姜帆，吳子健，侯惠靜，張一然

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；2.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院，天津 301700；3.天津商業(yè)大學(xué)藝術(shù)學(xué)院，天津 300134)

我國葡萄產(chǎn)量豐富，但僅有少量直接食用，大部分的葡萄常常用于釀酒以及制備干果等快銷食品.在此過程中會產(chǎn)生大量的葡萄皮、葡萄籽等副產(chǎn)物[1-2].葡萄籽中多酚的提取與利用能夠提高葡萄的綜合開發(fā)，同時避免環(huán)境污染.研究表明葡萄籽多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可抗炎、抑制腫瘤、預(yù)防心血管疾病以及清除自由基等[3-7]；另外，葡萄籽多酚還具有胰脂肪酶抑制活性，能夠影響機(jī)體對脂肪的消化[8]，使用葡萄籽多酚作為減肥產(chǎn)品，可以避免通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制人的食欲來減肥所造成的機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的傷害[9-10].

多酚的提取主要有溶劑提取法[11]、超聲波輔助提取法[12]、超臨界流體萃取技術(shù)[13]等方法，其中溶劑提取法由于其簡便利于操作的特點，目前仍被廣泛應(yīng)用。李曌等[14]研究了不同的溶劑類型對葡萄籽多酚提取的影響；李華等[15]在葡萄籽中提取的多酚得率為3.3%左右。目前葡萄籽多酚的提取效率有待提升[16].現(xiàn)階段對葡萄籽的開發(fā)利用主要集中在葡萄籽油、抗氧化性質(zhì)的應(yīng)用方面[17]，而關(guān)于葡萄籽多酚類物質(zhì)的脂肪酶抑制作用的研究很少。本研究通過Plackett-Burman試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化葡萄籽多酚的提取工藝條件，提高葡萄籽多酚的利用率，并進(jìn)一步利用大孔吸附樹脂法對所提取的葡萄籽多酚進(jìn)行分級分離，研究分析不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液所得的葡萄籽多酚組分對胰脂肪酶的抑制效應(yīng)，以便為葡萄籽的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗用葡萄籽由天津王朝葡萄酒業(yè)有限公司提供；AB-8大孔吸附樹脂購自天津南開化工廠；三丁酸甘油酯、豬源胰脂肪酶、纖維素酶購自Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 試驗儀器與設(shè)備

FW80微型高速萬能粉碎機(jī)(天津市華鑫儀器廠)、ICC basic加熱循環(huán)恒溫器(德國IKA)、3-18K臺式高速冷凍離心機(jī)(德國SIGMA公司)、DHG-9920A-L型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海丙林電子科技有限公司)、NTS-4000C型恒溫振蕩水槽(東京理化器械株式會社)、R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司)、FH10型單通道蠕動泵(美國Catalyst公司)、AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、UV5紫外可見分光光度計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、FDU-810型冷凍干燥機(jī)(日本東京理化).

1.3 試驗方法

1.3.1 制備工藝路線 葡萄籽→冷凍干燥→粉碎過20目篩→正己烷脫脂→有機(jī)溶劑萃取→真空濃縮→冷凍干燥→AB-8大孔樹脂吸附提取葡萄籽多酚→真空濃縮→冷凍干燥

1.3.2 葡萄籽的預(yù)處理[18]葡萄籽多酚提取前需要經(jīng)過預(yù)處理，具體步驟如下：葡萄籽經(jīng)凍干，然后粉碎過20目篩，將葡萄籽粉與正己烷1.0∶2.5(M/V)比例混合，4 ℃下脫脂30.0 min，然后經(jīng)離心(3 000g，4 ℃)10.0 min取沉淀棄上清，脫脂步驟重復(fù)兩次，最后烘干得到脫脂的葡萄籽粉.

1.3.3 葡萄籽多酚提取浸提溶劑的選擇 5.00 g葡萄籽粉混懸于50 mL磷酸緩沖液(pH5.0)中，加入纖維素酶(添加量為0.1 mg/mL)50 ℃下酶解2 h[19]；然后進(jìn)行有機(jī)溶劑提取，選取的有機(jī)溶劑分別為體積分?jǐn)?shù)為60%的乙酸乙酯、乙醇、甲醇以及丙酮溶液，提取溫度為40 ℃，提取時間為30.0 min，料液比為1∶9(M/V)、提取次數(shù)為3次[20-23]；所得多酚浸提液經(jīng)真空濃縮以及冷凍干燥得到粗提物，測定比較粗提取的多酚含量.

1.3.4 總多酚含量的測定 葡萄籽提取物中總多酚含量的測定按照Folin-Ciocalte法[24]進(jìn)行，以單寧酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在765 nm處測定吸光度值.

1.3.5 葡萄籽多酚提取條件的優(yōu)化 為確定葡萄籽多酚類物質(zhì)的最佳提取條件，以總多酚提取量為響應(yīng)值，采用三步法進(jìn)行試驗條件優(yōu)化.首先采用Plackett-Burman試驗設(shè)計挑選出對響應(yīng)影響較大的幾個因素(表1)[25]，然后以最陡爬坡試驗確定響應(yīng)值最大時的中心試驗點，最后再利用響應(yīng)曲面法中的中心復(fù)合設(shè)計進(jìn)行試驗，通過試驗數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)的葡萄籽多酚提取條件，并進(jìn)行驗證[26].

1.3.6 AB-8大孔吸附樹脂對葡萄籽多酚吸附性能的考察 分別繪制AB-8大孔吸附樹脂對葡萄籽多酚的等溫吸附曲線和靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線，并測定不同質(zhì)量濃度葡萄籽提取液對大孔樹脂吸附量的影響，具體步驟如下：

表1 葡萄籽多酚提取條件優(yōu)化的Plackett-Burman試驗設(shè)計

分別取處理好的AB-8大孔吸附樹脂1.0 g加到5.0、10.0、20.0、30.0以及40.0 mL的葡萄籽多酚粗提溶液(質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL)中，于25 ℃下靜態(tài)吸附24 h，然后測定上清液中總多酚總量并繪制葡萄籽多酚與AB-8大孔吸附樹脂間的等溫吸附線.

將預(yù)處理好的AB-8大孔吸附樹脂1.0 g置于100 mL葡萄籽多酚溶液(質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL)中，具塞錐形瓶中密封并于25 ℃下以120 r/min的速度進(jìn)行恒溫振蕩，定時測定上清中的多酚含量，并按照公式(1)計算AB-8大孔吸附樹脂對葡萄籽多酚的比吸附量，并繪制其靜態(tài)吸附曲線.

取預(yù)處理過的AB-8大孔吸附樹脂各1.0 g于250 mL的具塞錐形瓶中，再分別將質(zhì)量濃度為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mg/mL的葡萄籽提取液100 mL加入錐形瓶中，密封置于恒溫振蕩器，25.0 ℃、120 r/min條件下震蕩，24 h后從上清液中取樣，按照公式(1)計算比吸附量，研究葡萄籽多酚溶液的質(zhì)量濃度對AB-8大孔樹脂吸附量的影響.

(1)

式中，C0：吸附前葡萄籽多酚提取液中多酚含量(mg/mL)；Ci：吸附后葡萄籽多酚提取液中多酚含量(mg/mL)；V：測試樣液體積(mL)；M：AB-8樹脂的濕質(zhì)量(g).

1.3.7 AB-8大孔吸附樹脂法分離葡萄籽多酚[28]利用AB-8大孔吸附樹脂法分離葡萄籽多酚，分離條件如下：層析柱規(guī)格為16 mm ×400 mm；層析柱材料為處理好的AB-8大孔吸附樹脂；上樣量為600 mL葡萄籽多酚粗提液(質(zhì)量濃度7.5 mg/mL)；上樣流速和洗脫速率均為1.0 mL/min；洗脫溶液為乙醇溶液，體積分?jǐn)?shù)分別為20%、40%、60%、80%.將不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫液分別收集，濃縮干燥，備用.

1.3.8 脂肪酶抑制率的測定 按照You Q等[29]的方法取15 mL 50 mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液，加入0.5 g三丁酸甘油酯，再加入1 mL 2.0 mg/mL葡萄籽多酚溶液于37 ℃條件下攪拌5 min，加入1 mL豬胰脂肪酶(12IU)反應(yīng)3 min，用15 mL的95%乙醇滅活，用氫氧化鈉溶液(0.1 mol/L)標(biāo)定，記錄消耗氫氧化鈉的量.

脂肪酶抑制劑的抑制率，按公式(2)計算：

(2)

測定1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL葡萄籽浸提物溶液對脂肪酶活力的抑制率，繪制出葡萄籽多酚溶液濃度和抑制率的關(guān)系曲線，找出IC50值.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取劑對葡萄籽多酚提取率的影響

按照1.3.3試驗方法，測定比較了4種提取溶劑對葡萄籽多酚的提取能力，結(jié)果如圖1所示.

圖1顯示不同溶劑提取葡萄籽多酚的提取率從高到低排列依次是乙醇>丙酮>乙酸乙酯>甲醇.其中提取溶劑為乙醇時，葡萄籽多酚的提取率最高，達(dá)到12.11%，并且提取率與其他溶劑相比存在顯著差異(P<0.05)，因而確定乙醇溶液為葡萄籽多酚的提取溶劑.

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄籽多酚的提取條件

2.2.1 Plackett-Burman試驗篩選顯著因素 根據(jù)Plackett-Burman試驗組合設(shè)計原理，設(shè)計了12個試驗點的響應(yīng)分析試驗，其結(jié)果見表2.通過試驗結(jié)果以及DesignExpert 8.0軟件的分析結(jié)果,為下一步的研究從選取的各因素中篩選出顯著因素[30].

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05).

經(jīng)回歸擬和后，各試驗因素對響應(yīng)值的影響可用如下函數(shù)表示：

Y=13.1+0.024X1-0.059X2+0.444X3+1.01X4-0.755X5+0.259X6

S=0.987 358，R-Sq=82.1%，R-Sq(調(diào)整)=60.5%.

Plackett-Burman試驗每個因素分別選取了高(1)和低(-1)兩個水平,以葡萄籽得率作為響應(yīng)值，通過比較兩水平因素的差異性和整體的差異性確定因素之間的顯著性來篩選因素，達(dá)到節(jié)約試驗耗材、提高試驗響應(yīng)值的目的[31].如表3所示，試驗因素X4(溫度)和X5(時間)對響應(yīng)值在95%水平上影響顯著，而乙醇體積分?jǐn)?shù)、纖維素酶添加量、料液比、提取次數(shù)對響應(yīng)值的影響不顯著.因此，根據(jù)plackett-Burman試驗結(jié)果選取X4和X5這兩個顯著影響得率的因素進(jìn)行下一步試驗[32]，其他因素取值為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、纖維素酶添加量0.5 mg/mL、料液比1∶10、提取次數(shù)4次.

表2 Plackett-Burman試驗結(jié)果

2.2.2 最陡爬坡試驗 最陡爬坡試驗以試驗值變化的梯度方向作為爬坡方向，根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果得出的兩個關(guān)鍵因素效應(yīng)確定變化步長，逼近最大響應(yīng)區(qū)域.

表3 Plackett-Burman試驗結(jié)果的回歸分析

α=0.05

如表4所示，當(dāng)提取溫度為55 ℃、提取時間為40 min時，葡萄籽多酚的提取率顯著高于其他組合(P<0.05)，選擇這一點作為響應(yīng)面試驗設(shè)計的中心點.

2.2.3 中心復(fù)合試驗 如表5所示，進(jìn)行了因素數(shù)為2，試驗次數(shù)為13次，中心點5個的響應(yīng)面分析試驗.

擬合的二次回歸方程式為：Y=8.218 42X4+1.927 76X5+0.057 200X4X5-0.091 710X4X4-0.064 170X5X5-240.286 19，決定系數(shù)R2=0.996 4，說明回歸方程的擬合程度較好.

表4 最陡爬坡試驗結(jié)果

表5 中心復(fù)合試驗結(jié)果

使用Design Expert 8.0.6軟件對中心復(fù)合試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到響應(yīng)面二次模型的方差分析表，結(jié)果如表6所示.

表6 響應(yīng)面二次模型的方差分析

從表6中可以看到，回歸方程的模型顯著(P<0.05)，失擬項不顯著(P=0.148 1>0.05)，表明此模型能較好的與本試驗數(shù)據(jù)擬合，用上述回歸方程可很好地描述溫度、時間與得率之間的關(guān)系.同時其自變量一次項溫度(X4)、時間(X5)、二次項X4X5、X4X4、X5X5顯著(P<0.05)，從X4、X5和X4X5的P值可看到溫度和時間對葡萄籽多酚的提取率有重要影響.

由圖2～3可知，在一定范圍內(nèi)，總趨勢是葡萄籽多酚的提取率隨溫度的升高先增加然后減少，時間對葡萄籽多酚提取率的影響也是先增加后減少[33].采用Design Expert 8.0.6軟件對回歸方程進(jìn)行分析，得到提取葡萄籽多酚類物質(zhì)的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，纖維素酶添加量為0.5 mg/mL，料液比為1∶10，浸提溫度為53.76 ℃，浸提時間為38.96 min，浸提次數(shù)為4次，此時葡萄籽多酚提取率預(yù)測值為18.31%,為了方便實際操作，將提取工藝參數(shù)修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，纖維素酶添加量為0.5 mg/mL，料液比為1∶10，浸提溫度為54 ℃，浸提時間為39 min，浸提次數(shù)為4次.

圖2 葡萄籽多酚得率與時間、溫度的等值線圖

圖3 葡萄籽多酚得率與時間、溫度的曲面圖

2.2.4 驗證與比較試驗 利用上述響應(yīng)面法試驗得到的葡萄籽多酚類物質(zhì)的提取條件，進(jìn)行3次提取試驗(平行試驗)，結(jié)果見表7.此時葡萄籽多酚的得率為(18.24±0.05)%，與預(yù)測值較為接近，說明模型與實際情況基本吻合.

表7 驗證與比較試驗結(jié)果

2.3 AB-8大孔吸附樹脂對葡萄籽多酚的吸附研究

2.3.1 AB-8樹脂對葡萄籽多酚的等溫吸附線 大孔樹脂對于不同的吸附對象，有不同的吸附性能力.吸附等溫線可以表征吸附劑與吸附劑之間的定性相互作用.吸附等溫線可以描述一定溫度下目標(biāo)在樹脂表面的積累規(guī)律.從吸附等溫線可以推斷出樹脂的吸附過程和機(jī)理，從而更好地控制吸附過程[34].

在25 ℃時，溶液中的葡萄籽多酚濃度對樹脂上吸附的葡萄籽多酚的濃度作圖的結(jié)果如圖4所示.根據(jù)Brunauer等劃分的典型等溫吸附線類型及De Vault，D.J.提出的“優(yōu)惠”和“非優(yōu)惠”平衡曲線的概念[35-36]，AB-8大孔吸附樹脂對葡萄籽多酚的等溫吸附線屬于向上凸的“優(yōu)惠”吸附等溫線，與Langmuir吸附相符，為單分子層吸附，并且隨著葡萄籽多酚溶液體積的增加，AB-8樹脂對葡萄籽多酚的吸附量也增加，表明AB-8樹脂對葡萄籽多酚的吸附性能良好.

圖4 AB-8大孔吸附樹脂對葡萄籽多酚的等溫吸附線

2.3.2 AB-8樹脂的吸附動力線的繪制 在25 ℃，AB-8樹脂吸附葡萄籽多酚過程中，吸附時間對AB-8大孔吸附樹脂上吸附的葡萄籽多酚的吸附量作圖，如圖5所示.

由AB-8大孔吸附樹脂對葡萄籽多酚的靜態(tài)吸附曲線可以看出，AB-8大孔吸附樹脂的吸附量隨時間的增加而逐漸增大，6 h后吸附量趨于穩(wěn)定，說明6 h后基本達(dá)到吸附平衡，葡萄籽多酚于大孔吸附樹脂之間的吸附是以物理吸附為主，屬于慢性吸附類型.

2.3.3 不同的葡萄籽提取液濃度對AB-8樹脂吸附性的影響 如圖6所示，多酚質(zhì)量濃度小于7.0 mg/mL時，AB-8吸附樹脂對葡萄籽多酚的吸附能力隨著葡萄籽多酚質(zhì)量濃度升高而增加，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度大于7.0 mg/mL時，AB-8大孔吸附樹脂對葡萄籽多酚的吸附能力隨著多酚質(zhì)量濃度的升高反而呈下降趨勢.這可能是因為在多酚溶液質(zhì)量濃度較低時，提高葡萄籽多酚溶液的質(zhì)量濃度，可以增加多酚分子與樹脂的接觸面積，加速多酚進(jìn)入樹脂內(nèi)部.但當(dāng)葡萄籽多酚質(zhì)量濃度增加至一定程度后，繼續(xù)升高質(zhì)量濃度會使溶液粘度增大，不利于多酚分子的擴(kuò)散且容易產(chǎn)生沉淀，對樹脂造成污染并容易堵塞[37].同時，溶液質(zhì)量濃度增加，試液中雜質(zhì)含量增加，與多酚的競爭吸附也會增加，導(dǎo)致樹脂吸附量有所下降[38].因此，本試驗的葡萄籽多酚溶液質(zhì)量濃度控制在7.0 mg/mL左右為宜.

圖5 AB-8大孔吸附樹脂對葡萄籽多酚的靜態(tài)吸附曲線

圖6 提取液中多酚質(zhì)量濃度對AB-8大孔樹脂吸附性的影響

2.4 葡萄籽多酚對脂肪酶抑制率的測定

2.4.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫出的葡萄籽多酚脂肪酶抑制率 由圖7所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，乙醇洗脫出的葡萄籽多酚對脂肪酶的抑制率逐漸增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過40%時，乙醇洗脫出的葡萄籽多酚對脂肪酶的抑制率有所下降.40%乙醇洗脫出來的葡萄籽提取物配制的溶液對脂肪酶有較高的抑制率，與其他體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫的葡萄籽多酚脂肪酶抑制率有顯著差異(P<0.05)，因此選擇40%乙醇作為洗脫溶劑.

圖7 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液洗脫出的葡萄籽多酚的脂肪酶抑制率

2.4.2 不同質(zhì)量濃度葡萄籽提取液對脂肪酶抑制率的影響 從圖8可以看出，在一定的范圍內(nèi)，多酚質(zhì)量濃度和多酚對脂肪酶的抑制率成正比，隨著葡萄籽提取液濃度的增大，其對脂肪酶活力的抑制作用也隨著增大，IC50=2.46 mg/mL.

圖8 不同質(zhì)量濃度葡萄籽提取液對抑制率的影響

3 討論

本試驗在多酚物質(zhì)的提取研究基礎(chǔ)上,通過Plackett-Burman試驗篩選出顯著影響多酚提取率的因素為提取溫度和提取時間，然后通過爬坡試驗確定響應(yīng)面試驗的中心試驗點后進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件.李西柳等[39]通過正交試驗得出提取溫度和提取時間對總多酚含量影響顯著,乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對總多酚含量影響不顯著，與本研究結(jié)果相吻合.響應(yīng)面優(yōu)化后的葡萄籽多酚提取率為18.24%，而傳統(tǒng)提取方法通常為0.03%左右[40]，賈榮等[41]在類似研究中提取葡萄籽多酚的提取率為11.71%，都低于本試驗條件下的多酚提取率.本試驗通過優(yōu)化葡萄籽多酚提取條件，為后續(xù)試驗提供一定參考價值，提高多酚的利用率，有很好的經(jīng)濟(jì)效益.

葡萄籽多酚抑制胰脂肪酶的活性可有效抑制脂肪的水解和吸收，可有助于減肥和預(yù)防高脂血癥[42].本試驗提取純化的葡萄籽多酚對胰脂肪酶有抑制作用，其IC50值為2.46 mg/mL.高德艷[43]采用正交法選擇有機(jī)溶劑萃取的最佳條件并用HPD100型大孔吸附樹脂進(jìn)行分離葡萄籽中的多酚類物質(zhì)，其IC50值為2.40 mg/mL，略低于本試驗所提取的葡萄籽多酚的脂肪酶抑制能力.

4 結(jié)論

本試驗得到了葡萄籽多酚的最佳粗提條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，纖維素酶添加量0.5 mg/mL，料液比1∶10，浸提溫度54 ℃，浸提時間39 min，浸提次數(shù)4次.AB-8大孔吸附樹脂對葡萄籽多酚的純化條件為：上樣質(zhì)量濃度7.0 mg/mL，上樣速率1.0 mL/min，40%乙醇洗脫，洗脫速率1.0 mL/min.上述方法得到的葡萄籽多酚對胰脂肪酶抑制的IC50值為2.46 mg/mL.