張寧 邱佳 張安龑 宮路路

(1遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,貴州 遵義 563000；2遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球第五大最常見的惡性腫瘤〔1〕。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，全球每年新發(fā)HCC病例超過78萬，其中我國約占50%〔2〕。肝癌也成為第二大致死癌癥，5年生存率低于20%〔3，4〕，原因在于大多數(shù)患者在確診時已屬中后期或晚期。盡管臨床上有些藥物已被用來治療HCC，但是整體效果欠佳，易出現(xiàn)副作用〔5〕。靈芝是一種高效的抗肝癌中藥材，可增強人體免疫力，調(diào)節(jié)血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護肝等作用，硒多糖是靈芝中的一種重要藥用成分，并在靈芝抗肝癌過程中扮演了十分重要的角色，但硒多糖的抗肝癌機制尚不清楚。

1 材料和方法

1.1實驗材料、器材和試劑 細(xì)胞操作間、液氮罐、高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、玻璃平皿、移液器、細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、96孔板、6孔板、低速離心機、EP管、干式變性儀，電泳、轉(zhuǎn)膜等相關(guān)設(shè)備，膠片；顯影液、定影液，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑，抗生素，低糖的DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，MTT試劑，二甲基亞砜(DMSO)，硒多糖，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白抗體(CST)如Caspase-3、Caspase-9等。硫氧還蛋白(Trx)-1一抗、β-actin及二抗(Santa Cruz)。

1.2細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)及藥物濃度 本實驗所用人HCC細(xì)胞株HepG2購買于中國科學(xué)院昆明動物研究所。HepG2細(xì)胞用低糖的DMEM培養(yǎng)基在37℃含有5%CO2和95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基含有10%熱滅活的胎牛血清和抗生素(100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。當(dāng)細(xì)胞生長密度在75%左右時加藥處理。用新鮮DMEM培養(yǎng)基配制不同濃度的實驗藥物溶液。濃度效應(yīng)實驗藥物濃度設(shè)為0、50、100、200、400 μg/ml，作用時間24 h。

1.3MTT法檢測硒多糖對HepG2細(xì)胞活力的影響 將細(xì)胞于生長對數(shù)期消化，離心去掉培養(yǎng)基，然后加入新培養(yǎng)基使其懸浮混勻，并將懸浮均勻的HepG2細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞密度約1×104/ml，每孔100 μl，平行孔為6個為宜，然后每孔再加入不同濃度待測化合物完全培養(yǎng)基100 μl，并放置在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心去上清，每孔加入150 μl的DMSO，置于水平搖床上震蕩使其充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570 nm條件下測定OD值，利用相應(yīng)軟件計算細(xì)胞增殖抑制率。化合物濃度為0、50、100、200、400 μg/ml。

1.4Western印跡檢測硒多糖對HepG2細(xì)胞Trx-1及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 將藥物處理后的細(xì)胞收集離心，去上清，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，再次離心去上清。加入細(xì)胞裂解液裂解。裂解充分后離心取上清，利用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒對待測樣品定量。然后根據(jù)目的蛋白的特性依次是制樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封膜、洗膜、標(biāo)一抗、洗膜、標(biāo)二抗、洗膜、孵育發(fā)光底物和曝光顯影。用Image J軟件對條帶進行分析。

1.5結(jié)果與分析 采用統(tǒng)計分析軟件GraphPad Prism6進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1硒多糖對HepG2細(xì)胞活力的影響 硒多糖能夠使HepG2細(xì)胞活力呈現(xiàn)濃度依賴下降的趨勢，相比于0 μg/ml組細(xì)胞活力(1.00±0.08)，50 μg/ml和100 μg/ml組(1.00±0.11和0.91±0.08)均無顯著變化(P>0.05)；200 μg/ml和400 μg/ml組細(xì)胞活力(0.78±0.04和0.65±0.05)均較其他濃度組出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)。200 μg/ml、400 μg/ml硒多糖刺激時出現(xiàn)細(xì)胞活力較其他濃度顯著下降(P<0.05)。

2.2硒多糖對HepG2細(xì)胞Trx-1表達的影響 隨著硒多糖濃度增高，HepG2細(xì)胞內(nèi)Trx-1表達量不斷降低，200、400 μg/ml硒多糖組Trx-1表達較其他濃度組顯著降低(P<0.01)，見圖1，表1。

2.3硒多糖對HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 隨著硒多糖濃度增高，Caspase-3、Caspase-9的表達量升高，Caspase-3在200 μl/ml時開始出現(xiàn)顯著變化(P<0.01)，Caspase-9在100 μl/ml時開始出現(xiàn)顯著變化(P<0.05)，見表1，圖2。

1～5:0、50、100、200、400 μg/ml硒多糖組，下圖同圖1 硒多糖對HepG2細(xì)胞內(nèi)Trx-1表達的影響

表1 硒多糖對HepG2細(xì)胞內(nèi)Trx-1、Caspase-3和Caspase-9表達的影響

與0 μg/ml組比較：1)P<0.01；2)P<0.05

圖2 硒多糖對HepG2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9表達的影響

3 討 論

HCC的發(fā)病率因地理區(qū)域而異，與各種危險因素有關(guān)，包括乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染、肝硬化(炎癥和纖維化引起的慢性肝損傷)、酗酒、老年、男性、代謝綜合征和黃曲霉毒素B暴露等。盡管目前有些藥物如索菲拉尼在延長HCC患者生存期等方面有一定優(yōu)勢，但因復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、副作用和耐藥性等原因，總體效果不太明顯〔6，7〕。因此，HCC的治療迫切需要更安全有效的新型藥物。

靈芝是我國一種具有悠久歷史的藥用真菌，是一種珍貴的滋補偏方。硒是機體生理活動必需的微量元素之一，在提高機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤方面均發(fā)揮著重要作用〔8〕。硒多糖作為一種有機硒化合物，既保持了多糖較高的生物利用率又具有硒的生物功能，對生物體的毒性大大降低，且活性明顯高于硒和多糖〔9〕。硒多糖具有調(diào)節(jié)健康小鼠免疫功能的作用〔10〕。

Trx-1是一個在動物體內(nèi)廣泛分布的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白〔11〕，Trx-1在多種腫瘤組織中表達增高，與癌癥的關(guān)系密切，具有促進癌細(xì)胞的生長，抑制癌細(xì)胞凋亡作用〔12〕，因此，Trx-1已成為癌癥的治療的一個重要靶點，Trx-1調(diào)控的細(xì)胞凋亡也成為治療腫瘤細(xì)胞生長的一個潛在治療途經(jīng)。細(xì)胞凋亡在正常情況下，在消除受損細(xì)胞以維持體內(nèi)平衡方面發(fā)揮著重要作用。然而，凋亡信號通路的缺陷可以刺激腫瘤發(fā)生，促進癌細(xì)胞存活。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療癌癥的方法之一。Bcl-2家族蛋白和Caspase級聯(lián)在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Bcl-2家族分為抑制凋亡和促進凋亡蛋白兩大類，Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，Bax是線粒體外膜的促凋亡蛋白；它促進凋亡分子的內(nèi)在凋亡釋放〔13〕。在神經(jīng)瘤細(xì)胞中用干擾Trx-1的表達，Bcl-2的表達量明顯下降并且線粒體膜電位改變，Caspase-3被激活，進而激活Caspase-9，促進癌細(xì)胞凋亡〔14，15〕。本實驗顯示Trx-1的表達量降低以后，凋亡相關(guān)蛋白Casepase-3、Caspase-9的表達量升高，也表明硒多糖可能是通過調(diào)節(jié)Trx-1的表達誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)，從而抑制HepG2細(xì)胞的生長。