劉思嘉 劉析璘 黃婷 蘭蕙 葉麗平,2

(錦州醫(yī)科大學(xué) 1病理生理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；2生物人類學(xué)研究所)

肺癌由于臨床癥狀隱匿，腫瘤細胞易通過直接擴散、血行轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移，因此侵襲與轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的主要原因。對于腫瘤發(fā)生和發(fā)展機制的研究，可為提高早期診斷、尋找治療靶點提供必要的理論依據(jù)。胰島素生長因子(IGF)-1是一種具有促生長作用的細胞因子，可與受體結(jié)合，經(jīng)多條信號通路促進細胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)IGF-1與乳腺癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤顯著相關(guān)〔1～3〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9可降解細胞外基質(zhì)和基底膜，與新生血管生成、腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔4〕。上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)，主要維持上皮細胞的形態(tài)和完整性，其表達下降可降低細胞之間的黏附力，促進腫瘤浸細胞侵襲與轉(zhuǎn)移〔5〕。小鼠雙微體擴增基因(MDM)2在多種腫瘤細胞中高表達，可促進腫瘤細胞生長〔6〕。目前，有關(guān)IGF-1調(diào)控肺癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的機制尚不十分清楚。本研究旨在探討IGF-1能否經(jīng)蛋白激酶B(AKT)通路調(diào)節(jié)人肺癌A549細胞MMP-9、E-cadherin和MDM2蛋白的表達及其對細胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1細胞 人肺癌A549細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Corning)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技)；BCA蛋白定量試劑盒；Transwell小室，基質(zhì)膠(美國 BD)；結(jié)晶紫(美國Sigma)；AKT、磷酸化(p)-AKT、MMP-9、MDM2、E-cadherin、β-actin抗體(博奧森)； IGF-1(abbkine)；LY294002(MCE)。

1.3細胞培養(yǎng)及分組 A549細胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)傳代。細胞融合至70%～80%時無血清饑餓過夜。將細胞隨機分成對照組、LY294002組、IGF-1組和IGF-1+LY294002組。IGF-1及 AKT抑制劑LY294002終濃度分別200 ng/ml、20 μmol/L。每組至少重復(fù)3次，培養(yǎng)48 h后檢測。

1.4噻唑藍(MTT)法 將6×107/L細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl 。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，490 nm處檢測OD值，細胞增殖率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5劃痕實驗 3.0×105個細胞接種于6孔板，200 μl槍頭劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)輕洗3次，顯微鏡下拍照，培養(yǎng)48 h后再次拍照。劃痕愈合率=(0 h寬度-48 h寬度)/0 h寬×100%。

1.6Transwell侵襲實驗 消化細胞將細胞濃度調(diào)至5×105/ml。取100 μl 細胞懸液加入基質(zhì)膠包被好的Transwell 上室中，下室加入培養(yǎng)基。48 h后，0.1%結(jié)晶紫繼續(xù)染色15 min，洗去結(jié)晶紫，倒置顯微鏡下取5 個隨機視野觀察記錄細胞數(shù)目并照相。

1.7Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達 收集處理后的細胞，液冰上裂解30 min，離心取上清。BCA蛋白定量后制成蛋白樣品，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，經(jīng)3%BSA封閉后分別，加入一抗(1∶1 000)4℃過夜，加入相應(yīng)二抗(1∶1 000)。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色試劑盒顯色，Image J軟件分析目的蛋白條帶的灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1IGF-1對A549細胞增殖的影響 IGF-1組細胞增殖率明顯高于對照組(P<0.01)。IGF-1+LY294002組的細胞增殖率明顯低于IGF-1組(P<0.01)。見表1。

2.2IGF-1對A549細胞遷移能力的影響 IGF-1組細胞遷移率明顯高于對照組(P<0.01)；與IGF-1組相比，IGF-1+LY294002組的細胞遷移率明顯降低(P<0.01)，見表2，圖1。

2.3IGF-1對A549細胞侵襲能力的影響 IGF-1組細胞侵襲率明顯高于對照組(P<0.01)；與IGF-1組相比，IGF-1+LY294002組細胞的侵襲率顯著降低(P<0.01)，見表2，圖2。

表1 IGF-1對A549細胞增殖能力的影響

與對照組相比:1)P<0.01；與IGF-1組相比:2)P<0.01；下表同

表2 IGF-1對A549細胞、遷移、侵襲能力的影響

圖1 IGF-1對培養(yǎng)不同時間A549細胞遷移能力的影響(×10)

圖2 IGF-1對A549細胞侵襲能力的影響(×10)

2.4IGF-1對A549細胞相關(guān)蛋白的表達水平 與對照組相比，IGF-1組細胞MDM2、MMP-9和p-AKT的蛋白表達水平明顯增高，而E-cadherin蛋白表達降低(P<0.05)；與IGF-1組相比，IGF-1+LY294002組細胞MDM2、p-Akt和MMP-9的蛋白表達顯著降低，而E-cadherin蛋白表達增加(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 IGF-1對A549細胞MMP-9、MDM2、E-cadherin、AKT蛋白表達的影響

圖3 IGF-1對A549細胞MMP-9、MDM2、E-cadherin、AKT蛋白表達的影響

3 討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與其侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。近年來，IGF-1與腫瘤的關(guān)系備受關(guān)注。IGF-1在人類多種腫瘤組織中呈高表達，其通過與受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化。相關(guān)研究表明IGF-1可通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、AKT等多種信號通路誘導(dǎo)上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變(EMT)，促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移〔7，8〕。本研究結(jié)果也證實IGF-1可促進肺癌A549細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，且可被AKT特異性抑制劑所阻斷，提示IGF-1可能通過AKT通路參與腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，這與相關(guān)研究〔9,10〕結(jié)果相一致。

腫瘤細胞突破基底膜是腫瘤侵襲的標志，也是腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。MMP-9是降解細胞外基質(zhì)和基底膜的重要金屬蛋白酶，可促進多種腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移〔11〕。腫瘤細胞間的黏附作用也與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。作為細胞間黏附分子，低表達E-cadherin可促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移〔12,13〕。MMP-9和E-cadherin可相互作用，共同促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。E-cadherin可抑制腫瘤細胞產(chǎn)生MMP-9，下調(diào)E-cadherin可以使MMP-9的表達量增加，進而促進腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移〔14,15〕。MDM2也參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。MDM2通過與抑癌基因p53相互調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用，過表達MDM2可幫助腫瘤細胞逃避抑癌基因?qū)毎纳L調(diào)節(jié)。MDM2也參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)MDM2可促進MMP-9表達，兩者呈正相關(guān)〔16〕。

綜上，IGF可能通過AKT信號通路，上調(diào)MMP-9及MDM2蛋白表達，下調(diào)E-cadherin蛋白表達，進而促進人肺癌A549細胞增殖，侵襲與轉(zhuǎn)移。這提示IGF-1可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移。對IGF-1的深入研究可能為揭示腫瘤的發(fā)生機制提供理論依據(jù)，并為臨床靶向治提供新的靶點。