向程舉，蔣會梅，張依裕，楊遠清，吳學(xué)樹，周艷，楊丹，張貴強，沈杰，劉若余，吳磊

(1.畢節(jié)市畜禽遺傳資源管理站，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)家禽研究所，貴州 貴陽 550025)

畜禽肌肉品質(zhì)優(yōu)劣直接影響產(chǎn)品的市場競爭力，其受到飼料營養(yǎng)、飼養(yǎng)管理、疫病防控、遺傳育種等因素的影響[1].畜禽肌肉品質(zhì)受微效多基因控制，至今已發(fā)現(xiàn)許多與肌肉品質(zhì)相關(guān)的基因如FAS、SCD-1、LXRs等[2-3].白介素8受體β亞基(interleukin-8 receptor bata，IL8RB)也被稱為C-X-C趨化因子受體2(C-X-C chemokine receptor type 2，CXCR2)，屬于視紫紅質(zhì)樣 G 蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，通過與IL8結(jié)合介導(dǎo)抗炎癥細胞聚集、活化和修復(fù)損傷的組織，刺激中中性粒細胞、淋巴細胞發(fā)生趨化游走等功能[4].IL8RB基因主要在髓樣前體細胞和中性粒細胞中表達，IL8RB通過介導(dǎo)活化中性粒細胞，促進其脫顆粒并釋放貯存酶，啟動超氧離子釋放，提升吞噬功能，引起畜禽機體局部炎癥反應(yīng)而實現(xiàn)殺滅病原菌的作用[5].IL8RB也通過與IL-8結(jié)合進而參與子宮內(nèi)膜上皮細胞與胚泡滋養(yǎng)層細胞的相互作用而影響小鼠的繁殖和胚泡著床過程[6-7].奶牛乳腺炎發(fā)生過程中，感染的中性粒細胞向乳腺的遷移需要IL8RB的參與，揭示IL8RB在乳腺炎感染過程中的免疫功能發(fā)揮重要作用，并能夠提高牛奶產(chǎn)量，可作為一個重要的抗牛乳腺炎的候選基因[8-9].最近的研究顯示，IL8RB信號通過Wip1、T-bet、微生物群系等調(diào)控健康和患病小鼠造血細胞的動員和功能的發(fā)揮[10].雞的IL8RB基因定位于7號染色體上，包含2個外顯子，其編碼氨基酸的序列位于外顯子2，其蛋白為1種糖蛋白，與現(xiàn)已知的趨化因子受體相比較，其蛋白序列的末端跨膜區(qū)缺乏保守的(C/S)CXNP基因序列[11].至今，IL8RB信號的生物學(xué)功能在人和小鼠上進行了廣泛報道，但在家禽上的研究極為匱乏.本研究的試驗材料為貴州省近年來發(fā)現(xiàn)的優(yōu)良地方雞種質(zhì)資源‘黔畫烏雞’[12]，研究IL8RB基因外顯子2的遺傳變異，探討其變異對肉質(zhì)的影響，為進一步深入研究該基因在家禽中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，也為開展標記輔助選擇提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

同批出雛的150只‘黔畫烏雞’母雞按照同樣的飼養(yǎng)管理條件和營養(yǎng)水平于黔西縣‘黔畫烏雞’保種選育場進行飼養(yǎng)，自由采食和飲水，全群采用黃芪多糖進行防控，不注射任何疫苗，不使用任何抗生素，120日齡結(jié)束飼養(yǎng)，隨機抽取94只正常健康的‘黔畫烏雞’進行放血屠宰，收集血樣，采集胸肌備用.血液基因組DNA采用苯酚-氯仿法進行提??；胸肌常規(guī)肌肉品質(zhì)按照《豬肌肉品質(zhì)測定技術(shù)規(guī)范NY/T821-2004》進行測定，指標包括pH值、失水率、嫩度和蒸煮損失；粗脂肪采用索氏抽提法進行提取，所有肉樣測定指標的預(yù)處理均在采集后45 min內(nèi)完成.

1.2 引物設(shè)計和PCR擴增

根據(jù)GenBank中收錄的雞基因組序列中IL8RB基因序列(NC_006094.5)設(shè)計1對特異性引物擴增IL8RB基因外顯子2，位于基因組g.22589018-22589557區(qū)域，處于基因CDS區(qū)c.232-771區(qū)域，擴增片段540 bp，正向引物序列5′-CGCTCTGTCACCGATGTCTA-3′，反向引物序列5′-CAGCACCACAGCTAGGATG-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.PCR擴增體系：RNase-Free Water 10 μL、PCR Master Mix 7.0 μL(購自大連TaKaRa公司)、10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL、模板DNA 1.0 μL，終體積20 μL.PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃ 變性40 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.

1.3 SNPs鑒定和統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 IL8RB基因外顯子2的SNPs鑒定

用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果表明引物特異性良好.對采集的94個樣本的PCR產(chǎn)物進行純化回收測序，進行序列比對，結(jié)果顯示，在‘黔畫烏雞’IL8RB基因外顯子2中共發(fā)現(xiàn)4個SNPs位點(圖1)：位于基因組序列(NC_006094.5)的g.22589317 C>T突變位于基因CDS區(qū)531位，導(dǎo)致177位的密碼子CCC變?yōu)镃CT，均編碼脯氨酸(P)；g.22589423 C>T突變位于基因CDS區(qū)637位，導(dǎo)致213位的密碼子CTG變?yōu)門TG，均編碼亮氨酸(L)；g.22589476 T>C突變位于基因CDS區(qū)690位，導(dǎo)致230位的密碼子TAC變?yōu)門AT，均編碼酪氨酸(Y)；g.22589485 C>T突變位于基因CDS區(qū)699位，導(dǎo)致233位的密碼子ACC變?yōu)锳CT，均編碼蘇氨酸(T)，由此可見，檢測到的SNPs位點均未能導(dǎo)致基因編碼的氨基酸發(fā)生變化，均為同義突變和堿基的轉(zhuǎn)換突變.

2.2 IL8RB基因外顯子2的SNP位點的群體遺傳信息分析

通過分析IL8RB基因外顯子2的SNP位點在‘黔畫烏雞’群體中的遺傳信息，結(jié)果見表1.結(jié)果表明，4個SNP位點均產(chǎn)生3種基因型，均為中度多態(tài)SNP位點，基因型分布均未偏離Hardy-Weinberg平衡，g.22589317 C>T、g.22589423 C>T和g.22589485 C>T突變位點產(chǎn)生的等位基因C和基因型CC的頻率均為最高，基因型TT的頻率處于0.074 5～0.106 4之間，g.22589476 T>C突變位點產(chǎn)生的等位基因T和雜合基因型TC的頻率最高，基因型CC的頻率僅為0.127 7.

2.3 IL8RB基因外顯子2的SNP位點與‘黔畫烏雞’肌肉品質(zhì)的相關(guān)性分析

通過分析IL8RB基因外顯子2的SNP位點對‘黔畫烏雞’胸肌常規(guī)肌肉品質(zhì)的遺傳效應(yīng)，結(jié)果見表2.結(jié)果顯示，g.22589317C>T位點對嫩度的影響達到顯著水平(P<0.05)，基因型TT個體的嫩度值顯著高于基因型CC個體(P<0.05)；g.22589423 C>T和g.22589476 T>C位點均對鮮肉中粗脂肪含量的影響達到顯著水平(P<0.05)，g.22589423 C>T位點的基因型TT個體顯著高于基因型CT個體(P<0.05)，g.22589476 T>C位點的基因型CC個體顯著高于基因型CT和TT個體(P<0.05)，其他各位點各基因型對肌肉品質(zhì)指標的影響未達到顯著水平(P>0.05).

3 討論

肌肉品質(zhì)是評價畜禽優(yōu)異性的重要性狀，在畜禽開發(fā)利用中具有重要意義，也是決定市場競爭力的關(guān)鍵性狀.抗病育種可以通過提高畜禽的抗逆能力，減少疫病發(fā)生率和獸藥使用，提高畜禽肌肉品質(zhì)和安全性[13].因此，抗病基因通常作為提高肌肉品質(zhì)的候選基因來進行研究.趨化因子受體IL8RB在炎癥性疾病中廣泛表達，其與趨化因子結(jié)合能調(diào)節(jié)單核細胞、中性粒細胞的遷移，并聚集在炎癥部位發(fā)揮生物學(xué)功能[14-15].目前，在人、鼠、奶牛等物種的IL8RB基因中檢測到影響炎癥反應(yīng)的遺傳變異位點，對開展抗炎癥研究提供了良好的借鑒材料[16-17].但是關(guān)于家禽IL8RB基因多態(tài)性的報道尚缺乏.本研究首次在雞IL8RB基因外顯子2發(fā)現(xiàn)4個SNP位點：g.22589317 C>T、g.22589423 C>T、g.22589485 C>T和g.22589476 T>C，由于密碼子簡并現(xiàn)象，4個SNP位點在突變前后未引起編碼氨基酸的改變.據(jù)報道，單核苷酸的替換會改變mRNA的剪切效率或準確性，從而影響蛋白質(zhì)的功能和表達水平的變化，進行調(diào)控IL8RB基因表達水平影響畜禽生產(chǎn)性能，因此在本試驗中4個SNPs不可忽略[18].每個SNP位點的等位基因頻率的差值較大，表現(xiàn)出極有優(yōu)勢的等位基因分布，4個SNP位點各自產(chǎn)生的3種基因分布均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，揭示4個SNP位點可能未受到基因突變、人工選擇和遺傳漂變等因素的影響，或者受到影響，但由于育種者根據(jù)育種目標進行長期選擇和大量擴繁后重新達到新的平衡而改變了原來的平衡狀態(tài)[19].

圖1 SNPs位點鑒定

表1 IL8RB基因外顯子2的SNP位點在‘黔畫烏雞’中的遺傳信息

表2 IL8RB基因外顯子2的SNP位點對‘黔畫烏雞’肉質(zhì)的遺傳效應(yīng)

同位點同列數(shù)據(jù)肩標小寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，其它則表示差異不顯著(P>0.05).

The difference between the shoulder small letters of the same place and the same column was significant(P<0.05)，while the difference between the other two was not significant(P>0.05).

近20余年來，許多研究者開展了畜禽經(jīng)濟性狀主效基因的篩選鑒定或相關(guān)候選基因的研究工作，表明畜禽結(jié)構(gòu)基因的一些突變位點可顯著影響其經(jīng)濟性能，并作為分子標記應(yīng)用于畜禽育種，取得了明顯的選育進展.但關(guān)于IL8RB基因遺傳變異是否影響家禽經(jīng)濟性能尚缺乏報道.本研究通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，‘黔畫烏雞’IL8RB基因外顯子2中g(shù).22589317C>T位點對嫩度的影響達到顯著水平，CC基因型個體的嫩度值最低，蒸煮損失和失水率也最低，但粗脂肪含量最高，揭示CC基因型可能有利于改善肉質(zhì)；g.22589423 C>T和g.22589476 T>C位點均對鮮肉中粗脂肪含量的影響達到顯著水平，g.22589423 C>T位點的TT基因型個體胸肌粗脂肪含量最高，失水率、蒸煮損失和嫩度均最低，暗示TT基因型可能對肉質(zhì)改善有利；g.22589476 T>C位點的CC基因型個體也表現(xiàn)出胸肌粗脂肪含量最高，失水率、蒸煮損失和嫩度均最低，表明CC基因型可能是改善肉質(zhì)的有利基因型；g.22589476 T>C位點對所檢測的5個肉質(zhì)常規(guī)指標的效應(yīng)未達到顯著水平，揭示該位點作為一個標記進行選擇肉質(zhì)時可能取不到明顯的育種效果，但是否能與其他位點共同作用加強對肉質(zhì)的影響需要進一步闡釋.分子生物學(xué)相關(guān)研究表明，畜禽基因組或基因的變異會不同程度的影響DNA構(gòu)象，引起分子自由能的降低或增加，從而導(dǎo)致基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的速率發(fā)生改變，進而影響基因的表達量，基因的生物學(xué)功能會受到影響而導(dǎo)致畜禽經(jīng)濟性能的變化[20].但是，本研究由于樣本數(shù)的限制和基因型分布出明顯的偏移現(xiàn)象，沒有開展4個SNP位點的連鎖不平衡分析，組成的單倍型是否會改變基因mRNA理化性質(zhì)尚未進行預(yù)測或試驗驗證，4個SNP位點聯(lián)合雙倍型是否會對‘黔畫烏雞’經(jīng)濟性狀產(chǎn)生影響或者其效應(yīng)機制尚有待闡釋.因此，課題組下一步研究工作中進一步增加檢測的品種和樣本數(shù)量，緊接本研究的成果繼續(xù)挖掘IL8RB基因變異位點，深入研究和解釋這些變異位點功能發(fā)揮的分子機制，加快其應(yīng)用于畜禽育種工作的可能性.

4 結(jié)論

‘黔畫烏雞’IL8RB基因外顯子2中發(fā)現(xiàn)4個中度多態(tài)的同義突變位點：g.22589317 C>T、g.22589423 C>T、g.22589485 C>T和g.22589476 T>C，4個SNP位點均產(chǎn)生3種基因型，g.22589317 C>T位點對嫩度的影響達到顯著水平，g.22589423 C>T和g.22589476 T>C位點均對粗脂肪含量的影響達到顯著水平，綜合各基因型各指標之間的差異，揭示 g.22589317C>T位點的CC基因型、g.22589423 C>T位點的TT基因型和g.22589476 T>C位點的CC基因型是改善肉質(zhì)的有利基因型，可能作為提高肉雞肌肉品質(zhì)的分子遺傳標記.