何建春，董 劍，楊 雷，裴昌貞

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.睡眠心身中心，重慶 402360)

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)主要由腸桿菌產(chǎn)生，是一種經(jīng)質(zhì)粒介導的能水解青霉素類和頭孢菌素類等抗菌藥物的新型廣譜β-內(nèi)酰胺酶[1-2]。ESBLs分為CTX-M型、TEM型、SHV型及其他型，而CTX-M型是ESBLs中最常見的型別[3]。產(chǎn)CTX-M型ESBLs-大腸埃希菌(E.coli)對大部分抗菌藥物耐藥，增加抗感染治療難度，可引起患者住院時間延長、預后差和病死率上升等不良后果[4]。目前，我國產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染的相關(guān)流行病學和危險因素研究較少,因此，為了有效預防該類菌株的醫(yī)院感染，本研究對血流感染中產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的分子流行病學和危險因素進行了分析。

1 資料與方法

1.1菌株來源 回顧性收集本院2014年1月至2017年12月血流感染標本中首次分離的204株非重復E.coli(剔除分離自同一患者的重復菌株)。

1.2菌株鑒定及藥敏試驗 依據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版進行血液標本微生物的分離、培養(yǎng)和純化。將純化后的菌株通過Vitek2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)進行鑒定，并采用配套藥敏鑒定卡測定細菌對頭孢曲松和頭孢他啶等14種抗菌藥物的最小抑菌濃度，參照CLSI M100-S26文件判讀結(jié)果。

1.3ESBLs確證試驗 依據(jù)CLSI M100-S26，確證試驗通過雙紙片協(xié)同試驗完成。將檢出的產(chǎn)ESBLs-E.coli運用頭孢他啶(30 μg)、頭孢他啶(30 μg)加克拉維酸(10 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、頭孢噻肟(30 μg)加克拉維酸(10 μg)進行紙片擴散法驗證；如在任一藥敏紙片上加克拉維酸的抑菌圈直徑與不加克拉維酸的抑菌圈直徑之差≥5 mm，則判定該菌株產(chǎn)ESBLs。在204株E.coli中，共檢出93株產(chǎn)ESBLs菌株，余下111株為非產(chǎn)ESBLs菌株。

1.4ESBLs基因檢測 采用聚合酶鏈反應(PCR)檢測ESBLs基因(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1和blaCTX-M-9)[5]，共檢出49株產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli作為CTX-M組，剩余44株非產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli作為非CTX-M組，111株非產(chǎn)ESBLs-E.coli作為對照組。

1.5產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的同源性分析 采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)對隨機選取的29株產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli 進行菌株同源性分析。PFGE包括菌柵膠的制備、溶菌和裂解、洗膠塊、酶切、制作電泳膠、上樣、電泳和獲取圖像等步驟[6]。

1.6臨床資料采集 統(tǒng)計204例感染E.coli患者的臨床資料，包括年齡和性別等基本資料；尿路感染、肺部感染和低蛋白血癥等合并癥；感染前手術(shù)史、機械通氣和氣管插管等侵入性操作情況；青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類等抗菌藥物的使用情況。

1.7統(tǒng)計學處理 使用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸分析進行危險因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1E.coli產(chǎn)ESBLs率和CTX-M型分布 2014年1月至2017年12月本院血流感染標本中共分離出204株E.coli，其中111株為非產(chǎn)ESBLs菌株，93株為產(chǎn)ESBLs菌株，產(chǎn)ESBLs率為45.6%。93株產(chǎn)ESBLs -E.coli中表達blaCTX-M 49株(52.7%)，blaTEM 38株(40.9%)和blaSHV 15 株(16.1%)。其中1株聯(lián)合表達blaCTX-M、blaTEM和blaSHV，5株聯(lián)合表達blaCTX-M和blaTEM，2株聯(lián)合表達blaCTX-M和blaSHV。

2.2產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的耐藥率分析 CTX-M組對慶大霉素、阿米卡星、亞胺培南和美羅培南的耐藥率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余抗菌藥物在兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CTX-M組對慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶和頭孢吡肟的耐藥率均高于非CTX-M組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余抗菌藥物在兩組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 耐藥率在CTX-M組、非CTX-M組與對照組中的分布情況[n(%)]

續(xù)表1 耐藥率在CTX-M組、非CTX-M組與對照組中的分布情況[n(%)]

注：與CTX-M組比較，*P<0.05。

2.329株產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的同源性分析 PFGE結(jié)果顯示，隨機選取的29株產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli屬于不同的型別，來源不同，未發(fā)現(xiàn)克隆傳播。見圖1。

2.4產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，與非CTX-M組比較，年齡≥60歲、男性、入住ICU、粒細胞減少癥、腸外營養(yǎng)、內(nèi)置引流管、頭孢菌素類和喹諾酮類抗菌藥物使用是CTX-M組患者感染產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的危險因素(P<0.05);與對照組比較，入住ICU、轉(zhuǎn)院、尿路感染、低蛋白血癥、感染前手術(shù)史、置入導尿管、內(nèi)置引流管、頭孢菌素類及喹諾酮類抗菌藥物使用是CTX-M組患者感染產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的危險因素(P<0.05)。見表2。

注：1～29為29株產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的菌株編號，分別為29個型別。

圖1 產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的PFGE結(jié)果

表2 產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染的單因素分析[n(%)]

續(xù)表2 產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染的單因素分析[n(%)]

2.5產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染的多因素Logistic回歸分析 將單因素分析中P<0.05的變量納入多因素Logistic回歸分析模型，結(jié)果顯示,與非CTX-M組比較，年齡≥60歲、粒細胞減少癥、內(nèi)置引流管和頭孢菌素類抗菌藥物使用是CTX-M組患者感染產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。與對照組比較，轉(zhuǎn)院、尿路感染、置入導尿管和頭孢菌素類抗菌藥物使用是CTX-M組患者感染產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表3 CTX-M組與非CTX-M組多因素Logistic回歸分析

表4 CTX-M組與對照組多因素Logistic回歸分析

3 討 論

E.coli是一種常見的醫(yī)院感染條件致病菌，常引起血流感染等全身性感染。近年來因多種抗菌藥物的廣泛使用，使得E.coli的耐藥率不斷增加。產(chǎn)ESBLs(特別是CTX-M型ESBLs)是E.coli對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物最主要的耐藥機制，能導致E.coli對頭孢菌素類等多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。本研究中，從產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥基因分布來看，CTX-M型最多，達到52.7%(49/93)，故本研究以CTX-M型作為研究對象。藥敏試驗結(jié)果顯示，CTX-M組對慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶和頭孢吡肟的耐藥率均高于非CTX-M組(P<0.05)，與國外相關(guān)報道一致[6]，可能是由于ESBLs的型別多樣性及地區(qū)差異，使得CTX-M型與其他型別產(chǎn)ESBLs-E.coli對抗菌藥物的耐藥性存在差異[7]。從菌株同源性來看，29株產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的PFGE條帶不一，呈現(xiàn)出多樣性，表明這些菌株來源不同，不存在菌株間克隆傳播和暴發(fā)流行。

與非產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染患者比較，高齡、粒細胞減少癥、內(nèi)置引流管和頭孢菌素類抗菌藥物使用是感染產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的獨立危險因素。高齡患者常常由于基礎疾病多使得其在感染時全身炎性反應能力降低，免疫防御功能差，定植菌轉(zhuǎn)變成致病菌，從而增加產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染的機會；也有研究證明，CTX-M型菌多見于系統(tǒng)進化樹中的D群，有天然致病的潛力，能有效避開宿主反應，容易在免疫力低下的宿主中造成感染[8]。當粒細胞減少時，患者體內(nèi)不能在免疫球蛋白和補體參與下使細菌吸附于粒細胞膜上，粒細胞釋放的溶菌酶等多種酶類不足以殺滅細菌，從而導致產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染。雖然內(nèi)置引流管能夠防止血腫和繼發(fā)感染的發(fā)生，但也為E.coli發(fā)生逆行性感染提供了通道，從而增加了血流感染的概率。因此，臨床應重視和加強高齡和粒細胞減少癥患者的細菌培養(yǎng)，并及早進行治療。對引流患者應盡早拔除引流管，加強傷口護理，從而減少感染的發(fā)生、發(fā)展。

與非產(chǎn)ESBLs-E.coli感染患者比較，轉(zhuǎn)院、尿路感染、置入導尿管和頭孢菌素類抗菌藥物使用是產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染的獨立危險因素。轉(zhuǎn)院為獨立危險因素可能與患者在轉(zhuǎn)入本院前就已經(jīng)攜帶了產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli有關(guān)。置入導尿管為獨立危險因素的原因可能與以下相關(guān)：導尿能導致人體尿道機械性損傷，毀壞機體的免疫屏障，削弱機體保護、防御功能，E.coli及人體分泌物同時黏附在導尿管內(nèi)壁，并覆蓋在生物膜或黏糖復合物內(nèi)而不能及時被清除和被抗菌藥物殺滅，增加了感染的可能性[9]。當患者發(fā)生尿路感染時，尿液中的E.coli可通過尿道上行而引發(fā)血流感染。

與非CTX-M組和對照組比較，頭孢菌素類抗菌藥物使用是發(fā)生產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染的共同獨立危險因素，提示在頭孢菌素類抗菌藥物的刺激下，E.coli更容易產(chǎn)生CTX-M型ESBLs，其可能原因是E.coli為了躲避頭孢菌素類抗菌藥物的殺滅，發(fā)生基因突變產(chǎn)生CTX-M型別。而相關(guān)報道發(fā)現(xiàn)，CTX-M型ESBLs已有5組120多種亞型，且5組之間同源性低，所以菌株更趨向于產(chǎn)生CTX-M型ESBLs[10]。還有研究發(fā)現(xiàn)，在頭孢菌素類抗菌藥物的刺激下，產(chǎn)CTX-M型ESBLs菌株能夠通過質(zhì)粒水平傳播給非產(chǎn)ESBLs菌株，從而引起產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli的流行[11-13]。

4 結(jié) 論

產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli血流感染的發(fā)生率及菌株耐藥率均較高，使用頭孢菌素類抗菌藥物是產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染的獨立危險因素。臨床可通過減少侵入性操作、合理使用抗菌藥物等方法來減少產(chǎn)CTX-M型ESBLs-E.coli感染的發(fā)生率。