王 莉，喬 園，穆慶麗，郭 冬△

1.西電集團(tuán)醫(yī)院(西安 710077)； 2.陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

斑禿(Alopecia areata，AA)是一種發(fā)病率較高，在任何年齡階段均可發(fā)生的皮膚科常見疾病，表現(xiàn)為良性、局限性、非瘢痕性的脫發(fā)。根據(jù)其嚴(yán)重程度可分為局限性斑狀斑禿、全禿和普禿[1]。斑禿的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，一般認(rèn)為是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，且與精神神經(jīng)、遺傳因素有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為斑禿屬“油風(fēng)”范疇，主因腎虛不足，氣血虛衰，繼而血瘀、血熱及勞倦情志等所致，此外還應(yīng)注意肝失疏泄至氣機(jī)不暢，繼而氣滯血淤，阻塞毛竅，導(dǎo)致脫發(fā)。中藥治療此疾病有悠久歷史，效果良好[2-5]。地黃養(yǎng)陰顆粒是陜西省中醫(yī)醫(yī)院臨床經(jīng)驗處方，主要由熟地黃、紅花、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂等組成，采用水提，濃縮，加輔料制成的顆粒劑。具有活血生發(fā)，益腎填精功效，臨床使用其治療斑禿多年，且效果良好。本研究通過稱取標(biāo)記區(qū)域毛發(fā)重量、測定微循環(huán)相關(guān)指標(biāo)和碳粒廓清實驗，探討驗證地黃養(yǎng)陰顆粒的主要藥效學(xué)，為臨床用藥服務(wù)。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：(KM)小鼠，SPF級，60只，體重18～22 g，♀♂各半，來源于西安交通大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(陜)2015-003。飼養(yǎng)室溫(24±2)℃，相對濕度40%～60%。實驗動物雌雄分籠喂養(yǎng)，動物自由飲食飲水。動物實驗室保持干凈整潔。

1.2 試劑與藥物：地黃養(yǎng)陰顆粒，陜西省中醫(yī)醫(yī)院自制，批號：190501，含量為每g含生藥0.6 g；口服，每日2次，每次1袋(10 g/袋)，人日用量為1/3 g/kg(體重按60 kg計)。養(yǎng)血養(yǎng)陰膠囊，廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字Z44020913)，批號：Y01014；口服、每次4粒(0.5 g/粒)、每日2次、人日用量約為0.667 g/kg(體重按60 kg計)。印度墨水(Solarbio生產(chǎn))，規(guī)格為100 ml/瓶，批號：20181024。

2 實驗方法

2.1 動物劑量設(shè)計：地黃養(yǎng)陰顆粒小鼠大劑量10 g/kg為人用量(1/3 g)的30倍，中劑量5 g/kg為人用量的15倍，小劑量2.5 g/kg為人用量的7.5倍(分別相當(dāng)于生藥量6、3、1.5 g/kg)。地黃養(yǎng)陰顆粒小鼠用量2 g/kg為人用量的30倍。

2.2 藥物配制：取地黃養(yǎng)陰顆粒10 g加純凈水至20 ml，配成50%的混懸液為大劑量，中小劑量對半稀釋。取地黃養(yǎng)陰顆粒2粒，加純凈水至10 ml，配成10%的混懸液。灌胃體積均為20 ml/kg。

2.3 小鼠毛發(fā)生長實驗：參考文獻(xiàn)方法[6]，各組小鼠均按體重0.2 ml/10g灌胃給藥，第一組為正常對照組灌胃去離子水0.1 ml/10 g，第二組灌胃地黃養(yǎng)陰顆粒2 g/kg，相當(dāng)于人臨床用量30倍，第三至五組分別灌胃地黃養(yǎng)陰顆粒10、5、2.5 g/kg。每日一次，連續(xù)給藥14 d，第15天時對小鼠同一位置相同大小皮膚標(biāo)記，取該區(qū)域毛發(fā)并稱重，記錄為小鼠毛發(fā)重量，繼續(xù)給藥16 d后用同樣方法測得小鼠新生處毛發(fā)的重量，與空白組對比。

2.4 小鼠耳廓微循環(huán)實驗：參考文獻(xiàn)方法[7]，采用實驗1小鼠，給藥前用2%水合氯醛0.2 ml/10 g腹腔注射麻醉實驗小鼠(嚴(yán)格消毒)，背部向上固定在小鼠實驗臺上，使耳廓平展在耳托上，并用苦味酸標(biāo)記耳邊界實驗處，滴加少許液體石蠟在耳托上和耳廓表面，將觀察臺置于BL-420生物機(jī)敏實驗系統(tǒng)顯微載物臺上，調(diào)節(jié)泛光源至適當(dāng)亮度，在10倍鏡下觀察，畫出血管分布草圖(以備下次觀測時找到原測血管部位)，測量其毛細(xì)血管開放量，血流速度(μm/s)，血管輸入口徑(μm)及血管輸出口徑(μm)，實驗當(dāng)天開始給藥，連續(xù)給藥30 d。末次給藥后，測10、20、30 min小鼠原部位的血管開放量、血流速度(μm/s)、血管輸入口徑(μm)及血管輸出口徑(μm)，減去給藥前小鼠的相應(yīng)值即為血管開放量變化值，血流速度變化值，血管輸入及輸出口徑變化值。

2.5 小鼠碳粒廓清實驗：按文獻(xiàn)方法[7]，采用實驗1小鼠，連續(xù)給藥30 d。末次給藥后，尾靜脈注入生理鹽水配制的10%印度墨汁0.1 ml/10 g。在注入2 min和12 min時，分別用微量移液器從小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血20 μl，立刻加入到2 ml 0.1% Na2CO3溶液中，搖勻。試驗結(jié)束后，可見分光光度計，680 nm處以對照管作為空白，分別測定各管OD值。同時取小鼠肝、脾稱重，按下公式計算吞噬指數(shù)κ及校正吞噬系數(shù)α值。吞噬指數(shù)κ=(logOD1-logOD2)/(t2-t1)，α = κ的開立方×體重/(肝重+脾重)。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，在正態(tài)分布且方差齊的情況下對其行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 地黃養(yǎng)陰顆粒對小鼠毛發(fā)生長的影響 見表1。陽性組、地黃養(yǎng)陰顆粒大中劑量14 d可促進(jìn)小鼠毛發(fā)生長(P<0.05)，陽性組、地黃養(yǎng)陰顆粒大中小劑量30 d可明顯促進(jìn)小鼠毛發(fā)生長(P<0.01)。

表1 地黃養(yǎng)陰顆粒對小鼠毛發(fā)生長的影響(g)

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

2 地黃養(yǎng)陰顆粒對小鼠耳廓微循環(huán)的影響 由表2可見陽性組、地黃養(yǎng)陰顆粒大中劑量組可增加小鼠毛細(xì)血管開放量(P<0.05或P<0.01)。由表3可見陽性組、地黃養(yǎng)陰顆粒大中小劑量組可促進(jìn)小鼠毛細(xì)血管血流速度(P<0.01)。由表4可見陽性組、地黃養(yǎng)陰顆粒大中小劑量組可增大小鼠毛細(xì)血管輸入口徑(P<0.05或P<0.01)。由表5可見陽性組、地黃養(yǎng)陰顆粒大中小劑量組可增大小鼠毛細(xì)血管輸出口徑(P<0.01)。因此，地黃養(yǎng)陰顆?？擅黠@改善小鼠耳廓微循環(huán)。

表2 地黃養(yǎng)陰顆粒對小鼠毛細(xì)血管開放量的影響(個)

注：與對照組比較,*P<0.05，△P<0.01

表3 地黃養(yǎng)陰顆粒對小鼠毛細(xì)血管血流速度的影響(μm/s)

注：與對照組比較,*P<0.05，△P<0.01

表4 地黃養(yǎng)陰顆粒對小鼠毛細(xì)血管輸入口徑的影響(μm)

注：與對照組比較,*P<0.05，△P<0.01

表5 地黃養(yǎng)陰顆粒對小鼠毛細(xì)血管輸出口徑的影響(μm)

注：與對照組比較,*P<0.05，△P<0.01

3 地黃養(yǎng)陰顆粒對小鼠炭粒廓清的影響 見表6。陽性組、地黃養(yǎng)陰顆粒大中劑量組可明顯增加小鼠吞噬指數(shù)(κ)和校正吞噬系數(shù)(α)，因此地黃養(yǎng)陰顆?？擅黠@增強(qiáng)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能(P<0.05或P<0.01)。

表6 地黃養(yǎng)陰顆粒對小鼠炭粒廓清能力的影響

注：與空白組比較,*P<0.05 ，△P<0.01

討 論

斑禿是世界性的皮膚問題，發(fā)病率達(dá)到19.9%，我國已超1億，呈年輕化趨勢[8]。中醫(yī)認(rèn)為“發(fā)為血之余，發(fā)為腎之候”，腎藏精，肝藏血，精血互生互化，滋養(yǎng)毛發(fā)，若精血、肝腎不足時，則會出現(xiàn)頭發(fā)干枯或稀疏等癥狀[9]。地黃養(yǎng)陰顆粒為陜西中醫(yī)醫(yī)院制劑，本制劑以治療肝腎不足型斑禿為原則，處方主要由補(bǔ)肝益腎、滋養(yǎng)精血為主，包括熟地黃、紅花、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂等中藥。熟地黃為君藥，補(bǔ)血滋潤，益精填髓?，F(xiàn)代研究證明熟地黃對造血干細(xì)胞亦有一定的增殖、分化作用，且多用于治療斑禿[10]。環(huán)烯醚萜苷類及多糖類為其主要活性成分[11]，能夠調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。此外熟地黃含有豐富的鐵、鋅、銅等微量元素，這些元素是頭發(fā)中不可或缺的物質(zhì)[12]。紅花活血通經(jīng)，散瘀止痛。其成分紅花黃色素可抗氧化、改善微循環(huán)作用[13]。當(dāng)歸，味甘、辛、溫，歸肝、新、脾經(jīng)，具有補(bǔ)血活血功效，是治療脂溢性脫發(fā)的高頻中藥[14]。補(bǔ)骨脂，味辛、苦、溫，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽功效，用于腎陽不足等病癥，外用可治療斑禿[15]。

毛發(fā)的生長和再生有賴于機(jī)體對毛囊的供血。由于毛囊被豐富的血管床包圍，當(dāng)微循環(huán)灌注出現(xiàn)損傷時，微循環(huán)中血液流動速度降低，因此毛囊所需營養(yǎng)的正常供給受到嚴(yán)重影響影響，導(dǎo)致毛囊養(yǎng)分缺失，進(jìn)而出現(xiàn)脫發(fā)現(xiàn)象[16]。實驗發(fā)現(xiàn)，地黃養(yǎng)陰顆粒給藥30 d后，可明顯促進(jìn)小鼠毛發(fā)生長。通過耳廓微循環(huán)實驗發(fā)現(xiàn)，地黃養(yǎng)陰顆粒可增加小鼠毛細(xì)血管開放量，促進(jìn)小鼠毛細(xì)血管血流速度，增大小鼠毛細(xì)血管輸入口徑和輸出口徑，這與中藥治療斑禿的作用機(jī)制一致，即改善毛囊血液微循環(huán)，調(diào)節(jié)毛囊關(guān)鍵部位的生長周期，進(jìn)而促進(jìn)毛發(fā)生長[17]。大量實驗研究表明，斑禿是一種T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病[18-19]，因此增強(qiáng)自身免疫能力，有利于治療斑禿疾病。碳粒廓清實驗是通過測定單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，來反映機(jī)體的免疫功能強(qiáng)弱。單核巨噬細(xì)胞是機(jī)體中尤為重要的免疫細(xì)胞，其碳粒廓清指數(shù)(κ)的大小可以反映系統(tǒng)吞噬功能的強(qiáng)弱，當(dāng)某些可溶性異物或異物顆粒等抗原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，單核巨噬細(xì)胞可迅速清除體內(nèi)產(chǎn)生的有害物質(zhì)[20]。本實驗結(jié)果顯示，地黃養(yǎng)陰顆粒可明顯增加小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬作用，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。

綜上，本研究通過觀察地黃養(yǎng)陰顆?？诜π∈竺l(fā)生長、小鼠耳廓微循環(huán)、小鼠碳粒廓清實驗發(fā)現(xiàn)，該制劑能改善小鼠微循環(huán)，增強(qiáng)小鼠自身免疫功能，促進(jìn)小鼠毛發(fā)生長，對治療斑禿具有良好的效果。