何靜嫻，張文元，趙國虎，劉芳，緱浩

(蘭州城市學院化學化工學院，甘肅 蘭州 730070)

氨基酸是構成生命體最基本的單元，在生命活動中發(fā)揮著重要作用[1]，可以用來治療疾病，作為藥物前驅(qū)體來生產(chǎn)藥品.目前世界上利用氨基酸前驅(qū)體來制造的藥品多達一百多種[2-3]，例如復方結晶氨基酸營養(yǎng)液[4]、代血漿所用的注射液[5]、氨基酸口服液[6]以及青霉素G和溶菌酶中加入氨基酸衍生物[7]，特別是添加氨基酸酯，青霉素G和溶菌酶表現(xiàn)出較強的抗菌和殺菌能力[8].氨基酸在藥品生產(chǎn)中扮演的角色不容小覷[9].

氨基酸具有手性，有L和D型之分[10].人體中所含有的氨基酸基本都是L型氨基酸，攝入的D型氨基酸也只有轉化為L型氨基酸才能被吸收[11]，如果攝入過多的D型氨基酸，會引起中毒，甚至危及人體生命[12].隨著科技的發(fā)展，越來越多的手性藥物(包括氨基酸類藥品)被制造并用于臨床來治療疾病.但同一種手性藥物的不同構型作用于人體時藥效可能截然不同[13-14].在歐洲，醫(yī)生曾給孕婦服用沒有經(jīng)過拆分消旋體的藥物作為鎮(zhèn)痛藥或止吐藥，結果出生了許多無手或缺腿的先天畸形兒，稱為“海豹嬰兒”.僅僅4年時間，世界范圍內(nèi)誕生了1.2萬多畸形的“海豹嬰兒”，這就是“反應停”慘劇[15].后來經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，反應停的R體有鎮(zhèn)靜作用，但是S-對映體對胚胎有很強的致畸作用[16].因此現(xiàn)在生產(chǎn)出來的氨基酸必須進行構型和純度的檢測，當直接作為藥品或者作為藥品原料的生產(chǎn)及銷售之前也必須進行構型和純度的檢測，對氨基酸進行手性識別是十分必要的[17]，單一構型的氨基酸在生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用.

分子印跡是通過印跡分子與聚合物單體相接觸時會形成多重作用點，通過聚合過程來記憶這種相互作用，當印跡分子被洗脫時，聚合物中就形成了與印跡分子空間構型相匹配的具有多重作用點的空穴，這樣的空穴將對印跡分子及其類似物具有選擇識別特性[18].分子印跡傳感器具有靈敏度高、選擇性好、價格低廉等許多優(yōu)點，受到許多研究者廣泛的關注和深入的研究，手性傳感器可用于檢測鏈霉素，赤霉素，青蒿素等藥物[19-21]，異丙隆，強力霉素等農(nóng)藥殘留[22].

分子印跡傳感器在特異性識別方面具有獨特的優(yōu)勢，但在手性識別藥物方面卻應用較少，與傳統(tǒng)的手性識別方法如光譜法、色譜法等方法相比靈敏度更高，選擇性更好，且操作簡單價格低廉，更具實際應用的價值.本文以石墨烯為基底材料，聚賴氨酸為功能分子，色氨酸為印跡分子，將聚賴氨酸和L-色氨酸通過電沉積的方式沉積在石墨烯電極上，并用洗脫液洗去印跡分子L-色氨酸，制備成分子印跡傳感器識別D型和L-型色氨酸，并研究不同pH，不同沉積時間對傳感器的性能影響.得到最佳試驗條件后，所制備的分子印跡傳感器可以應用于實際檢測色氨酸對映體及某一構型氨基酸的純度.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高錳酸鉀(分析純)，天津市南大化學試劑廠；石墨粉(分析純)，aladdin試劑；硫酸，濃鹽酸，磷酸，無水甲醇(分析純)，北京化工廠；過氧化氫(分析純)，上海沃凱生物技術有限公司；氨水，水合肼(分析純)，上海中秦化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉(分析純)，煙臺市雙雙化工有限公司；L-色氨酸(分析純)，aladdin試劑；聚賴氨酸(分析純)，源葉生物；D-型色氨酸(分析純)，上?；瘜W試劑有限公司；乙酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，分析純)，利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司；亞鐵氰化鉀，鐵氰化鉀(分析純)，天津市凱信化學工業(yè)有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 還原氧化石墨烯的合成 利用Hummers法合成氧化石墨[23].稱取0.3 g氧化石墨并加入300 mL蒸餾水超聲分散2 h.加入0.3 g水合肼，用氨水調(diào)節(jié)pH值到10，95 ℃回流反應2 h，真空抽濾，并用蒸餾水洗滌3次，放入真空干燥箱干燥.

1.2.2 還原氧化石墨烯/聚賴氨酸分子印跡(電極)傳感器的制備 稱取6 mg還原氧化石墨烯，加入6 mL DMF溶液，超聲分散半小時.量取5 μL上述分散液滴涂在玻碳電極表面，紅外燈下烘干得到還原氧化石墨烯修飾電極.將修飾電極浸入聚賴氨酸和L-色氨酸印跡溶液中進行電沉積，電位范圍為0～0.6 V、掃描速度為50 mV/s、掃描圈數(shù)為10.電沉積后將電極在室溫下干燥，之后在甲醇和乙酸體積比為9∶1的L-色氨酸洗脫液中浸泡5 min后，用蒸餾水再次洗滌干燥，得到分子印跡電極.

1.2.3 電解溶液的配制 稱取鐵氰化鉀0.205 g，亞鐵氰化鉀0.263 g，氯化鉀1.9 g于250 mL容量中定容.分別稱取0.051 1 g L-色氨酸和D-色氨酸于50 mL容量瓶，用鐵氰化鉀溶液搖勻定容.

1.2.4 測試與表征 EQUINOX55型紅外光譜儀進行紅外光譜分析時，樣品用KBr壓片，掃描范圍400～4 000 cm-1.掃描電子顯微鏡觀察樣品形貌時，先對樣品使用輝光放射噴金處理.CHI660E型電化學工作站測試樣品時，所有的電化學表征均在三電極體系中測試，玻碳電極和修飾的玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對電極.循環(huán)伏安(CV)在5 mM[Fe(CN)6]4-/3-并含有0.1 M KNO3的電解液中測試，掃描范圍為-0.2～0.6 V，掃速為50 mV/s，取樣間隔為0.001 V.差分脈沖伏安法(DPV)在由特定比例的PBS和色氨酸對映體組成的電解液中測試，掃描范圍為-0.2～0.6 V，振幅為0.05 V，脈沖寬度為0.05 s，脈沖周期為0.5 s.

2 結果與分析

2.1 分子印跡傳感器的結構表征

圖1A和圖1B分別為氧化石墨和還原氧化石墨烯的掃描電鏡圖.氧化石墨呈片狀結構，柔韌性較好有褶皺結構，但部分位置仍有片層堆積，且表面附著有顆粒物質(zhì)，可能是氧化劑殘余所導致.還原后的氧化石墨烯，如同細紗一樣，有自然的褶皺，表面比較光滑，并且具有大的尺寸和較少的片層.這種獨特的二維平面結構使它成為分子印跡傳感器優(yōu)秀的基底材料，使傳感器具有優(yōu)異的電化學性能，可提高檢測的靈敏度.

圖1 氧化石墨(A)和還原氧化石墨烯(B)的掃描電鏡圖

圖2所示為氧化石墨、還原氧化石墨烯和聚賴氨酸的紅外圖譜.聚賴氨酸在3 345 cm-1處有很強的吸收峰，這是屬于-NH2的吸收峰，3 064 cm-1處則為苯環(huán)的C-H伸縮振動峰，1 695 cm-1處為苯環(huán)上的C-H面外彎曲振動吸收峰，1 041 cm-1處則是R-O的伸縮振動峰.氧化石墨在3 435 cm-1處有1個很寬、很強的吸收峰，是-OH的伸縮振動峰；1 662 cm-1處的峰是羧基上的C=O的伸縮振動峰，1 468 cm-1出現(xiàn)的吸收峰，則可能是由于C-OH的彎曲振動；1 098 cm-1處出現(xiàn)的峰，則歸于C-O-C的伸縮振動.而還原氧化石墨烯在3 435 cm-1和1 712 cm-1處的吸收峰大幅度減弱，說明氧化石墨被水合肼成功還原，位于1 598 cm-1處的C-OH和1 018 cm-1處的C-O-C的峰也有所降低證明成功制備了還原氧化石墨烯.

圖2 氧化石墨、還原氧化石墨烯和聚賴氨酸的紅外表征

2.2 分子印跡傳感器的電化學性能表征

由圖3(a)可知，裸電極具有對稱性很好且可逆的氧化還原峰，說明[Fe(CN)6]3-/4-在玻碳電極的表面有很好的電子轉移過程.同樣的，還原氧化石墨烯電極也出現(xiàn)可逆且對稱的氧化還原峰，而且從圖3(b)中知，經(jīng)過修飾的電極峰電流比玻碳電極明顯升高，峰的面積增大，這是由于還原氧化石墨烯具有優(yōu)良的導電性、較大的比表面積、快速的電子轉移速率，從而促進了電子的轉移，加速了[Fe(CN)6]3-/4-氧化還原反應的速率.當電極表面修飾聚賴氨酸色氨酸后，從圖3(c)可知，由于聚賴氨酸色氨酸不導電，峰電流相比還原氧化石墨烯電極有了降低，峰面積也變小，這是因為復合材料的摻雜使得還原氧化石墨烯的導電性和電子轉移速率下降.相應的，由圖3(d)可知，單純修飾聚賴氨酸的電極的峰電流值和峰面積與還原氧化石墨烯電極相比也有所下降.但相比于同時修飾聚賴氨酸色氨酸電極，由于其導電性更高，峰電流值和峰面積也相應變大.通過CV曲線中峰電流值與峰面積的變化，證明聚賴氨酸和色氨酸已經(jīng)成功的修飾在還原氧化石墨烯的基底上.

a：裸電極；b：還原氧化石墨烯；c：還原氧化石墨烯/聚賴氨酸/色氨酸；d：還原氧化石墨烯/聚賴氨酸.

圖4所示為還原氧化石墨烯/聚賴氨酸電極在10～90 mV/s不同掃速下的循環(huán)伏安圖.隨著掃描電流的增加，峰電流也隨著增加.另外，不同掃速下的峰電流值與掃速的平方根有較好的線性關系(R2=0.994 18)，說明這個電化學過程為擴散控制，電極反應受表面控制，證明了此電極在10～90 mV/s范圍內(nèi)均可進行電化學識別.

從a到e分別是還原氧化石墨烯/聚賴氨酸電極在掃描速度10、30、50、70、90 mV/s下的循環(huán)伏安圖；內(nèi)圖：電流響應與掃速的關系.

2.3 分子印跡傳感器的應用

2.3.1 對氨基酸對映體的識別 圖5所示為采用了差分脈沖伏安法對比研究了5.0 mmol/L色氨酸對映體在不同電極上的電化學行為.色氨酸在0～0.3 V電位范圍內(nèi)出現(xiàn)了1個氧化峰，L-色氨酸和D-色氨酸的峰電流幾乎相等，表明色氨酸對映體與玻碳電極不會發(fā)生相互作用，色氨酸對映體在玻碳電極上不能被有效區(qū)分，無法進行手性識別.圖5(B)為D型色氨酸的峰電流值和L型色氨酸的峰電流值的比值(ID/IL)變?yōu)?.03，這是因為還原氧化石墨烯上的官能團與色氨酸分子上的基團之間可以形成微弱的作用力，但這種峰電流的差異太小，不能用于手性識別.圖5(C)中ID/IL由1.03上升為4.36，表明還原氧化石墨烯/聚賴氨酸電極具有優(yōu)良的手性識別能力.因為將L型色氨酸和聚賴氨酸沉積還原氧化石墨烯電極上，并洗脫掉L型色氨酸分子后，電極表面具有L型色氨酸分子的手性空腔，形成了分子印記傳感器，同時還原氧化石墨烯和色氨酸對映體通過π-π相互作用，使色氨酸分子能夠更加靠近手性傳感器，從而L型的色氨酸可以順利進入手性空腔，與聚賴氨酸相互作用，致使還原氧化石墨烯/聚賴氨酸電極峰電流值下降，但作為對映體的D型色氨酸由于構型不同不能進入手性空腔，峰電流值變化不大.因此與L型的色氨酸的峰電流值相比就會產(chǎn)生明顯的差異，從而制備出的傳感器展現(xiàn)出良好的手性識別能力.

A：裸電極；B：還原氧化石墨烯；C：還原氧化石墨烯/聚賴氨酸；a：D-色氨酸；b：L-色氨酸.

2.3.2 pH值對ID/IL的影響 為了探究pH值對電極性能的影響，本文用PBS緩沖溶液調(diào)節(jié)電解液的pH，使電解液的pH為4.8、5.3、6.0、6.5、7.0.從圖6看出，隨著pH值的不斷增大，峰電流比值ID/IL在不斷增大.低pH值下的低效率很可能是由于在強酸性介質(zhì)中還原氧化石墨烯/聚賴氨酸的分解導致識別系統(tǒng)的不穩(wěn)定.色氨酸的等電位點是5.89，因此當pH值超過6.0時，色氨酸異構體帶負電，具有負電荷的L型色氨酸與聚賴氨酸上的基團之間存在靜電互斥，而排斥色氨酸與聚賴氨酸作用，降低石墨烯/聚賴氨酸電極的識別效率.因此pH等于6.0時，峰電流比達到最大值，說明試驗過程中，檢測的電解液pH值等于6.0時，可以獲得良好的識別效果.

2.3.3 沉積時間對ID/IL的影響 為了探究沉積時間對電極性能的影響，本次試驗采用pH為6.0的PBS緩沖溶液，在沉積時間為1、3、5、7、9 min進行電沉積色氨酸和聚賴氨酸，接著洗去色氨酸.從圖7可以看出，隨著沉積時間的增加，峰電流的比值ID/IL在不斷增加，說明隨著沉積時間的增加，沉積到還原氧化石墨烯表面的印跡分子的量增大，提高了識別的靈敏度，到5 min時達到最大.之后隨著沉積時間的增長，電極性能不斷下降，峰電流比值不斷減小，這可能因為過量印跡分子導致整個電極的導電性降低，電極的識別能力降低.試驗結果表明電沉積時間為5 min時，L型色氨酸已經(jīng)在電極上沉積完全，此時的電極具有良好的識別效果.

圖6 不同pH對ID/IL的影響

圖7 不同沉積時間對ID/IL的影響

2.3.4 試劑樣品的檢測 在最佳的測試條件下，將分子印跡傳感器用于檢測由不同含量的D-色氨酸和L-色氨酸組成的濃度為2 mmol/L色氨酸對映體混合溶液.從圖8可以看出印跡電極與含0%、20%、40%、60%、80%、100%的L型色氨酸溶液反應后，其峰電流的變化值ΔI與L-色氨酸比例成線性關系，這表明分子印跡傳感器對L-色氨酸有著更強的響應性.

ΔI可通過計算公式ΔI=I0-I1計算，I0表示分子印跡傳感器的氧化峰電流值，I1表示分子印跡傳感器與色氨酸對映體反應后的氧化峰電流值.回歸方程ΔI=4.476CD-Trp+4.48(R2=0.992 6)，其R2值較高，表明ΔI與L-色氨酸濃度之間有十分良好的線性關系.說明還原氧化石墨烯/聚賴氨酸分子印跡傳感器可利用檢測靈敏度很高的差分脈沖伏安法對色氨酸對映體進行手性識別，用于實際分析和測定色氨酸對映體混合溶液中某一構型的含量.

3 討論

氨基酸作為生命的基本構成物質(zhì)和多種藥物合成的重要前驅(qū)體，對其進行手性識別不僅有利于基礎科學的研究，更能促進生物醫(yī)藥領域的發(fā)展.相比于傳統(tǒng)的識別方法，例如光譜法、色譜法等，電化學傳感器法具有操作簡單快捷、識別靈敏度高、儀器自動化且造價低、能實現(xiàn)在線實時檢測以及綠色化學等優(yōu)點，在手性識別氨基酸領域具有極高的應用潛力，分子印跡傳感器作為一類新型的電化學傳感器，越來越受到研究者的關注.本研究中手性選擇劑是構成傳感器最重要的部分，直接起著手性識別的作用.但現(xiàn)有的手性選擇劑大都導電能力較差，用于電化學傳感時會阻礙電信號的傳輸，得不到理想的識別效果.石墨烯具有優(yōu)異的導電性、快的電子轉移能力、高的機械強度、良好的化學穩(wěn)定性等優(yōu)勢，已被廣泛用作功能性復合材料的基底.在傳感器中石墨烯能提供有效的傳感平臺，放大電信號，提高傳感器的檢測靈敏度.相比于直接使用手性選擇劑作為傳感器，石墨烯作為基底可以和帶有吲哚環(huán)的色氨酸對映體發(fā)生π-π相互作用，使此類手性對映體能夠更加靠近手性位點，提升手性識別的效率[24].此外，在石墨烯形成基底后，我們使用電沉積法構筑的整個電化學傳感器相比于傳統(tǒng)的滴涂法具有更好的電化學穩(wěn)定性和重復性[25].

圖8 ΔI與不同濃度的L型色氨酸之間的線性關系

目前手性識別主要依靠3點作用原理，即手性選擇劑與對映體中的種構型依靠分子間作用力形成穩(wěn)定結合體，而與另外1種構型間則沒有相互作用.這種識別方法簡捷、高效，但是專一性較差.而分子印記傳感器是針對特定分子進行設計的，本研究以聚賴氨酸為功能機體，L-色氨酸為模版分子，在還原氧化石墨烯電極表面采用恒電位沉積和洗脫的方式，制得了對L-色氨酸具有專一手性識別能力的分子印跡傳感器，同時探討出的了最適宜的電極電沉積時間和電解液pH值.

本研究在檢測由不同含量的D-色氨酸和L-色氨酸組成的對映體混合溶液時，R2=0.992 6，與文獻報道的R2數(shù)值0.990 08[26]，0.991 21[27]，0.995[28]等相比具有一定優(yōu)勢，表明其可以用于實際分析和測定色氨酸對映體混合溶液中某一構型的含量.但氨基酸畢竟結構簡單，易于識別，我們希望能研究出更多能夠精確識別各類手性藥物的電化學傳感器，手性識別的最終目標將是直接進行手性藥物的識別.

4 結論

本文以聚賴氨酸為功能機體，L-色氨酸為模版分子，在還原氧化石墨烯電極表面采用恒電位沉積和洗脫的方式，制得了對L-色氨酸具有手性識別能力的分子印跡傳感器，借助DPV、DCV手段對其進行手性識別能力檢測.結果表明，5.0 mmol/L色氨酸對映體在分子印跡傳感器中ID/IL為4.36，且峰電流的變化值ΔI與L-色氨酸濃度比例成良好線性關系，說明該傳感器具有優(yōu)良和穩(wěn)定的手性識別能力.此外還原氧化石墨烯能促進電子轉移，大大提高了傳感器的靈敏性.在實際檢測中，電極電沉積時間為5 min，電解液pH值等于6.0時，可以獲得最佳的識別效果.本文所制備的分子印跡手性傳感器具備對L/D型色氨酸的識別能力，并且制備方法簡單，識別準確性和靈敏度高.為識別手性氨基酸提供了構造分子印跡傳感器的新策略，能對氨基酸產(chǎn)品或相關藥品進行手性類型鑒定或某一構型純度檢測，在生物制藥和食品藥品檢測等領域具有廣泛的應用價值.