舒迎霜，賀濛初，桂雪兒，夏曉冬，馮士彬，李玉，王希春，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230061)

黃芪在我國(guó)已有兩千多年的使用歷史，味甘微溫，具有益氣固表、斂汗固脫、利水消腫之功效[1].其中黃芪多糖是黃芪中最主要的活性成分，是一種可溶于水的中雜性多糖，在體內(nèi)體外均具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，可參與機(jī)體的一系列免疫反應(yīng)、抗腫瘤和抗氧化等過程[2-3].經(jīng)研究證實(shí)，腸道內(nèi)微生物、多糖的代謝與機(jī)體免疫水平三者相互作用、密不可分[4].多糖可顯著促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌的增殖，提高腸道微生物多樣性，腸道微生物亦可參與多糖代謝，將多糖降解為短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸含量與腸道免疫與健康密切相關(guān)[5-7].犬腸道中微生物較為豐富的部位為后腸段，其中盲腸內(nèi)微生物多樣性最高，試驗(yàn)表明通過調(diào)控犬腸道內(nèi)微生物的多樣性可改善犬腸道免疫功能，影響機(jī)體健康[8].Tanl等[9]研究認(rèn)為，黃芪多糖可顯著提高畜禽生產(chǎn)性能并且能夠改善畜禽腸道發(fā)育.何旭云等[10]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可恢復(fù)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的腸道菌群紊亂現(xiàn)象.廖寧波等[11]發(fā)現(xiàn)河蜆多糖 CSPF-N可改變腸道微生物結(jié)構(gòu)，微生物結(jié)構(gòu)主要由厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門組成.

前期研究表明，黃芪多糖可增強(qiáng)犬血清及腸粘膜免疫，加強(qiáng)其機(jī)體免疫力[12].本研究擬以18只健康比格犬為試驗(yàn)動(dòng)物，在日糧中添加黃芪多糖，通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)犬盲腸菌群細(xì)菌數(shù)量、菌群多樣性以及群落結(jié)構(gòu)組成和豐度進(jìn)行分析，探討黃芪多糖對(duì)犬盲腸菌群的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)理，為黃芪多糖在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選取18只1歲齡健康比格犬，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院提供，動(dòng)物合格證號(hào)為ZXD-C2017917，體質(zhì)量約10 kg，試驗(yàn)前正常飼養(yǎng)觀察7 d，試驗(yàn)前常規(guī)驅(qū)蟲與免疫，每天定時(shí)飼喂2次基礎(chǔ)日糧，上下午各1次(每次15 g/kg)，自由飲水.

黃芪(制備好的中藥飲片)，購(gòu)自合肥立方大藥房；PBS緩沖液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸、NaOH，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；食用酒精，購(gòu)自無錫展望化工試劑有限公司.

TD-100小型提取濃縮機(jī)，購(gòu)自浙江森力機(jī)械科技有限公司；LGJ-12N冷凍干燥機(jī)，購(gòu)自北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司；DHG-9243B5-Ⅲ電熱恒溫干燥箱，購(gòu)自上海新苗醫(yī)療器械有限公司；HHS型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；臺(tái)式低速離心機(jī)，購(gòu)自湖南赫西儀器裝備有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中藥制備 根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，稱取5 kg黃芪，去除雜質(zhì)，清洗3次，瀝干水分，按照料液比1∶10的比例加入50 L濃度為80%的酒精提取3次，每次1 h，去除油脂.取出未粉碎的藥渣用電恒溫干燥箱60 ℃烘干，再稱質(zhì)量，按照料液比1∶20的比例加入純水，超聲波震蕩提取80 min.將藥液轉(zhuǎn)移至濃縮罐中濃縮至4 L，再加入3倍量的95%的酒精，4 ℃靜置12 h，使黃芪多糖沉淀，3 000 r/min離心5 min，取沉淀，加蒸餾水溶解至4 L.加入等體積5%的三氯乙酸，同時(shí)加入適量活性炭(樣品量的15%～20%)脫色，濾去活性炭，4 ℃靜置24 h，使蛋白沉淀除去蛋白.3 000 r/min離心5 min，棄去沉淀，取上清液加2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，濃縮至4 L.加入3倍量95%酒精，使醇濃度達(dá)到80%，低溫靜置，得疏松沉淀物，洗滌干燥得脫蛋白黃芪多糖粉，4 ℃保存?zhèn)溆?考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得蛋白質(zhì)去除率為80.25%，苯酚硫酸法測(cè)得多糖含量為12.91%.

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組 將18只犬隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組(只飼喂基礎(chǔ)日糧)，低劑量組(基礎(chǔ)日糧+以生藥計(jì)1%的黃芪多糖)，高劑量組(基礎(chǔ)日糧+以生藥計(jì)2%的黃芪多糖)，每組6只，試驗(yàn)期14 d，試驗(yàn)期間各組犬的管理?xiàng)l件完全一致.

1.2.3 樣品采集 第14天，將全部試驗(yàn)犬麻醉放血后再解剖.點(diǎn)酒精燈在超凈工作臺(tái)內(nèi)采取盲腸內(nèi)容物于2 mL無菌管中，保存于-80 ℃冰箱，用于高通量測(cè)序.

1.2.4 總DNA提取和16S rDNA測(cè)序 使用QIAamp DNA Microbiome Kit試劑盒提取犬盲腸內(nèi)容物中細(xì)菌總DNA，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行.通過分光光度計(jì)檢測(cè)在260 nm處的OD值測(cè)得DNA的濃度，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

根據(jù)16S rDNA 基因的V4區(qū)保守序列設(shè)計(jì)通用引物對(duì)：515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系：Q5 Reaction Buffer 0.5 μL，滅菌超純水8.75 μL，Q5 GC high Enhancer 5.0 μL，dNTP 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，Q5 Polymerase 0.25 μL，模板DNA(40 ng)2.0 μL.擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性300 s，隨后94 ℃ 60 s，64 ℃復(fù)性60 s，72 ℃延伸600 s，共25個(gè)循環(huán).每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).文庫(kù)測(cè)序使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent DNA 1000 Reagents)確定平均分子長(zhǎng)度，并通過實(shí)時(shí)定量PCR(q-PCR)(TaqMan Probe)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量.總DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和基于Illumina MiSeq平臺(tái)的測(cè)序由深圳華大基因協(xié)助完成.

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣品數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，濾除低質(zhì)量的reads，剩余高質(zhì)量的Clean data方可用于后期分析；通過reads之間的Overlap關(guān)系將reads拼接成Tags；在給定的相似度下將Tags聚成OTU，然后通過OTU與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋；基于OTU和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜程度分析以及組間物種差異分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果與α多樣性分析

2.1.1 測(cè)序結(jié)果 從對(duì)照組、黃芪多糖低劑量組和黃芪多糖高劑量組3組犬盲腸9個(gè)樣品中共獲得885 399條Tags,通過在97%的相似度下將已拼接優(yōu)化的Tags聚類為OTU，OTU主要用于將不同物種進(jìn)行分類，可以通過OTU所代表的不同種屬找出不同環(huán)境下的核心生物.每個(gè)樣品OTU統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示.

表1 測(cè)序結(jié)果

Venn圖展示了所有樣品的OTU數(shù)，并且可以直觀的看出樣品之間獨(dú)有和重疊的OTU數(shù)目.OTU的豐度表示樣品的豐度.由圖1可知，本試驗(yàn)的9個(gè)樣品總共得到OTU數(shù)為1 710個(gè)，對(duì)照組559個(gè)，黃芪多糖低劑量組573個(gè)，黃芪多糖高劑量組578個(gè).結(jié)果顯示，黃芪多糖組與對(duì)照組之間菌群豐富程度存在差異，黃芪多糖組菌群豐富度較對(duì)照組有升高趨勢(shì)，而黃芪多糖低劑量組與高劑量組之間菌群豐度無明顯差異.

2.1.2 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性分析是針對(duì)某個(gè)樣品內(nèi)物種的多樣性進(jìn)行分析，主要包括Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)，Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)等.前4個(gè)指數(shù)越大，最后1個(gè)指數(shù)越小，說明樣品中的物種豐富度越大，群落多樣性越高.由表2可知，對(duì)照組前4個(gè)指數(shù)均小于黃芪多糖組，Simpson指數(shù)大于黃芪多糖組，說明黃芪多糖組盲腸內(nèi)容物的豐富度和多樣性高于對(duì)照組，且各個(gè)樣品的覆蓋率均大于0.999，測(cè)序的深度幾乎覆蓋了樣本中的所有物種，表明本試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有有效性.

D:對(duì)照組；E:黃芪多糖低劑量組；F:黃芪多糖高劑量組.

2.2 PCA分析

PCA分析即主成分分析，不同樣品的OTU組成不同，通過分析樣品的OTU組成，可以反映樣品微生物組成的差異.如果在二維平面上2個(gè)樣品距離越相近，則組成就越相似.本試驗(yàn)的主成分分析圖如圖2所示，圖中橫坐標(biāo)為第一主成分分析(PC1)，檢測(cè)到的總微生物的代表性貢獻(xiàn)率為48.44%，縱坐標(biāo)為第二主成分分析(PC2)，貢獻(xiàn)率為22.13%.對(duì)照組點(diǎn)與黃芪多糖組點(diǎn)明顯分開，離散性較高，表明對(duì)照組與黃芪多糖組樣品中微生物組成差異較大；黃芪多糖低劑量組和高劑量組點(diǎn)基本聚集在同一范圍內(nèi)，離散性低，重疊部分較大，雖也分開但距離相近，說明飼喂黃芪多糖組犬盲腸內(nèi)微生物組成更為相似.

橫坐標(biāo)表示第一主成分，括號(hào)中的百分比則表示第一主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值；縱坐標(biāo)表示第二主成分，括號(hào)中的百分比表示第二主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值；圖中點(diǎn)分別表示各個(gè)樣品；不同顏色代表樣品屬于不同的分組.

表 2 Alpha多樣性分析

2.3 犬腸道微生物組成及其豐度分析

2.3.1 門水平上腸道微生物豐度 由表3和圖3可知，在門水平上犬腸道微生物主要由5個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門組成，分別為放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌門(Proteobacteria).

與對(duì)照組相比，黃芪多糖組放線菌門和厚壁菌門顯著升高(P<0.05)；變形菌門顯著降低(P<0.05).黃芪多糖組擬桿菌門和梭桿菌門差異均不顯著(P>0.05)，但梭桿菌門有降低趨勢(shì).

圖3 樣本門分類水平中物種分布柱狀圖

表3 腸道微生物在門水平的物種豐度顯著性分析

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

The lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).

2.3.2 綱水平上腸道微生物豐度 由表4可知，在綱水平上犬腸道微生物主要由8個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群組成，分別由放線菌綱(Actinobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、梭菌綱(Clostridia)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)和梭桿菌綱(Fusobacteriia)組成.

與對(duì)照組相比，黃芪多糖組放線菌綱和芽孢桿菌綱顯著升高(P<0.05)，β-變形菌綱極顯著降低(P<0.01)，丹毒絲菌綱和梭桿菌綱顯著降低(P<0.05).黃芪多糖組擬桿菌綱和梭菌綱與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05).

表4 腸道微生物在綱水平的物種豐度顯著性分析

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).

The lowercase letters indicate significant difference(P<0.05)；The uppercase letters indicate extremely significant difference(P<0.01).

2.3.3 科水平上腸道微生物豐度 由表5可知，在科水平上犬腸道微生物組成有13種，其中主要為產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae).

與對(duì)照組相比，黃芪多糖組梭桿菌科極顯著降低(P<0.01)；雙歧桿菌科和乳桿菌科顯著升高(P<0.05)；黃芪多糖低劑量組普雷沃氏菌科顯著升高(P<0.01)，高劑量組極顯著升高(P<0.01).

表5 腸道微生物在科水平的物種豐度顯著性分析

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).

The lowercase letters indicate significant difference(P<0.05)；The uppercase letters indicate extremely significant difference(P<0.01).

2.3.4 屬水平上腸道微生物豐度 由表6可知，在屬水平上犬腸道微生物組成有26種，其中比重較多的有10種，分別為別樣棒菌屬(Allobaculum)、擬桿菌屬(Bacteroides)、勞特氏菌屬(Blautia)、梭菌屬(Clostridium)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、普氏菌屬(Prevotella)、薩特氏菌屬(Sutterella).

與對(duì)照組相比，黃芪多糖組別樣棒菌屬極顯著增加(P<0.01)，勞特氏菌屬、乳酸菌屬和普氏菌屬顯著增加(P<0.05)；黃芪多糖低劑量組梭桿菌屬顯著降低(P<0.05)，高劑量組極顯著降低(P<0.01)；黃芪多糖組擬桿菌屬、糞桿菌屬和薩特氏菌屬與對(duì)照組相比均無顯著差異(P>0.05).

表6 腸道微生物在屬水平的物種豐度顯著性分析

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01).

The lowercase letters indicate significant difference(P<0.05)；The uppercase letters indicate extremely significant difference(P<0.01).

3 討論

3.1 黃芪多糖對(duì)犬盲腸微生物群落多樣性的影響

黃芪多糖作為黃芪中含量較高的免疫活性物質(zhì)之一，能夠顯著促進(jìn)機(jī)體免疫器官和免疫細(xì)胞的發(fā)育，提高動(dòng)物的免疫力和生產(chǎn)性能，在畜禽養(yǎng)殖上可作為1種免疫佐劑被廣泛應(yīng)用.并且多糖作為益生元，可刺激機(jī)體腸道中部分益生菌的增值以及代謝水平，調(diào)節(jié)人體腸道菌群多樣性改善機(jī)體健康[4].動(dòng)物腸道中棲息著數(shù)量龐大且復(fù)雜的菌群，能夠維持機(jī)體胃腸道系統(tǒng)的生態(tài)平衡，進(jìn)一步促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[14-15].并且正常動(dòng)物體內(nèi)的微生物群落是重要的腸道保護(hù)屏障，對(duì)于某些病原微生物的入侵有顯著的拮抗作用.本試驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)9只犬的新鮮糞便進(jìn)行測(cè)序分析，3組犬盲腸9個(gè)樣品中共獲得885 399條高質(zhì)量的細(xì)菌16S rDNA 序列.Alpha多樣性分析和PCA分析顯示，各組覆蓋率均大于0.999，說明本次試驗(yàn)測(cè)序結(jié)果已基本覆蓋所有樣本，證實(shí)了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，另外飼喂黃芪多糖組Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)均高于對(duì)照組，而Simpon指數(shù)小于對(duì)照組，這說明隨著飼糧中黃芪多糖含量的增加，犬盲腸內(nèi)微生物數(shù)量和群落多樣性也在升高，且黃芪多糖組犬腸道菌群組成更為相似.甄玉國(guó)等[16]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可提高斷奶仔豬盲腸菌群細(xì)菌數(shù)量，與本試驗(yàn)結(jié)果相一致.

3.2 黃芪多糖對(duì)犬盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

通過高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，飼喂黃芪多糖后犬盲腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌門主要為放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、變形菌門.Norouzi等[17]研究發(fā)現(xiàn)放線菌可抵抗多種抗耐藥性病原微生物，屬于潛在益生菌.厚壁菌門的部分細(xì)菌能促進(jìn)多糖在腸道中充分發(fā)酵，維持動(dòng)物腸道健康，提高免疫[18].梭桿菌門內(nèi)細(xì)菌大部分為條件致病菌，一定情況下會(huì)導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生.變形菌門包括大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等，多數(shù)為病原菌，易引起疾病損害機(jī)體健康.與對(duì)照組相比，飼喂黃芪多糖組犬腸道內(nèi)放線菌門、厚壁菌門細(xì)菌所占比例顯著增加，變形菌門顯著降低；梭桿菌門有降低趨勢(shì)，這與賀琴等[19]研究結(jié)果相似.在綱水平上，放線菌綱和芽孢桿菌綱顯著升高，β-變形菌綱、丹毒絲菌綱和梭桿菌綱顯著降低.

在科水平上，梭桿菌科顯著降低，雙歧桿菌科、乳桿菌科和普雷沃氏菌科顯著升高；在屬水平上，別樣棒菌屬、勞特氏菌屬、乳酸菌屬和普氏菌屬顯著增加；梭桿菌屬顯著降低，與李樹鵬等[20]試驗(yàn)結(jié)果相一致.王學(xué)智等[21]發(fā)現(xiàn)一定劑量和濃度的黃芪粗多糖在體外有利于雞腸道部分細(xì)菌增值，主要為乳桿菌和雙歧桿菌.有研究發(fā)現(xiàn)梭桿菌屬主要與結(jié)直腸癌有關(guān)[22]，結(jié)直腸癌患者腸道中梭桿菌屬細(xì)菌數(shù)量較正常人顯著上升，本研究結(jié)果顯示梭桿菌屬細(xì)菌數(shù)量有所降低，可能與黃芪多糖有顯著的抗癌、抗腫瘤作用有關(guān).普雷沃氏菌科主要功能是分解淀粉、粘蛋白以及半纖維素等代謝產(chǎn)物，同時(shí)可產(chǎn)生短鏈脂肪酸[23].腸道中有益菌大多可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸作用有抗炎、保護(hù)腸黏膜功能、調(diào)節(jié)代謝水平和免疫功能等作用，能產(chǎn)生短鏈脂肪酸的細(xì)菌主要有勞特氏菌屬、別樣棒菌屬、普氏菌屬、乳酸菌屬等.腸道中有害菌大多會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，腸道中內(nèi)毒素含量上升會(huì)引起腸道炎癥反應(yīng)、腸黏膜功能紊亂、代謝失衡和免疫失調(diào)等一系列疾病，能產(chǎn)生內(nèi)毒素的細(xì)菌主要包括變形菌門以及梭桿菌門的細(xì)菌[24-25].同時(shí)，多糖也可被腸道內(nèi)微生物分解為短鏈脂肪酸，主要為乙酸、丙酸和丁酸，腸上皮細(xì)胞可將多糖降解的丁酸重新利用，調(diào)控腸上皮細(xì)胞和腸上皮間淋巴細(xì)胞的增值和凋亡，且代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)可以維持腸道內(nèi)酸性環(huán)境[26-27].低pH環(huán)境對(duì)部分病原微生物的生長(zhǎng)非常不利，有害微生物的生存條件更加困難，病原微生物入侵腸道導(dǎo)致腸道疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，從側(cè)面保護(hù)了腸黏膜免疫屏障的完整性.

4 結(jié)論

在犬日糧中添加黃芪多糖在一定時(shí)間內(nèi)可使犬腸道內(nèi)菌群數(shù)量增多，多樣性上升，且黃芪多糖可使腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，益生菌所占比例增加，條件致病菌比例下降，從而加強(qiáng)腸道的保護(hù)屏障，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力.而黃芪多糖低劑量組與高劑量組盲腸菌群數(shù)量、多樣性和群落組成結(jié)構(gòu)無明顯差異.