高靚 潘玥 趙貴捷 徐夢瑤 孟雪

(天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸臨床部 國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學)

缺血性腦卒中發(fā)病機制多樣，現(xiàn)有的研究雖然已經(jīng)在缺血性腦卒中病理機制方面取得進步，但基礎研究成果依然無法向臨床轉(zhuǎn)化，現(xiàn)臨床使用的神經(jīng)保護藥也只是清除氧自由基，治療效果不佳〔1,2〕。使用重組組織型纖溶蛋白酶激活劑靜脈溶栓是腦梗死主要治療手段，但該治療有嚴格的時間窗，存在較高的致命性出血風險，限制應用〔3〕。因此根究缺血性腦梗死具體病理機制，探討一種新型的、合理的、有效的腦梗死治療手段，對挽救缺血半暗帶意義重大。針刺在我國已有多年的應用歷史，研究發(fā)現(xiàn)，針刺用于缺血性腦卒中的治療能夠促進缺血性腦損傷后神經(jīng)功能的重塑與修復，這可能與針刺對腦出血再灌注損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞激活作用有關(guān)〔4〕。但現(xiàn)有的研究多集中于針刺對缺血性腦卒中恢復期的影響，在急性期的使用價值尚未見較多報道。刺絡放血療法是針刺的一種方式，井穴放血治療能夠提高大鼠缺血區(qū)腦組織抗應激能力，有一定的腦保護作用〔5〕。本研究觀察井穴放血對大鼠腦梗死缺血再灌注損傷的腦保護作用。

1 材料與方法

1.1動物 自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購入清潔、健康的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠90只，周齡均為8 w，體重0.24～0.26 kg；平均(0.25±0.01)kg。術(shù)前將大鼠置于安靜的環(huán)境中飼養(yǎng)，5只一籠進行飼養(yǎng)，喂養(yǎng)飼料為全價顆粒，大鼠均在12 h的光照與黑暗周期內(nèi)自由進食飲水。

1.2試劑 北京生物技術(shù)公司提供的水合氯醛，上?；瘜W試劑公司提供的多聚甲醛、枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、3%過氧化氫、過硫酸銨，美國Sigma公司提供的顯色液、一抗稀釋液，石家莊第一制藥廠提供的生理鹽水、無水乙醇、多聚賴氨酸、75%酒精；天津化學試劑三廠提供的異丙醇，北京完達山提供的脫脂奶粉，美國Pierce公司提供的蛋白定量試劑盒、兔抗Caspase-3抗體、羊抗兔抗體等。

1.3實驗主要儀器 美國Stoetling公司提供的51600型腦立體定位儀，山東新華醫(yī)療器械提供YX0602型蒸汽消毒器，日本島津提供VX4200S型動物電子秤、BX63型自動顯微鏡掃描儀、離心機、各顯微手術(shù)器械，黃石恒豐醫(yī)療器械提供的恒溫器，北京醫(yī)療器械廠提供的石蠟切片、外科手術(shù)各器械、微量移液器，日本Sanyo公司提供的超聲波細胞碎破儀，石家莊醫(yī)療器械提供的恒溫水浴箱、干燥箱、超聲工作臺、培養(yǎng)箱、混合器，上海醫(yī)療器械廠提供的恒溫烤片機、DYY-12型電泳儀與DYCZ-24DN型電泳槽，北京中山生物提供的多功能酶標儀，德國Eppendorf公司提供的微量移液器，美國Syngene公司提供的超低溫冰箱，北京六一儀器提供的制冰機，美國Imaging公司提供的圖像分析系統(tǒng)，日本OLYMPUS提供的數(shù)碼相機。

1.4模型建立與分組 實驗開始前使用抽簽法對90只大鼠進行隨機分組，假手術(shù)組、模型組、井穴放血0、1、3、6 h組各15只。其中假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅僅分離其右側(cè)大腦中動脈，不將線栓插入；模型組麻醉后向右側(cè)大腦中動脈插入線栓阻塞血管，并在1 h后將線栓拔出，血流恢復，成功制備大腦中動脈阻塞大鼠模型；井穴放血各組采用與模型組相同的方法制備大腦中動脈阻塞模型，并分別于梗死缺血再灌注后0、1、3、6 h，給予井穴放血治療，治療時間均為3 d。處理均符合《關(guān)于善待實驗動物指導性意見》〔6〕中相關(guān)意見。

1.5井穴放血 選穴：選擇位于大鼠兩側(cè)前肢趾端井穴，每側(cè)選擇穴位6個，包括少商、中充、少沖、商陽、關(guān)沖、少澤，使用1.7 cm(0.5寸)毫針在各穴位上點刺放血1～3滴。

1.6神經(jīng)功能損傷 采用Longa評分法評價大鼠的神經(jīng)功能損傷情況〔7〕，0分：肢體功能正常；1分：提尾實驗前肢無法完全伸直；2分：行走時有癱瘓情況，肢體向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：大鼠癱瘓，站立時向肢體癱瘓側(cè)摔倒；4分：大鼠無法站立行走，有意識障礙。分值越高提示神經(jīng)功能損傷越嚴重。

1.7梗死面積 大鼠均給予水合氯醛致死量腔內(nèi)注射，將腦取出置于緩沖液中3 min，后將腦轉(zhuǎn)至腦切片機內(nèi)切片，規(guī)格為1 mm，并浸入2%2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)中5 min。切片置于10%甲醛溶液內(nèi)，4℃過夜。TTC屬于物色染料，經(jīng)該染色后健康的組織呈紅色，反之無染色為梗死區(qū)。掃描儀掃描采集圖像，經(jīng)圖像分析軟件分析比較，為保證結(jié)果的可比性，應取各大鼠相同部位腦組織腦片，經(jīng)掃描后的白色區(qū)域判定為壞死核心區(qū)，各切片梗死面積檢測3次，取平均值。注意測量期間任一無法確定梗死的區(qū)域均不納入。

1.8其他腦組織相關(guān)指標表達 制作石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元水腫及壞死情況；經(jīng)免疫組化測定大腦膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性細胞、星形膠質(zhì)細胞中Neun陽性細胞表達及Caspase-3陽性細胞的數(shù)量；同時采用Western印跡測定大鼠CD11b蛋白表達。

1.9統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0軟件行方差檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Longa評分與梗死面積 假手術(shù)組無梗死病灶，無神經(jīng)功能異常與肢體癱瘓；模型組與井穴放血各組均有不同程度梗死病灶、神經(jīng)功能缺損癥狀，其中模型組Longa評分最高、梗死面積最大，后由高至低依次為井穴放血6、3、1、0 h組，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2腦組織主要細胞與蛋白表達 假手術(shù)組GFAP陽性細胞、Caspase-3陽性細胞、CD11蛋白表達均最低，Neun陽性細胞表達最高；后依次為井穴放血0、1、3、6 h組，模型組GFAP陽性細胞、Caspase-3陽性細胞、CD11蛋白表達均最高，Neun陽性細胞表達最低，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組Longa評分與梗死面積、腦組織主要細胞與蛋白表達比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與井穴放血0 h組比較：3)P<0.05；與井穴放血1 h組比較：4)P<0.05；與井穴放血3 h組比較：5)P<0.05

3 討 論

腦梗死是因腦組織血流量灌注減少導致腦神經(jīng)組織凋亡或功能障礙的一種疾病，這類患者神經(jīng)功能障礙主要有視野缺損、反射減退、精神癥狀、麻木等。缺血性腦梗死在全部腦梗死中占比約為85%，主要因大小血管動脈粥樣硬化、心臟起源性栓塞、小血管閉塞、全身低灌注等原因?qū)е隆?〕。目前，缺血性腦梗死的治療除了重組組織型纖溶酶原激活劑的應用之外，尚未發(fā)現(xiàn)其他有效的治療手段能夠扭轉(zhuǎn)或抑制患者腦損傷，且在缺血性腦梗死神經(jīng)保護的相關(guān)研究尚未得到讓人滿意的進展〔9〕?？梢姡毖阅X梗死的早期有效治療依然是臨床研究的難點。

細胞凋亡、壞死、免疫調(diào)節(jié)、炎癥、興奮性氨基酸、氧化應激、營養(yǎng)因子撤退等均是腦缺血級聯(lián)反應發(fā)生的主要機制〔10〕。故針對缺血性腦梗死的發(fā)生發(fā)展有必要找到一種有效的神經(jīng)保護治療手段。腦梗死在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中屬腦中風范疇，中醫(yī)認為瘀血阻絡、脈絡受阻是疾病發(fā)生發(fā)展的基本病因，可導致肢體偏癱、半身不遂等情況，因瘀血阻滯、脈絡閉塞，引起血液循環(huán)不暢，經(jīng)脈氣機無法正常運行，則肢體得不到濡養(yǎng)，故而誘發(fā)肢體麻木、廢痿不同等情況〔11,12〕?？筛鶕?jù)疾病的中醫(yī)發(fā)病機制為其采用祛瘀通絡、通筋活絡的治療原則。放血療法在我國歷史悠遠，《素問·血氣行志》中提到“凡治病因先去其血”，在《針解》中提及了放血療法“苑陳則除之者，惡血出也”，故可以考慮給予腦梗死缺血再灌注損傷患者放血療法治療〔13〕。但目前與之相關(guān)的研究并不多見，特別是在發(fā)病早期的應用更為少見。

放血療法的實施選穴極為關(guān)鍵，本研究中所選十二井穴是十二經(jīng)脈出處最淺之處，是各個經(jīng)絡連接微循環(huán)的連接點，對其進行刺絡放血治療，有著“根有根本，終有終結(jié)”的價值。具體的十二井穴主要指四肢末端井穴，連接了頭面部各個相關(guān)部位，故頭面部、軀干各部位疾病均可以針刺十二井穴治療〔14,15〕。井穴放血治療可以幫助經(jīng)絡內(nèi)瘀阻的瘀血去除，增加脈絡中緩慢流行血流的速度，達到改善缺血再灌注損傷的目的。本研究結(jié)果證實，井穴放血治療對腦梗死缺血再灌注損傷的腦保護價值，且越早對大鼠進行干預，其腦保護效果越好。早期井穴放血治療對腦梗死缺血再灌注損傷帶來的腦保護作用更為理想，這與阮建國等〔16〕研究結(jié)果一致。井穴放血療法對腦梗死后缺血再灌注損傷的腦保護機制可能與細胞內(nèi)鈣離子超載、自由基堆積、興奮性氨基酸毒、炎癥因子異常表達等有關(guān)，興奮性氨基酸在腦缺血發(fā)生時大量釋放，聚集在胞外，因能量缺乏，機體對氨基酸的重攝減少，導致大量鈣離子內(nèi)流，故而加速神經(jīng)細胞的壞死；而在井穴放血治療后，可增加機體對氨基酸的重攝，減少鈣離子內(nèi)流，從而延緩神經(jīng)細胞壞死〔17,18〕。