北太平洋12 °N-34 °N經(jīng)向斷面（Girault et al，2015）、臺灣淺灘（Jiang et al，2017）、南大洋德雷克海峽（Corzo et al，2005）、普利茲灣（Ortega-Retuerta et al，2008）、澳大利亞南部阿德萊德近岸站位（Schapira et al，2009）、澳大利亞南部大陸架上升流區(qū)（Paterson et al，2012）、北極海區(qū)加拿大富蘭克林灣（Belzile et al，2008）等海區(qū)。

自然海區(qū)浮游細菌中，HNA 的DNA 含量大大高于LNA，約為后者的4～6 倍（Li et al，1995；Jellett et al，1996；Sherr et al，2006；Bouvier et al，2007），HNA 和LNA 兩群熒光的平均值成正比，即當LNA 的熒光值增加時，HNA 的熒光值也增加（Bouvier et al，2007）。自然海區(qū)中HNA% （HNA豐度占總細菌豐度的百分比）大多介于30%～90%之間，表層的比例隨營養(yǎng)程度的升高而升高，例如濱海濕地高于海洋（Bouvier et al，2007），近岸區(qū)高于陸坡和大洋區(qū)（Sherr et al，2006），澳大利亞南部大陸架上升流區(qū)HNA% （84 %～93 %）高于其他區(qū)域（36 %～43 %） （Paterson et al，2012），在南海臺灣淺灘赤潮區(qū)域HNA%介于63%～78%，高于非赤潮區(qū)域（38%～57%） （Jiang et al，2017）。Li 等（1995）發(fā)現(xiàn)不同的海洋生境中HNA%與葉綠素a 濃度成正相關(guān)，說明HNA%隨著有機物供給的增多而上升。HNA%與葉綠素a 有關(guān)，因此海水的生產(chǎn)力也可能與此有關(guān)，但是葉綠素a 濃度很高和很低的海區(qū)也會出現(xiàn)相近的HNA%，說明除生產(chǎn)力之外還有其他影響因素（Bouvier et al，2007）。

在近岸海區(qū)（200 m 以淺） 的垂直分布調(diào)查中，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)程度高的表層HNA%低于營養(yǎng)程度低的底層（Jochem，2001；Calvo-Díaz et al，2006；Belzile et al，2008），這與Li 等（1995）的觀點不同（Jochem et al，2004），原因尚不清楚。在大洋中，HNA%在水深200 m 以淺的垂直分布中稍有增加但沒有明顯規(guī)律（Gasol et al，2009；Van Wambeke et al，2011；Girault et al，2015），在地中海自200 m 以深HNA %隨深度增加而升高，從0～250 m 的30 %～50%升高至3 300 m 的50 %～70 %（Van Wambeke et al，2011），在加納利群島附近，從0～1 000 m 沒有變化（Gasol et al，2009）。在紅海中部，在200 m 以淺是LNA 占主導(dǎo)，在200 m 以深是HNA 占主導(dǎo)（Calleja et al，2018）。在東北大西洋深水中，從70°N-30°N，HNA%降低，再到10°S，HNA%稍微升高（Reinthaler et al，2013）。近岸海區(qū)HNA%隨鹽度變化的研究較少，在法國地中海沿岸羅納河口，鹽度變化范圍在15～36 之間，HNA%在40%～80%之間，隨鹽度變化在不同的調(diào)查沒有明顯的規(guī)律（Joux et al，2005）。

表層HNA%的季節(jié)變化一般為春季和冬季比例大，夏季比例小，如西班牙比斯開灣（Calvo-Díaz et al，2006） 和 亞 得 里 亞 海（?antiet al，2014），在北極貝福特陸架的富蘭克林灣HNA%春季比冬季更高（Belzile et al，2008），而深水HNA%沒有明顯的季節(jié)變化（Belzile et al，2008；Calvo-Díaz et al，2006）。對影響HNA%的因素目前所知甚少，實驗操作中升溫培養(yǎng)可以使細菌核酸含量降低（Huete-Stauffer et al，2015），此外不同浮游植物釋放的DOC 會影響HNA%（Tada et al，2016），HNA 對浮游植物水華的反應(yīng)比LNA 明顯（Gomes et al，2015）。

流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)可根據(jù)核酸含量把水體細菌分為兩群后，這兩群細菌在活性上的差異立即引起關(guān)注，Li 等（1995）發(fā)現(xiàn)HNA 的分布和DNA 含量與水體葉綠素a 濃度具有相關(guān)性，所以推測HNA是活躍細菌，而LNA 是不活躍細菌。Jellett 等（1996） 提出了ACI（活躍細胞指數(shù)，active cell index） 概念，即HNA 占總細菌豐度的比例，與HNA%概念相同，他們發(fā)現(xiàn)ACI 與細菌生產(chǎn)力的變化趨勢一致，認為ACI 可以表征細菌群落的活躍程度。

但是HNA 和LNA 是否活性不同仍需要直接的證據(jù)。第一項證據(jù)來自生長率培養(yǎng)實驗，Gasol 等（1999）發(fā)現(xiàn)稀釋培養(yǎng)實驗中HNA 有較高的生長率，而LNA 生長率較低，所以認為HNA 是活躍細菌，LNA 是不活躍或死細菌，Vaqué 等（2001）同樣支持這個觀點，但是也有培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)LNA 有較高的生長率，并非是不活躍的細菌（Jochem et al，2004；Zubkov et al，2004；Sherr et al，2006）。另外的直接證據(jù)來自兩類細菌對放射性標記底物的吸收能力的比較，有研究發(fā)現(xiàn)HNA 能夠活躍吸收底物（Lebaronetal，2001；2002；Servaisetal，2003），所以是HNA 是活躍細菌；但是也有一些研究發(fā)現(xiàn)LNA 的活性和HNA 相當，在單位細菌體積比較時甚至超過HNA（Zubkov et al，2001；Longnecker et al，2005；Mary et al，2006；Scharek et al，2007；Wang et al，2009；Longnecker et al，2010；Talarmin et al，2011；Huete-Stauffer et al，2012），HNA 類群中的細菌的活性也不盡相同（Moran et al，2007）。由于生長率和對底物的吸收能力的實驗都得出了矛盾的結(jié)果，目前普遍認為LNA 和HNA 的劃分不能作為細菌是否活躍的指示，HNA比LNA 活躍一些，但是LNA 中也有一些細菌是活躍的，能吸收有機底物并表現(xiàn)出一定的生長。

5 浮游細菌異質(zhì)性研究指標間的關(guān)系

目前已有相當多的研究分別使用不同的指標報道了浮游細菌的異質(zhì)性，主要包括NADS 法研究細菌存活狀態(tài)異質(zhì)性、CTC 法研究細菌的代謝狀態(tài)異質(zhì)性，以及HNA/LNA 法研究細菌的化學組成異質(zhì)性，但對不同指標之間的關(guān)系研究相對較少。采用NADS 法檢測時觀測到活細菌比例通常大于HNA 比例，這意味著LNA 不全是死細菌，例如在南極半島海區(qū)，61%的細菌是活的，這其中約45%的細菌屬于HNA，也就是說有16%的活細菌屬于LNA（Ortega-Retuerta et al，2008）。空間分布方面，在加納利群島附近海域三者的垂直分布變化趨勢并不一致（Gasol et al，2009）。在同一海區(qū)的周年變化中，這些指標的變化也不同步，例如在地中海西北部海區(qū)，HNA %在3 月最高，但是活細菌比例在9 月最高（Gomes et al，2015）；在比斯開灣，HNA %和CTC+細菌比例周年變化較為一致，但是活細菌比例則與這兩項指標不一致（Morán et al，2009）；在地中海西北部，CTC+細菌比例與HNA %的日變化趨勢一致（Lefort et al，2014）；在圍隔實驗中，NADS 和HNA%的變化趨勢相似，而CTC+細菌比例變化與前兩者不一致（Baltar et al，2016）。

6 小結(jié)與展望

浮游細菌能夠有效吸收和轉(zhuǎn)化海洋生態(tài)系統(tǒng)中的DOM，快速響應(yīng)物理化學梯度等環(huán)境因素的變化，對其生理狀態(tài)研究的重要性顯而易見。我國在相關(guān)方面的研究較為缺乏，主要包括好氧不產(chǎn)氧光合異養(yǎng)細菌的膜電位研究（Jiao et al，2004）、臺灣淺灘和珠江口的HNA %研究（Xu et al. 2013；Jiang et al，2017；李祥付 等2018）等，在淡水中也有浮游細菌生理狀態(tài)的報道（Liu et al，2016）。

目前的研究集中在近岸海域，大洋深海和極區(qū)的資料較少，長期變化、全球變暖、酸化等其他影響因素影響下浮游細菌生理狀態(tài)的變化研究亟須加強：

（1）目前對浮游細菌生理狀態(tài)的調(diào)查主要集中在近岸海域，在大洋和深海的資料很少，2 000 m水深以下幾乎沒有資料，在如此廣闊的水域中浮游細菌生理狀態(tài)如何，從近岸海區(qū)至大洋是如何過渡的，在深海全水深調(diào)查中細菌的生理代謝活性是如何垂直變化的，這些問題亟須得到解釋。

（2） 光強也可能對細菌的生理狀態(tài)有影響，目前僅在中緯度（41°N）的地中海Blanes 海灣進行過研究（Alonso-Sáez et al，2006；Ruiz-Gonzalez et al，2012；Lefort et al，2014）。低緯度海區(qū)的光強是否會降低細菌的生理狀態(tài)，夏季能影響到多深，影響的時間有多長，是否存在晝夜變化，也需要繼續(xù)研究。

（3）浮游細菌生理狀態(tài)周年變化僅在比斯開灣（Morán et al，2009；Huete-Stauffer et al，2015）、亞德里亞海（?antiet al，2014）和北極的貝福特陸架的富蘭克林灣（Belzile et al，2008）有研究報道，數(shù)據(jù)還十分缺乏，難以總結(jié)其變化規(guī)律，應(yīng)選擇代表性海域進行深入的周年變化調(diào)查。

（4）海洋酸化和全球變暖已嚴重威脅到海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及生物多樣性。在這一背景下，可以通過調(diào)節(jié)升溫梯度和pH，研究全球變暖和酸化對浮游細菌生理狀態(tài)的影響。