王昱

(隴南師范高等專科學(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 成縣 742500)

皮膚是人體最大的器官，具有保護(hù)、感覺、調(diào)節(jié)體溫、吸收、分泌與排泄、新陳代謝等生理功能.隨著年齡增加，皮膚結(jié)構(gòu)退變、功能衰退，臨床表現(xiàn)為皮膚變薄、彈性減退、干燥粗糙、色素沉著、皺紋出現(xiàn)、血管突顯等[1].然而皮膚衰老的具體機(jī)制仍不明確.越來越多研究表明，自由基損傷、免疫力功能減退、端粒酶活性下降、炎癥反應(yīng)等在皮膚衰老中具有關(guān)鍵作用[2-3].西醫(yī)多采用外科手術(shù)提緊皮膚、注射肉毒素、皮下注射膠原等方法進(jìn)行治療，但存在風(fēng)險(xiǎn)性和副作用.研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1,MMP-1)屬于細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)，是分解皮膚膠原蛋白和降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶[4].水通道蛋白3(aquaporin3,AQP3)屬于水-甘油通道亞家族，主要分布于皮膚表皮層中，是皮膚水轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的關(guān)鍵蛋白[5-6].香蕉皮多酚(banana peels polyphenol)是香蕉皮的主要活性成分之一，具有抗真菌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗氧化和降血脂等作用[7-8]，并在食品保鮮和化妝品等方面也有應(yīng)用[9-12].本研究擬采用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)復(fù)制大鼠衰老模型，探討香蕉皮多酚對D-gal致衰大鼠皮膚的保護(hù)作用及機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 香蕉皮多酚提取制備

香蕉皮多酚由本實(shí)驗(yàn)室從香蕉皮中提取(98% HPLC)：參照文獻(xiàn)[13]，稱取100 g香蕉皮，切片，沸水中熱燙3～5 min，用80%乙醇溶液、浸提溫度80 ℃、時(shí)間為3 h、浸提2 次，合并濾液，離心，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，有機(jī)溶劑萃取分離純化，冷凍干燥得到香蕉皮多酚提取物.

1.2 構(gòu)建衰老大鼠模型與分組給藥

健康SD大鼠30只(購于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證編號：SCXK(甘)2005-0007，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半)，同條件飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為3組，每組10只，分為對照組、衰老模型組和香蕉皮多酚組.衰老模型組和香蕉皮多酚組大鼠頸背部皮下注射D-半乳糖(北京優(yōu)尼康生物科技，批號MG05201)溶液(以體質(zhì)量計(jì))300 mg/kg[3]，同時(shí)香蕉皮多酚組灌胃(以體質(zhì)量計(jì))120 mg/kg的香蕉皮多酚[10]，對照組每天注射等量的0.9%生理鹽水，1次/日，連續(xù)處理7周.

1.3 形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察

構(gòu)建動物模型過程中每天觀察各組大鼠精神狀態(tài)、毛色、活動情況、飲食及飲水量等.于試驗(yàn)第 43天，每個試驗(yàn)組隨機(jī)選5只大鼠，采用頸椎脫臼法處死大鼠，用 8%硫化鈉溶液脫毛后立即取其背部正中皮膚(0.5 cm×0.5 cm大小)2塊，去掉皮下脂肪及結(jié)締組織，投入4%多聚甲醛液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片(6 μm)，HE染色，在光學(xué)顯微鏡(Olympus，F(xiàn)X-35WA，Japan)下觀察并拍照.

1.4 細(xì)胞凋亡及膠原蛋白含量的測定

每個試驗(yàn)組隨機(jī)選5只大鼠，取其背部皮膚，去除皮下脂肪，分離表皮和真皮層，將真皮放入盛有無血清HBSS液(Hanks平衡鹽緩沖溶液)的培養(yǎng)皿中沖洗，用眼科剪剪碎再用彎頭吸管反復(fù)吹打，0.125%胰蛋白酶和 0.01%的EDTA在37℃水浴消化液30 min，終止消化后棄去消化液，收集細(xì)胞用吖啶橙/溴化乙啶(Sigma公司)熒光雙染法(1∶1)染色，熒光顯微鏡(Olympas，IX71，Japan)計(jì)數(shù)分析細(xì)胞凋亡率，并按照ELISA檢測試劑盒(ELx800，美國BioTek公司)說明書操作，檢測Ⅰ型、Ⅱ型膠原蛋白的含量.

1.5 PCR檢測皮膚組織MMP-1、AQP3 mRNA的表達(dá)

引物由上海涵悅生物科技有限公司設(shè)計(jì)，引物序列見表1.引物由生工生物工程(上海)技術(shù)有限公司合成.取大鼠皮膚，放入2 m L的離心管，加入1 m L Trizol后用勻漿器反復(fù)研磨，離心(12 000 r/min)15 min，取上清液通過酚-氯仿抽提RNA，將抽提的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增(RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購自Taka Ra公司).PCR按照試劑盒說明書進(jìn)行操作(7900 HT Sequence Detection System定量PCR儀，美國ABI)，反應(yīng)完畢采用 ABI 7500 軟件分析，用公式 2-△△Ct方法進(jìn)行相對定量.

表1 目的基因引物序列

1.6 Western-blot各組蛋白質(zhì)表達(dá)

按照常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度.定量后稀釋好的樣品經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉(5%脫脂奶粉，用TBST稀釋).將膜取出，加單克隆兔抗鼠水通道蛋白3、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(濃度均為1∶2 000)，4 ℃冰箱過夜，充分洗滌，加偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的二抗(濃度為1∶5 000)，室溫下作用1 h，洗膜后加ECL發(fā)光液，以β-actin作為內(nèi)參照，運(yùn)用Image Lab 軟件進(jìn)行曝光成像，采用Quantity one 軟件分析條帶灰度值，試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠衰老動態(tài)情況觀察

大鼠皮下連續(xù)注射D-gal，共7周，大鼠逐漸出現(xiàn)毛色晦暗，脫落，皮膚彈性差，嗜睡，精神萎靡，進(jìn)食量明顯減少，呈現(xiàn)明顯衰老體征.而對照組和香蕉皮多酚組大鼠無明顯相關(guān)體征.

2.2 香蕉皮多酚對大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)的影響

對照組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)正常，表皮、真皮及皮下組織結(jié)構(gòu)完整(圖1-A).衰老模型組大鼠皮膚結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病理行變化，層次不清，表皮變薄，毛囊和皮脂腺數(shù)目嚴(yán)重減少，結(jié)締組織增生明顯(圖1-B).與衰老模型組相比，香蕉皮多酚組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)相對完整，毛囊與皮脂腺數(shù)目增多.表皮和真皮組織增厚，真皮層的膠原纖維分布均勻，排列整齊(圖1-C).

2.3 各試驗(yàn)組大鼠皮膚Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的含量

與對照組相比，衰老模型組成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量顯著降低(P<0.01).與衰老模型組相比，香蕉皮多酚組成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量明顯增多(P<0.05，P<0.01，圖2).

2.4 各試驗(yàn)組大鼠皮膚的細(xì)胞凋亡

吖啶橙和溴化乙啶染料與DNA結(jié)合后在熒光下有不同的吸收值，亦可見細(xì)胞核中染色質(zhì)濃縮的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，從而觀察細(xì)胞的凋亡情況.在熒光顯微鏡下活細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的綠色；早期凋亡細(xì)胞呈綠色，染色質(zhì)凝聚或核裂解，細(xì)胞核中有鮮綠色的斑點(diǎn)；晚期凋亡細(xì)胞呈橙色，細(xì)胞核凝聚并常常裂解；壞死細(xì)胞呈橙色，無染色質(zhì)凝聚.由圖3可知，各實(shí)驗(yàn)組大鼠皮膚細(xì)胞均有不同程度的細(xì)胞死亡情況.與對照組相比，衰老模型組大鼠皮膚的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，對照組和香蕉皮多酚組大鼠皮膚的細(xì)胞凋亡率顯著低于衰老模型組(P<0.01，表2).

A：對照組；B：衰老模型組；C：香蕉皮多酚組；D：真皮；E：表皮；H：皮下組織；標(biāo)尺示50 μm.

與對照組比較 * P<0.05，** P<0.01；與衰老模型組比較 ▲P<0.01，▲▲ P<0.01.

表2 香蕉皮多酚對大鼠皮膚細(xì)胞凋亡率的影響

與對照組比較 *P<0.05，**P<0.01；與衰老模型組比較▲P<0.01，▲▲P<0.01.

*P<0.05，**P<0.01,vs.control group；▲P<0.01，▲▲P<0.01,vs.aging model group.

A：對照組；B：衰老模型組；C：香蕉皮多酚組，標(biāo)尺示20 μm.

2.5 香蕉皮多酚對大鼠皮膚組織MMP-1和AQP-3表達(dá)的影響

MMP-1、AQP-3 和β-actin 的分子量分別為27，36，43 kb，條帶清晰.以β-actin 的吸光度值作為內(nèi)參照，對各組條帶的吸光度值校正后進(jìn)行半定量分析.與對照組相比，衰老模型組大鼠皮膚組織MMP-1蛋白含量極顯著升高，而AQP-3蛋白含量極顯著降低(P<0.01).經(jīng)香蕉皮多酚干預(yù)后，大鼠皮膚組織MMP-1蛋白含量明顯降低，而AQP3 蛋白含量明顯升高(P<0.05，P<0.01).以上結(jié)果與PCR檢測MMP-1和AQP-3 mRNA結(jié)果一致(表3，圖4).

表3 香蕉皮多酚對大鼠皮膚組織MMP-1和AQP3 mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較 *P<0.05，**P<0.01；與衰老模型組比較▲P<0.01，▲▲P<0.01.

*P<0.05，**P<0.01,vs.control group；▲P<0.01，▲▲P<0.01,vs.aging model group.

1：對照組；2：衰老模型組；3：香蕉皮多酚組；與對照組比較 * P<0.05，** P<0.01；與衰老模型組比較 ▲P<0.01，▲▲ P<0.01.

3 討論

D-gal 是公認(rèn)的致衰劑，廣泛用于動物衰老模型和細(xì)胞體外衰老模型的復(fù)制，其構(gòu)建衰老模型動物的各種生理、生化指標(biāo)均與自然衰老相似[14-17].本研究采用D-gal 復(fù)制大鼠衰老模型，衰老模型組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的形態(tài)病理改變，皮膚組織結(jié)構(gòu)不完整，層次不清，表皮變薄，附屬器官減少，結(jié)締組織增生，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量明顯減少，大量的細(xì)胞凋亡.已有研究報(bào)道，衰老的皮膚細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、凋亡小體形成、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、空泡形成等改變[18]，膠原纖維減少，皮膚在形態(tài)學(xué)上則表現(xiàn)為表皮變薄，表皮突和真皮乳頭減少，真皮層膠原纖維排列紊亂，皮膚彈性降低[19]，這提示皮膚的衰老與膠原蛋白結(jié)構(gòu)改變、數(shù)量減少及皮膚細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系.本研究在復(fù)制大鼠衰老模型過程中灌胃香蕉皮多酚干預(yù)皮膚衰老進(jìn)程，結(jié)果顯示，皮膚組織結(jié)構(gòu)相對完整，表皮增厚，真皮內(nèi)膠原纖維增多，毛囊與皮脂腺數(shù)目增多，細(xì)胞凋亡率明顯降低，這表明香蕉皮多酚能有效拮抗D-gal對大鼠皮膚的致衰作用.

現(xiàn)代衰老生物學(xué)理論認(rèn)為，隨年齡增加機(jī)體組織器官逐漸出現(xiàn)結(jié)構(gòu)退變，而皮膚的衰老過程極其復(fù)雜，與遺傳、免疫、自由基、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子等許多因素相關(guān)[1].本試驗(yàn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠皮膚組織MMP-1和AQP3mRNA基因的表達(dá)水平時(shí)，同時(shí)采用Western-blotting檢測了大鼠皮膚組織MMP-1和AQP3蛋白的含量.正常皮膚組織中MMP-1蛋白的表達(dá)量極少，但在皮膚損傷、炎性浸潤、創(chuàng)傷修復(fù)等情況下，MMP-1大量表達(dá)，從而破壞膠原纖維和彈性纖維的正常結(jié)構(gòu)，皮膚膠原蛋白分解增多，皮膚變薄，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)皺縮細(xì)紋等衰老癥狀[20].本試驗(yàn)結(jié)果顯示，衰老模型組大鼠皮膚中MMP-1基因表達(dá)顯著升高，經(jīng)香蕉皮多酚干預(yù)后，大鼠皮膚組織中MMP-1表達(dá)顯著降低，提示香蕉皮多酚可通過下調(diào)MMP-1基因的表達(dá)來降低MMP-1蛋白的合成，延緩膠原降解、恢復(fù)纖維結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮延緩皮膚衰老的作用.

AQP3可通過增加表皮水分和水合作用，提高皮膚甘油和尿素等溶質(zhì)的通透性，從而減少水分的丟失，起到保濕作用[21-22].也可與中間絲相關(guān)蛋白協(xié)同完成皮膚的屏障修復(fù)[23].亦有研究表明，AQP3與皮膚自然衰老及光老化有密切關(guān)系，當(dāng)皮膚缺失AQP3或暴露于紫外線時(shí)，會導(dǎo)致皮膚干燥和老化[24-25].因此，AQP3可作為抗衰老藥物的作用靶點(diǎn)，在皮膚衰老過程中及延緩衰老治療中有很重要的研究意義.本試驗(yàn)結(jié)果顯示，衰老模型組大鼠皮膚中AQP3基因表達(dá)顯著降低，經(jīng)香蕉皮多酚作用后，大鼠皮膚組織中AQP3表達(dá)顯著上調(diào)，提示香蕉皮多酚可通過增加AQP3的表達(dá)量，使皮膚細(xì)胞的水合能力、甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)能力增加，從而改善皮膚表面粗糙等衰老表現(xiàn)，起到抗皮膚衰老的作用.

4 結(jié)論

綜上所述，香蕉皮多酚對衰老大鼠皮膚組織的損傷有明顯的保護(hù)作用，這種作用可能與增加膠原蛋白含量、抑制皮膚細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)MMP-1和AQP3基因的表達(dá)有關(guān).香蕉皮多酚作為一種天然產(chǎn)物，可開發(fā)用于美容治療及美容保健的功能性食品.