張 媛，侯 麗，楊 帆，鄺 輝△

(1.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆喀什 844000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆烏魯木齊 830000；3.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200333)

尿道結(jié)石作為泌尿系統(tǒng)最常見的疾病，其發(fā)病人數(shù)逐年遞增[1]。目前，尿道結(jié)石診斷主要依靠CT等影像學(xué)檢查，缺少相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)志物，大多數(shù)患者確診時病情已較嚴(yán)重。尋找靈敏度、特異度高的診斷標(biāo)志物，用于早期診斷，對尿道結(jié)石的治療及預(yù)防具有重要意義[2]。尿道結(jié)石的發(fā)病除了與生活方式、飲食習(xí)慣有關(guān)外，還與遺傳因素密切相關(guān)。有研究報道，尿道結(jié)石的發(fā)病呈現(xiàn)一定的地域和種族差異，喀什地區(qū)尿道結(jié)石發(fā)病率較高，考慮與該地區(qū)地理位置和維吾爾族人群的種族特異性有關(guān)[3]。載脂蛋白E(ApoE)是一種由肝臟合成的富含精氨酸的堿性蛋白，主要參與機(jī)體脂代謝過程。有研究證實(shí)，ApoE基因多態(tài)性是影響脂代謝紊亂的重要因素之一，而脂代謝紊亂又參與了尿道結(jié)石的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。本研究探討了喀什地區(qū)維吾爾族尿道結(jié)石患者ApoE基因rs429358和rs7412位點(diǎn)的基因多態(tài)性分布情況及其與尿道結(jié)石發(fā)生的關(guān)系，旨在為臨床尿道結(jié)石的診療及預(yù)防提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院泌尿外科2016年6月至2018年6月收治的維吾爾族尿道結(jié)石患者216例作為觀察組，其中男127例，女89例；年齡24～70歲，平均(42.52±11.35)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：B超、CT等影像學(xué)檢查確診為尿道結(jié)石；患者父母均為維吾爾族；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；合并高血壓等心腦血管疾??；合并泌尿系統(tǒng)感染、尿路畸形等。選取216例同期體檢的維吾爾族健康者作為對照組，其中男119例，女97例；年齡23～71歲，平均(43.62±10.73)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1DNA提取及檢測 所有研究對象清晨空腹采集靜脈血4 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后，根據(jù)DNA試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)說明書提取DNA；提取完成后檢測DNA純度，水平>20 ng/μL，且A260/A280為1.7～1.9；采用雙蒸水調(diào)整DNA水平至50 ng/μL后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴(kuò)增及測序 rs429358和rs7412引物序列如表1所示，擴(kuò)增片段長度分別為240 bp和498 bp。反應(yīng)體系包括TaqDNA聚合酶2 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，20 mmol/L正向引物和反向引物各0.4 μL，DNA模板0.5～0.6 μL，加無菌去離子水至總反應(yīng)體積為30 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸40～50 s；循環(huán)30次后再延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，并于測序儀上完成測序。測序方法：根據(jù)高分辨熔解曲線分析的不同曲線和酶切片段大小、數(shù)量確定不同的基因型，產(chǎn)物rs429358序列長度為238 bp，rs7412序列長度為384 bp。

表1 rs429358和rs7412引物序列

注：F為正向引物，R為反向引物。

1.2.3ApoE基因多態(tài)性分析 取PCR產(chǎn)物1 μg進(jìn)行ApoE酶切反應(yīng),酶切體系:10×緩沖液2 μL，ApoE內(nèi)切酶5 μL，DNA 1 μL，加無菌水至總反應(yīng)體積為20 μL；反應(yīng)條件為37 ℃ 4 h；酶切終止后采用聚丙烯酰胺凝膠，90 V電壓，電泳2 h，然后用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析基因型。

1.2.4血脂相關(guān)指標(biāo)水平檢測 所有研究對象清晨空腹采集靜脈血3～5 mL，分離血清待測。于貝克曼Au5800全自動生化分析儀上進(jìn)行總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、載脂蛋白A(ApoA)、載脂蛋白B(ApoB)及ApoE水平檢測。

2 結(jié) 果

2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 對兩組研究對象ApoE基因rs429358和rs7412位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，所納入的研究對象具有人群代表性。見表2。

2.2ApoE基因rs429358和rs7412位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較 觀察組ApoE基因rs429358位點(diǎn)TT、TC基因型頻率分別為70.83%和29.17%，T、C等位基因頻率分別為85.42%和14.58%，與對照組基因型頻率和等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ApoE基因rs429358位點(diǎn)TC基因型攜帶者患尿道結(jié)石的風(fēng)險較TT基因型增加(OR=2.75，95%CI=1.24～6.02)，T等位基因攜帶者患尿道結(jié)石的風(fēng)險較C等位基因增加(OR=2.19,95%CI=1.30～5.64)。觀察組ApoE基因rs7412位點(diǎn)TT、TC、CC基因型頻率分別為1.85%、12.96%和85.19%，T、C等位基因頻率分別為8.33%和91.67%，與對照組基因型頻率和等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.3兩組血脂相關(guān)指標(biāo)水平比較 觀察組TG、TC、LDL-C及ApoE水平均高于對照組，HDL-C水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ApoA和ApoB水平在兩組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表2 ApoE基因rs429358和rs7412位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

表3 ApoE基因rs429358和rs7412位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較[n(%)]

表4 兩組血脂相關(guān)指標(biāo)水平比較

3 討 論

尿道結(jié)石具體的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，有學(xué)者認(rèn)為生活方式、飲食習(xí)慣、地域差異及遺傳因素在尿道結(jié)石形成過程中發(fā)揮著重要作用[6]。新疆維吾爾自治區(qū)是尿道結(jié)石的高發(fā)地區(qū)，該地區(qū)維吾爾族人群由于生活方式和飲食習(xí)慣與漢族人群有著較大差異，其尿道結(jié)石的發(fā)病率及復(fù)發(fā)率明顯高于漢族人群[3]?？κ驳貐^(qū)位于新疆維吾爾自治區(qū)南部，該地區(qū)維吾爾族人群日常飲食以面食和牛羊肉為主，加上常年食用奶制品與茶點(diǎn)，攝入高脂肪和高蛋白食物較多，導(dǎo)致脂代謝紊亂在該地區(qū)發(fā)病率較高；而相關(guān)研究證實(shí)，脂代謝紊亂與尿道結(jié)石的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[4-5]。血脂水平升高與ApoE基因表型相關(guān)[7-8]，喀什地區(qū)維吾爾族人群ApoE基因多態(tài)性是否與尿道結(jié)石的發(fā)生有關(guān)，健康人群與尿道結(jié)石患者ApoE基因型及等位基因的差異是否對尿道結(jié)石的診斷有一定的價值，目前少有報道。因此，本研究對此進(jìn)行了深入探討，以期為尿道結(jié)石的診療及預(yù)防提供參考。

葉炳華等[8]、宋雨等[9]報道了國內(nèi)漢族人群ApoE基因rs429358和rs7412位點(diǎn)包含多種基因型和等位基因，且人群間等位基因和基因型分布存在一定的差異。本研究中，觀察組ApoE基因rs429358位點(diǎn)TT、TC基因型頻率和T、C等位基因頻率與對照組比較有明顯差異，且TC基因型攜帶者患尿道結(jié)石的風(fēng)險較TT基因型增加(OR=2.75,95%CI=1.24～6.02)，T等位基因攜帶者患尿道結(jié)石的風(fēng)險較C等位基因增加(OR=2.19,95%CI=1.30～5.64)。提示TT、TC基因型和T、C等位基因的差異可能是導(dǎo)致喀什地區(qū)維吾爾族人群患尿道結(jié)石的可能原因，同時TC基因型、T等位基因可能分別是導(dǎo)致尿道結(jié)石的高風(fēng)險基因型與等位基因。

本研究中，觀察組ApoE基因rs7412位點(diǎn)TT、TC、CC基因型頻率和T、C等位基因頻率與對照組無明顯差異，與吳計超[10]對廣西壯族人群的研究結(jié)果類似，提示ApoE基因rs7412位點(diǎn)基因型與基因頻率可能與尿道結(jié)石的發(fā)病無關(guān)。

王艷梅等[11]、梁愛芬等[12]的研究指出，心血管疾病患者血脂水平與ApoE基因多態(tài)性密切相關(guān)，ApoE基因rs429358位點(diǎn)突變患者血脂水平升高，且心腦血管事件的發(fā)生風(fēng)險也明顯升高。本研究中，觀察組TG、TC、LDL-C及ApoE水平均高于對照組(P<0.05)，HDL-C水平低于對照組(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了ApoE基因多態(tài)性與脂代謝紊亂有關(guān)，從而增加了尿道結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險。

4 結(jié)

喀什地區(qū)維吾爾族人群ApoE基因rs429358位點(diǎn)是尿道結(jié)石的易感基因位點(diǎn)，其可能通過對血脂水平的影響從而使尿道結(jié)石的發(fā)生風(fēng)險增加，可成為尿道結(jié)石早期預(yù)防和治療的潛在生物標(biāo)志物。