魏 帥，劉 媛，劉蒙娜，孫欽秀，劉書成，吉宏武，郝記明，鄧楚津，毛偉杰

凡納濱對蝦多酚氧化酶的純化鑒定與生物信息學(xué)分析

魏 帥，劉 媛，劉蒙娜，孫欽秀，劉書成，吉宏武，郝記明，鄧楚津，毛偉杰

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研發(fā)中心，廣東省海洋生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034；3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（湛江），廣東 湛江 524088）

【目的】從凡納濱對蝦（）中分離純化多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO），進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，分析其生物學(xué)信息?！痉椒ā坎捎昧蛩徜@沉淀結(jié)合柱層析法從蝦頭胸部中提取純化PPO，電泳法確定其分子質(zhì)量，采用液相質(zhì)譜聯(lián)用法分析氨基酸序列結(jié)構(gòu)，根據(jù)分析結(jié)果，同源建模并進(jìn)行評估?！窘Y(jié)果與結(jié)論】獲得了高純度的PPO，其純化倍數(shù)為65.7，酶比活力達(dá)650.1 U/mg蛋白，得率為29.5%。PPO分子質(zhì)量約為72 ku。經(jīng)質(zhì)譜檢測分析和basic local alignment search tool（BLAST）序列比對，純化蛋白與凡納濱對蝦酚氧化酶原的氨基酸序列相似性為65%，匹配度分值為11 321，確認(rèn)為PPO。PPO是一種親水性大于疏水性的兩性蛋白，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，建立的PPO三維結(jié)構(gòu)模型可靠性較高。

凡納濱對蝦；多酚氧化酶；質(zhì)譜；鑒定；生物信息學(xué)

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是動植物和真菌體內(nèi)廣泛存在的一種酶，分為單酚單氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase，EC.1.14.18.1）、雙酚氧化酶（兒茶酚氧化酶catechol oxidse，EC.1.10.3.2）與漆酶（laccase，EC.1.10.3.1）[1]。PPO可催化單酚羥基化形成二元酚及二元酚氧化成鄰醌類[2]。通常PPO以酚氧化酶原（Propolyphenoloxidase，proPPO）形式存在，不具催化活性，但與模式識別蛋白、絲氨酸蛋白酶等一同構(gòu)成復(fù)雜的proPPO激活系統(tǒng)。在生物體受到損傷或死亡后，一些外源多糖與模式識別蛋白結(jié)合，會激活proPPO生成PPO[3-5]。Cu2+結(jié)合區(qū)為PPO的主要功能區(qū)，N-端導(dǎo)肽和和C-端疏水區(qū)對酶的構(gòu)象、高級結(jié)構(gòu)的形成和維持起作用[1]。Cu2+結(jié)合區(qū)富含組氨酸（His）殘基，每個(gè)Cu2+與3個(gè)His殘基以配位鍵相連，形成了具有特定三維結(jié)構(gòu)的活性部位[6]。

蝦類捕獲后如果未及時(shí)處理或處理不當(dāng)，在后續(xù)的貯藏與加工過程中易發(fā)生黑變，尤其是在蝦體頭部、胸部以及尾部和關(guān)節(jié)處，這是由于PPO催化單酚生成二酚，氧化生無色醌類物質(zhì)，在非酶促反應(yīng)下聚合生成黑色素，導(dǎo)致蝦黑變[7]。蝦體黑變一旦發(fā)生就很難去除，雖然對蝦營養(yǎng)價(jià)值影響較小，但對蝦感官品質(zhì)和商品價(jià)值影響較大，影響其市場銷售和經(jīng)濟(jì)效益[8-9]。低溫貯藏等手段可以在一定程度上保持蝦的品質(zhì)，延長貯藏期，但黑變問題仍然存在，需聯(lián)合其它可能的手段進(jìn)行控制[10]，蝦類黑變已成為目前限制蝦類保鮮與加工的重要瓶頸技術(shù)問題之一。本研究從凡納濱對蝦出分離出高純度PPO，分析其分子結(jié)構(gòu)和理化特性以及分子生物學(xué)信息，以期根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)采用針對性處理降低其酶活或鈍化，進(jìn)而為研究控制對蝦黑變技術(shù)提供相應(yīng)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對蝦購于廣東湛江市霞山區(qū)東風(fēng)水產(chǎn)批發(fā)市場，選取質(zhì)量均一〔（15±0.5）g〕鮮活蝦，充氧保活運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，自來水清洗后加冰猝死，立即取蝦頭胸部用于PPO提取。

聚氧乙烯月桂醚和左旋多巴胺[3-(3,4-Dihydroxyphenyl)--alanine,-DOPA]購于美國Sigma公司，三羥甲基氨基甲烷購于上海麥克林生化科技有限公司，Q Sepharose Fast Flow和Superdex 200填料購于通用電氣（中國）有限公司，二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白質(zhì)含量測定試劑盒、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE）配制試劑盒、非變性PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、考馬斯亮藍(lán)染色液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Marker）購于廣州鼎國生物科技有限公司，乙腈購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

DLSB-10/20型低溫冷卻液循環(huán)泵（成都一科儀器設(shè)備有限公司），Cary 60型紫外可見分光光度計(jì)（安捷倫科技有限公司），Thermo Lynx 6000型高速落地離心機(jī)、Varioskan Flash型全自動酶標(biāo)儀、Q-EXACTIVE型串聯(lián)ESI質(zhì)譜儀〔賽默飛世爾科技（中國）限公司〕，HH?S21-8-S型電熱恒溫水浴鍋（上海圣科儀器設(shè)備有限公司），AKTA purifier 100型制備型蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)〔通用電氣（中國）公司〕，組織勻漿機(jī)（九陽股份有限公司），SLI-700型恒溫培養(yǎng)箱（上海愛朗儀器有限公司），基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（德國布魯克公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PPO分離純化 PPO粗酶液的提取參考Nirmal等[11]法。稱取新鮮凡納濱對蝦頭胸部850 g，添加2 550 g磷酸鹽緩沖液，搗碎勻漿靜置3 h；離心后取上清液，添加固體硫酸銨至飽和度40 %，靜置30 min；離心，沉淀溶于磷酸鹽緩沖液中透析18 h，離心得到清液即為PPO液體，-70℃儲存?zhèn)溆茫ㄒ陨喜僮骶? ℃條件下進(jìn)行）。

采用離子交換層析進(jìn)行粗酶液純化，參考Fan等[12]法。將45 mL粗酶液上樣于Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱（2.6 cm × 30 cm），用Tris-HCl溶液洗脫，測定PPO酶活和蛋白質(zhì)含量。凝膠層析時(shí)取上一步收集的PPO組分3 mL，上樣于經(jīng)平衡的Superdex 200凝膠層析柱（1.6 cm×70 cm），緩沖液洗脫時(shí)流速設(shè)為1 mL/min，收集洗脫液，每管2 mL，測定PPO酶活和蛋白質(zhì)含量。合并高PPO活性的洗脫液，測總活力和總蛋白，用超濾管濃縮，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PPO酶活力測定 參考黃萬有等[13]法，取100 μL PPO液體加入400 μL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），加入600 μL 15 mmol/L L-DOPA溶液，45 ℃水浴反應(yīng)3 min，檢測光密度。用100 μL去離子水為空白對照。酶活定義：每分鐘每毫升的酶在475 nm下光密度值每增加0.001為1 U，單位：U?min-1?mL-1。

PPO酶活力=（1-2）/（×）×1000，

其中，1為PPO的光密度值；2為空白對照的光密度值；為反應(yīng)時(shí)間，min；為酶液的體積，mL。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測定 以BSA標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，96孔板中分別加入20 μL質(zhì)量濃度0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品，加入200 μL BCA工作試劑。取20 μL樣品，加入200 μL BCA，60 ℃下孵育30 min，用酶標(biāo)儀在562 nm波長下測其最大光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 電泳分析 將純化的PPO濃縮液，采用SDS-PAGE檢測分子質(zhì)量。SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）與樣品以1∶4的比例上樣15 μL，上樣量為50 μg，電泳完畢后，以考馬斯亮藍(lán)染色液染色膠條。采用Native-PAGE電泳檢測其活性。分離膠和濃縮膠的體積分?jǐn)?shù)分別為12%和5%，非變性PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）與樣品以體積比1∶4的比例上樣15 μL，上樣量為50 μg，含樣品的上樣液未經(jīng)煮沸，電泳完畢后，用15 mmol/L L-DOPA溶液染色膠條。

1.3.5 質(zhì)譜分析 將含PPO的SDS-PAGE膠條切下，進(jìn)行Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS）分析和Liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry（LC-ESI- MS/MS）分析，Mascot及BLAST數(shù)據(jù)庫檢索比對氨基酸序列。

1.3.6 PPO生物信息學(xué)分析 根據(jù)測得的PPO氨基酸序列，采用Expasy站點(diǎn)分析預(yù)測PPO生物學(xué)信息[14]，采用ProtParam分析PPO氨基酸組成和特性、ProtScale分析疏水性、GOR和predictprotein seartificial預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。用BLAST程序在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫Protein Data Bank（PDB）中搜索同源蛋白，采用SWISS-MODEL工作站進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模，并在該工作站對建模結(jié)果進(jìn)行評估。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用Excel進(jìn)行方差分析和作圖，生物信息學(xué)分析相關(guān)數(shù)據(jù)從各工作站讀取。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPO的分離純化

對粗酶液進(jìn)行Q Sepharose Fast Flow離子交換柱層析，可較好分離PPO粗酶液，選取PPO活性較高的收集液進(jìn)行凝膠層析柱分離。選取PPO酶活力和蛋白質(zhì)含量都較高的收集液進(jìn)行再次Q Sepharose Fast Flow離子交換柱層析，獲取更高純度的PPO，以PPO酶活最高的洗脫液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

A為凝膠層析分離圖，B為凝膠層析洗脫液的酶活和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（2 mL/管）； C為離子交換層析分離圖，D為離子交換洗脫液的酶活和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（5 mL/管）

A means the separation chromatogram using superdex 200, B means the enzyme activity and protein content of the elution (2 mL/tube) using superdex 200; C means the ion exchange separation chromatogram, D means the enzyme activity and protein content of the elution (5 mL/tube) using ion exchange separation

圖1 多酚氧化酶PPO凝膠層析譜圖和離子交換柱層析圖譜

Fig. 1 The separation chromatography using superdex 200 and ion exchange separation chromatography of PPO

凡納濱對蝦PPO粗酶液純化結(jié)果見表1，純化倍數(shù)達(dá)到65.7，酶比活力大大提高，達(dá)到650.1 U/mg蛋白。Chen等[15]用硫酸銨沉淀和和高效疏水性色譜柱純化粉紅蝦和白對蝦的PPO，純化倍數(shù)為50，酶比活力為100 U/mg蛋白；用丁醇處理和高效疏水性色譜柱純化粉紅蝦和白對蝦的PPO，純化倍數(shù)為200，酶比活力在320 U/mg蛋白以上。Rolle等[16]用硫酸銨沉淀和高效疏水性色譜柱（苯基瓊脂糖CL-4B）純化斑節(jié)對蝦的PPO，純化倍數(shù)和酶比活力為58和1.33 U/mg蛋白。樊廷俊等[17]用Sephacryl S-100凝膠柱和Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱純化中國對蝦的PPO，純度達(dá)到30.2，酶比活力達(dá)258.0 U/mg蛋白。蝦類PPO純化方法較多，但其純化效果不同，產(chǎn)生差異原因可能是由于PPO中酚類化合物濃度和類型不同影響了PPO與其他蛋白質(zhì)的整體結(jié)合，目前已發(fā)現(xiàn)PPO-蛋白質(zhì)會干擾蛋白質(zhì)的純化，該酶中所含的離子和疏水特性因與酚類物質(zhì)的結(jié)合而隨之改變，這也導(dǎo)致純化過程中需選擇不同的洗脫方式[18]。

表1 凡納濱對蝦中多酚氧化酶PPO純化

注：比活力 = 總活力/總蛋白質(zhì)量，純化倍數(shù) = 各步驟分離組比活力/粗酶液比活力；得率 = 各步驟分離組分總活力/粗酶液總活力。

Note：Specific activity =total activity /total protein, purification fold = specific activity of each separation step / specific activity of crude extract; yield = total activity of each separation step / total activity of crude extract.

另外，不同品種蝦PPO活性以及提取過程所攜帶雜質(zhì)存在差異，各純化方法效率也存在差異，所得到PPO純度也不相同。

2.2 PPO分子質(zhì)量

純化后PPO的SDS-PAGE和Native-PAGE電泳圖譜如圖2所示，SDS-PAGE電泳中PPO在72 ku處有條帶，經(jīng)LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定，該條帶為PPO。Native-PAGE電泳中PPO在210 ku處顯示條帶，與Nirmal等[8]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。PPO分子質(zhì)量大小依據(jù)電泳形式的不同而有所變化，此類蛋白以多聚體形式存在，尤其是在Native-PAGE中，而SDS-PAGE中因所帶電荷不同引起的遷移率不一使分子質(zhì)量分散且有所降低[19]。單個(gè)PPO亞基多為低分子質(zhì)量，分別有71 ku[20]、40 ku[21]、97 ku、88 ku和82 ku[15]，甲殼動物的PPO由于表面帶電基團(tuán)較少易形成聚集體[22]。PPO基因有兩個(gè)區(qū)域，一是與銅離子有關(guān)的編碼區(qū)，另一個(gè)是引導(dǎo)肽，PPO酶原含有引導(dǎo)肽，酶原去除引導(dǎo)肽后變成有活性的成熟PPO，不同品種蝦中的引導(dǎo)肽分子質(zhì)量不一致，導(dǎo)致PPO分子質(zhì)量不同[23]。

2.3 PPO的質(zhì)譜分析

SDS-PAGE膠上蛋白經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，確定72 ku處條帶為PPO，為精確鑒定出所純化PPO的氨基酸序列，進(jìn)一步采用了LC-ESI-MS/MS進(jìn)行分析。酶解后的膠上蛋白以多肽片段形式進(jìn)入LC-ESI-MS/MS進(jìn)行分析，確定有質(zhì)譜信號，經(jīng)Mascot數(shù)據(jù)庫檢索后鑒定出PPO，其蛋白質(zhì)得分與蛋白中所含肽段得分結(jié)果見圖3。匹配分值的計(jì)算方法為-10 lg，值為蛋白可以隨機(jī)匹配的概率，根據(jù)Mascot評分判斷（< 0.05），匹配值大于45時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，根據(jù)此得分的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果可信[24]。選擇一級質(zhì)譜中信噪比大于10的肽段進(jìn)行LC-MS/MS分析，二級質(zhì)譜結(jié)果共有26個(gè)肽段含455個(gè)氨基酸殘基。將分析結(jié)果與BLAST數(shù)據(jù)庫中氨基酸序列進(jìn)行對比，與凡納濱對蝦的酚氧化酶原（序列號ABQ45957，分子質(zhì)量為78.985 ku）的序列相似性為65 %，匹配度分值為11 321，等電點(diǎn)為6.05，氨基酸殘基比對結(jié)果見圖4。

M，標(biāo)準(zhǔn)蛋白，ku；1，PPO的SDS-PAGE電泳條帶；2，PPO的Native-PAGE電泳條帶。

圖3 經(jīng)LC-MS/MS分析后得到的Mascot檢索

Fig .3 Mascot result of PPO from SDS-PAGE after LC-MS/MS

灰色背景字母為比對上的氨基酸殘基

2.4 PPO的理化特性分析

利用ExPASy站點(diǎn)的ProtParam程序?qū)PO的氨基酸組成進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖5所示。PPO中含量最多的氨基酸為亮氨酸（Leu，9.4%），其次為精氨酸（Arg，7.5%）、天冬氨酸（Asp，7.5%）和纈氨酸（Val，7.1%）。對PPO活性中心起重要作用的組氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）含量分別為3.6 %和0.7 %。PPO中疏水性氨基酸含量為43.4 %，分別為亮氨酸（Leu，9.4 %）、纈氨酸（Val，7.1 %）、丙氨酸（Ala，6.5 %）、脯氨酸(Pro，6.2 %)、苯丙氨酸（Phe，5.8 %）、蛋氨酸（Met，3.2 %）、異亮氨酸（Ile，3.8 %）和色氨酸（Trp，1.4 %）。親水性最強(qiáng)的兩種氨基酸為精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys），分別占7.5 %和4.1 %對PPO的理化特性進(jìn)行分析（表2），不穩(wěn)定指數(shù)是對蛋白質(zhì)在實(shí)驗(yàn)中的穩(wěn)定性評估，通常蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)大于40時(shí)為不穩(wěn)定蛋白，小于40時(shí)為穩(wěn)定蛋白[25]，PPO為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為脂肪族側(cè)鏈所占的相對體積，該值被認(rèn)為可能與提高球蛋白熱穩(wěn)定性有關(guān)，也可表征蛋白質(zhì)的疏水性，數(shù)值越大表明疏水性越強(qiáng)[26]，PPO的脂肪系數(shù)為78。平均親水系數(shù)可用于表征蛋白質(zhì)的疏水性，其范圍一般在2與-2之間，大于0時(shí)為疏水蛋白，小于0時(shí)為親水蛋白[27]。從表2可以看出，PPO既具有一定的親水性，又具有一定疏水性，是一種兩性蛋白。

圖5 多酚氧化酶PPO的氨基酸組成分析

表2 多酚氧化酶PPO的理化特性

利用ExPASy中的ProtScale網(wǎng)站對PPO進(jìn)一步作疏水性分析，氨基酸標(biāo)度值為賦予每種類型氨基酸的數(shù)值。最常用的量表是疏水性或親水性量表。Hphob./Kyte & Doolittle量表規(guī)定疏水性越強(qiáng)的氨基酸標(biāo)度值越高，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的氨基酸標(biāo)度值大于0時(shí)為疏水性蛋白，小于0時(shí)為親水性蛋白[25]。從圖6可看出，PPO評分值既有正值也有負(fù)值，但稍偏向負(fù)值，PPO親水性大于疏水性。

2.5 PPO的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)常見的二級結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等，它們是構(gòu)成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的基本元素。利用PredictProtein seartificial和ExPASy中的GOR網(wǎng)站分別對凡納濱對蝦PPO二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。PredictProtein seartificial對二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測是以蛋白質(zhì)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為依據(jù)，預(yù)期平均精度超過72%[28]。GOR算法以信息論為基礎(chǔ)，同時(shí)考慮被預(yù)測位置氨基酸殘基種類對該位置構(gòu)象的影響及相鄰殘基種類對該位置構(gòu)象的影響兩個(gè)方面，物理意義清楚明確，數(shù)學(xué)表達(dá)嚴(yán)格，預(yù)測的成功率也在70%以上[29]。

縱坐標(biāo)為氨基酸的標(biāo)度值

PredictProtein seartificial預(yù)測PPO的二級結(jié)構(gòu)主要是以卷曲形式（61.36%）和螺旋形式（24.89%）為主，折疊結(jié)構(gòu)為13.75%，埋藏內(nèi)部（51.23%）的氨基酸殘基稍多于暴露表面（37.48%）的氨基酸殘基。GOR預(yù)測PPO二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)占33.29%，β-折疊結(jié)構(gòu)占15.92%，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)占50.8%。兩種結(jié)構(gòu)預(yù)測方法數(shù)據(jù)存在差異，但總體趨勢是一致的，說明PPO是以卷曲和螺旋結(jié)構(gòu)為主的一種蛋白質(zhì)。預(yù)測的PPO二級結(jié)構(gòu)種類和含量與凡納濱對蝦多酚氧化酶酶原的一致，這也說明了凡納濱對蝦proPPO與PPO在二級結(jié)構(gòu)上是相似的。

2.6 PPO三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

將PPO序列在predictprotein結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件進(jìn)行相似性搜索，蛋白序列數(shù)為93，與PDB中結(jié)構(gòu)的匹配數(shù)為31。蛋白同源性分析得到PPO假定保守域，含功能結(jié)構(gòu)域血藍(lán)蛋白-N、血藍(lán)蛋白-M和血藍(lán)蛋白-C，其中以血藍(lán)蛋白-N和血藍(lán)蛋白-C為主，同源性蛋白信息見表3，其中煙草天蛾酚氧化酶原晶體結(jié)構(gòu)與PPO的同源性最高，達(dá)40%，蛋白編號為3HHS_B。

利用SWISS-MODEL工作站，以SMTL ID為3HHS.1的B鏈為模板進(jìn)行建模，3HHS.1 B鏈與實(shí)驗(yàn)中凡納濱對蝦PPO序列具有40.36 %的一致性，氨基酸序列號覆蓋范圍為3 ~ 689，覆蓋率為99%，滿足同源建模同源性要求25% ~ 30%的標(biāo)準(zhǔn)。對PPO進(jìn)行同源建模，其三維模型見圖7。PPO三維結(jié)構(gòu)中含4個(gè)配體，2個(gè)Cu2+單體（也為保守結(jié)合位點(diǎn)），配體3與鏈B H369、H373、F405、H409相連，配體4與鏈B H209、H213、H235相連，配體3和4無保守結(jié)合位點(diǎn)。

表3 多酚氧化酶PPO同源性蛋白分析結(jié)果

圖7 SWISS-MODEL建模的PPO三維結(jié)構(gòu)

對PPO的三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行評估，包括整體模型質(zhì)量評估（Global Model Quality Estimation，GMQE）、復(fù)合評分函數(shù)值（Qualitative Model Energy Analysis，QMEAN）、整體質(zhì)量（Global Quality）、局部質(zhì)量評估（Local Quality）和結(jié)構(gòu)對比（Comparison）等，結(jié)果見圖8。

A，局部質(zhì)量評估；B，與PDB中非重復(fù)部分的對比

PPO三維結(jié)構(gòu)模型的GMQE值為0.73，表明模型精度較高。PPO三維結(jié)構(gòu)模型的QMEAN值為-3.17，且有“大拇指向上”標(biāo)志，表明模型結(jié)構(gòu)與類似結(jié)構(gòu)之間有較好的一致性。數(shù)值為-4.0或以下表明模型質(zhì)量非常低，分?jǐn)?shù)旁邊的“大拇指向上”符號會變?yōu)椤跋蛳隆币詮?qiáng)調(diào)。Local Quality表示模型的蛋白質(zhì)長度（軸，以氨基酸計(jì)）與結(jié)構(gòu)相似性（軸）之間的關(guān)系。通常顯示分?jǐn)?shù)低于0.6的殘差預(yù)期質(zhì)量很低，圖8-A可以看出PPO三維結(jié)構(gòu)模型殘差質(zhì)量較好。Comparison表示與高分辨率晶體結(jié)構(gòu)得到的分?jǐn)?shù)相比，軸為蛋白質(zhì)長度（以氨基酸計(jì)），軸為歸一化的QMEAN得分，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。最黑的點(diǎn)表示QMEAN得分為-1和1之間的結(jié)構(gòu)，|-Score | 1到2之間是灰色的，|-Score | 超過2為淺灰色，紅星代表本模型。由圖8-B得本模型的|-Score | 超過2。綜合評估PPO三維結(jié)構(gòu)模型具有較高可靠性。

3 結(jié)論

采用硫酸銨沉淀結(jié)合柱層析從凡納濱對蝦中提取并純化到高純度、高比活力PPO，得率為29.5%。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，純化PPO的分子質(zhì)量為72 ku左右，LC-MS/MS進(jìn)行鑒定，所得結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比較發(fā)現(xiàn)，與凡納濱對蝦的酚氧化酶原序列相似性為65%，匹配度分值為11 321。進(jìn)一步對PPO進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其為兩性蛋白，親水性大于疏水性。PPO的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，在SWISS-MODEL工作站中建立了PPO三維結(jié)構(gòu)模型，并對模型進(jìn)行分析，確認(rèn)建模結(jié)構(gòu)可靠性較高。研究結(jié)果為對蝦采取合理高效措施以防止和控制黑變提供了理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

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Purification and Identification of PPO fromand Its Bioinformatics Analysis

WEI Shuai, LIU Yuan, LIU Meng-na, SUN Qin-xiu, LIU Shu-cheng, JI Hong-wu, HAO Ji-ming, DENG Chu-jin, MAO Wei-jie

（1.,,,,,,524088,; 2.,116034,; 3.(Zhanjiang),524088,）

【Objective】To isolate and purify the PPO from, the biological information was identified and analyzed by using mass spectrometry.【Methods】PPO was isolated and purified from the shrimp cephalothorax by using ammonium sulfate precipitation and column chromatography. The molecular weight was determined by electrophoresis, and the amino acid sequence was determined by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI- MS/MS). Based on these results, homology modeling was constructed and the evaluations were performed.【Results and Conclusion】Purified PPO was obtained with a purification of 65.7 folds, the specific activity of PPO was 650.1 U/mg protein and with a yield of 29.5%. The molecular weight of PPO was about 72 ku. The similarity of amino acid sequence between the purified protein and Propolyphenoloxidase ofwas 65% with a matching score of 11 321 points by identification and analysis of mass spectrometry and basic local alignment search tool (blast) sequence comparison. The results have confirmed that the purified protein was PPO. PPO is an amphoteric protein and it has a higher hydrophilicity than hydrophobicity. The secondary structure of PPO mainly consists of α-helix and random coil. In conclusion, the predicted three-dimensional structure of PPO had a high reliability.

; PPO; mass spectrometry; identification; bioinformatics

Q78；Q959.223+.63

A

1673-9159（2020）04-0100-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.014

2020-05-17

廣東省區(qū)域聯(lián)合基金-青年基金項(xiàng)目（2019A1515110419)；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助（2019YFD0902003）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31771997）；南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（湛江）資助（ZJW-2019-06）；廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強(qiáng)校重大培育項(xiàng)目（GDOU2017052603）；國家蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（G-48）；廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2019KQNCX040）；廣東普通高等學(xué)校海洋食品綠色加工技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)（2019KCXTD 011）

魏帥（1986—），男，博士，講師，研究方向?yàn)楹Ｑ笫称芳庸ば录夹g(shù)。E-mail：weishuaiws@126.com

孫欽秀（1986—），女，博士，講師，研究方向?yàn)楹Ｑ笫称芳庸ば录夹g(shù)。E-mail：sunqinxiugo@163.com；

劉書成（1977—），男，教授，研究方向?yàn)楹Ｑ笫称芳庸ば录夹g(shù)。E-mail：Lsc771017@163.com

魏帥，劉媛，劉蒙娜，等. 凡納濱對蝦多酚氧化酶的純化鑒定與生物信息學(xué)分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（4）：100-108.

（責(zé)任編輯：劉朏）