趙靜，劉億鑫，邵征，張新，丁倩，劉薇

大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院，工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點實驗室，大連 116024

城鎮(zhèn)污水回用于城市雜用水、景觀用水、河海補給和農(nóng)業(yè)灌溉等，可有效緩解水資源供需矛盾。城鎮(zhèn)污水廠多采用二級處理工藝，經(jīng)消毒后回用，常用消毒工藝為紫外線消毒、氯化消毒和臭氧氧化工藝。目前，我國已開始興建再生水廠，采用化學(xué)沉淀法、高級氧化法及膜濾法等深度處理工藝后回用。再生水中殘留有毒化學(xué)物質(zhì)具有生物累積特性，長期暴露其中對野生動物和人體健康造成潛在威脅[1-2]。城鎮(zhèn)污水中普遍含有環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptors, EEDs)，是造成天然水體乃至飲用水EEDs污染的重要途徑。雌激素物質(zhì)和類雌激素物質(zhì)均具有雌激素活性，類雌激素物質(zhì)與雌激素物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，可與雌激素受體結(jié)合，干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)。已在再生水中檢測到多種環(huán)境雌激素，例如類固醇激素、多氯聯(lián)苯和酚類等天然和人工化學(xué)品，且多種弱雌激素活性物質(zhì)還可產(chǎn)生協(xié)同作用[3]。雌激素活性與生態(tài)環(huán)境和人類的健康密切相關(guān)，某些雌激素如17α-乙炔雌二醇和17β-雌二醇在ng·L-1水平即能引起內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，導(dǎo)致生殖力降低、性別比例變化、胚胎發(fā)育異常以及乳腺癌和睪丸癌發(fā)生率增高[4-6]。針對雌激素的生態(tài)風(fēng)險評價結(jié)果表明，全球多個國家尤其是中國、日本、美國、英國和意大利天然水體中雌激素污染均有較高風(fēng)險[7]。

精密化學(xué)儀器如氣相色譜-質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-核磁共振等可檢測水中痕量污染物，但儀器分析存在價格昂貴、操作復(fù)雜和受制于標(biāo)準(zhǔn)品和分析方法等局限性。目前，國內(nèi)外已開發(fā)多種用于測量化學(xué)品和環(huán)境樣品的雌激素活性體外和體內(nèi)測試方法[8]，其中，重組酵母菌測試作為一種靈敏、簡便和經(jīng)濟的方法在實驗室和現(xiàn)場實驗中廣泛應(yīng)用，可快速測定混合物中通過相同作用模式起作用的所有化合物的總雌激素活性。本研究選擇中國北方城市4個采用活性污泥法二級工藝和紫外消毒的城鎮(zhèn)污水處理廠及1個采用多級三級處理工藝的再生水廠，采集進水、各主要工藝出水和最終出水，用重組酵母菌測試方法檢測經(jīng)固相萃取后水樣總提取物及分級組分的雌激素活性，并比較不同處理工藝對環(huán)境雌激素的削減效率。旨在為優(yōu)化城鎮(zhèn)污水處理廠組合工藝設(shè)計、促進環(huán)境雌激素污染控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集與前處理

采集中國北方城市大連、沈陽和哈爾濱的4個城鎮(zhèn)污水處理廠(A、B、C和D)和天津某再生水廠(E)進水、主要工藝出水和最終出水(圖1)，各廠同時使用超純水作為流程空白，共采集23個水樣各4 L。A～D廠采用活性污泥法二級處理和紫外消毒工藝，進水均以生活污水為主，混有少量工業(yè)廢水，出水均達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》一級A標(biāo)準(zhǔn)，排水用于城市雜用水、景觀用水和河道補給。E廠進水為多個城鎮(zhèn)污水處理廠二級處理出水，采用混凝、微濾、反滲透和臭氧氧化三級處理工藝，最終出水回用于農(nóng)業(yè)灌溉、景觀用水和城市雜用水。

采集水樣放至棕色玻璃瓶中，置于冰上運回實驗室，用0.7 μm(Waters, GF/B, 47 mm)玻璃纖維濾膜過濾，經(jīng)HLB固相萃取柱(6 mL，500 mg，OASIS，Waters，美國)進行富集，按照極性分別收集總組分和分級組分。依次用不同溶劑洗脫，用10 mL二氯甲烷洗脫的為弱極性組分，10 mL二氯甲烷/甲醇(體積比為1∶1)洗脫的為中極性組分，10 mL甲醇洗脫的為強極性組分，將洗脫液經(jīng)氮吹后用200 μL二甲基亞砜(DMSO)定容。從弱極性組分、中極性組分和強極性組分等量各取一份均混為總提取物，萃取物存于-20 ℃，直至完成生物毒性測試。

圖1 城市污水處理廠(A、B、C和D)和再生水廠(E)工藝流程和采樣點注：SBR表示序批式活性污泥法，A2O表示厭氧-缺氧-好氧法。Fig. 1 Main flow chart of municipal wastewater treatment plants (A, B, C, D) and reclaimed water plant (E) and samplingNote: SBR stands for sequencing batch reactor activated sludge process; A2O stands for anaerobic-anoxic-oxic process.

1.2 重組酵母菌雌激素活性檢測方法

重組酵母菌購自無錫中科水質(zhì)環(huán)境技術(shù)有限公司。該菌株將人類雌激素受體基因(HER)、雌激素應(yīng)答表達(dá)子(ERE)質(zhì)粒和編碼β-半乳糖苷酶的Lac.Z基因轉(zhuǎn)染入酵母中。當(dāng)雌激素和雌激素活性物質(zhì)與雌激素受體結(jié)合，可激活轉(zhuǎn)錄因子，使Lac.Z基因表達(dá)，生成β-半乳糖苷酶，即可間接定量檢測化學(xué)物和環(huán)境樣品的雌激素活性[9]。將酵母干粉和培養(yǎng)基加入無菌錐形瓶中，置于轉(zhuǎn)速200 r·min-1、30 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。10倍稀釋下，使600 nm的光密度(OD600，以超純水為空白)讀數(shù)為0.7～0.9。將5 μL樣品與995 μL菌液混合，取200 μL置于96孔板中，設(shè)3個平行孔。于800 r·min-1、30 ℃振蕩暴露培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀(Tecan infinite 200, Switzerland)測定OD600，隨后棄去150 μL混合菌液，加入120 μL緩沖溶液及20 μL氯仿，放置于平板搖床中1 350 r·min-1、30 ℃破碎細(xì)胞10 min。加入40 μL反應(yīng)底物，800 r·min-1、30 ℃震蕩培養(yǎng)60 min，加入100 μL碳酸鈉終止反應(yīng)，吸取200 μL上清液，測定OD420。雌激素效應(yīng)均在無細(xì)胞毒性濃度下測定，以0.5% DMSO作為溶劑對照，以雌二醇(E2)為陽性對照將樣品中雌激素活性物質(zhì)濃度換算成雌激素當(dāng)量(estradiol equivalent, EEQ)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用以下公式計算半乳糖苷酶活性(U)：

U=(OD420T-OD420C)/t·V·D·OD600

式中：t為酶反應(yīng)時間，即60 min；V為測定時溶液體積，即0.2 mL；OD420T和OD420C分別為樣品和溶劑對照在420 nm的吸光值；D為反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)，即6.6。

用以下公式計算樣品半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)以及EEQ：

Y=(A-B)/(1+(C/X)K)+B

EEQ=EC50E2/EC50T

式中：Y代表β-半乳糖苷酶活性，X代表樣品濃度，A代表最大β-半乳糖苷酶活性，B代表本底β-半乳糖苷酶活性，C代表半數(shù)最大β-半乳糖苷酶活性時樣品濃度，K代表濃度-效應(yīng)回歸曲線的斜率，EC50E2和EC50T分別為E2和樣品的EC50。

2 結(jié)果(Results)

2.1 城鎮(zhèn)污水處理廠紫外消毒工藝和再生水廠深度處理工藝最終出水的雌激素誘導(dǎo)活性

E2雌激素活性EC50為0.155 nmol·L-1(圖2)，與文獻(xiàn)報道結(jié)果相當(dāng)[10-11]。4個城鎮(zhèn)污水處理廠最終出水的雌激素誘導(dǎo)活性均呈明顯的劑量依賴性，尤其是A廠和D廠出水呈現(xiàn)典型的S型濃度-效應(yīng)關(guān)系，說明排水中仍存在一定程度的環(huán)境雌激素污染，最終出水EEQ分別為1.47、1.14、0.74和0.53 ng·L-1。再生水廠最終出水的雌激素誘導(dǎo)活性低于檢測限(0.02 ng·L-1)。歐盟委員會環(huán)境總署(European Environment Agency)建議水環(huán)境中E2含量<0.45 ng·L-1[12]，Young等[12]選擇E2最靈敏的毒性終點生殖效應(yīng)，基于31個物種的生殖毒性無觀察效應(yīng)濃度(NOECs)，通過物種敏感度分布(SSD)方法，計算得到E2的預(yù)測無效應(yīng)濃度(PNEC)為0.73 ng·L-1，該安全限值可保護水生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性。Jaro?ová等[13]根據(jù)類固醇雌激素活性的體外測試結(jié)果、體內(nèi)PNEC以及其對城鎮(zhèn)污水處理廠出水總雌激素活性的貢獻(xiàn)，計算得到包括酵母測試在內(nèi)的15種體外測試方法中的安全濃度，為0.1～0.4 ng·L-1。因此，城鎮(zhèn)污水處理廠采用活性污泥法二級處理和紫外線消毒工藝，排水中環(huán)境雌激素濃度高于或與其安全濃度相當(dāng)，仍可對水生態(tài)環(huán)境造成一定程度的環(huán)境雌激素污染。

圖2 4個城鎮(zhèn)污水處理廠出水雌激素活性的濃度-效應(yīng)關(guān)系Fig. 2 The dose-response curve for estrogenic activities of effluents in 4 municipal wastewater treatment plants

2.2 4個城市污水處理廠二級處理對環(huán)境雌激素的削減

4個城市污水處理廠二級工藝主要利用活性污泥法，A～D廠一級和二級處理工藝對雌激素活性物質(zhì)去除效率分別為81%、50%、46%和50%(圖3)。D廠活性污泥法后混凝工藝對環(huán)境雌激素的去除率為37%。其后4個污水處理廠紫外線消毒工藝對雌激素活性物質(zhì)去除效率為5.2%～22%，但是除A廠外，B、C和D廠紫外消毒工藝處理前后雌激素活性的差異均不顯著，表明紫外線消毒工藝主要起到消毒殺菌的作用，去除雌激素活性物質(zhì)的效率較低。因此，經(jīng)二級活性污泥處理工藝和紫外線消毒，出水中仍有大量難降解環(huán)境雌激素，其殘留率為19%～54%。城鎮(zhèn)污水處理廠中，活性污泥法對雌激素物質(zhì)起主要的去除作用，大部分情況下對于雌激素物質(zhì)的去除率可高于90%，但基于化學(xué)方法分析污水中多種痕量雌激素污染物，仍存在不確定性[14]。紫外線消毒工藝和高級氧化工藝協(xié)同作用可提高雌激素污染物的去除效率，Rott等[15]發(fā)現(xiàn)游離有效氯濃度≥5 mg·L-1時，紫外/氯化耦合工藝對于雌激素活性的削減率可≥97%。

A～C廠最終出水中分級組分的雌激素活性強度規(guī)律一致，即強極性組分>弱極性組分>中極性組分，D廠出水弱極性組分活性最強。經(jīng)一級和二級工藝處理后，各分級組分的雌激素活性均顯著下降，與總萃取物結(jié)果一致。紫外消毒工藝對雌激素活性削減率較低的主要原因是對弱極性組分雌激素活性去除率較低，且經(jīng)處理后強極性組分的雌激素活性甚至升高。除D廠外，A、B和C廠經(jīng)紫外線消毒處理后，強極性組分EEQ升高39%、8.4%和22%，可能在處理過程中，弱極性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為極性物質(zhì)，或者形成了雌激素活性更強的產(chǎn)物。

2.3 某再生水廠三級處理對環(huán)境雌激素的削減

再生水廠E混凝工藝對污水總萃取物雌激素活性的去除效率為63%(圖4)。微濾工藝處理前后污水的雌激素活性平均值降低了16%，但無顯著性差異(P>0.05)。反滲透工藝對雌激素活性削減率為98%。反滲透工藝后和臭氧氧化工藝后雌激素活性均低于方法檢測限(0.02 ng·L-1)。E廠進水中雌激素活性順序為強極性組分>弱極性組分>中極性組分。混凝工藝對總提取物和3個分級組分的雌激素活性均具有顯著的去除效果，經(jīng)混凝工藝后，強極性組分、中極性組分和弱極性組分的雌激素活性分別下降了81%、95%和43%，中極性組分的雌激素活性低于檢測限。微濾工藝對于強極性組分和弱極性組分的雌激素活性削減率分別為33%和55%，但強極性組分在微濾工藝處理前后雌激素活性沒有顯著變化。

多數(shù)體內(nèi)測試和體外測試結(jié)果表明，城鎮(zhèn)污水處理廠及其受納水體中造成雌激素活性的化學(xué)物主要為類固醇雌激素，包括17β-雌二醇(E2)、雌酮(E1)、雌三醇(E3)及17α-乙炔雌二醇(EE2)，其作用占總雌激素活性的90%以上，此外城鎮(zhèn)污水中也檢測到乙氧基化壬基酚、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯和鄰苯二甲酸酯等具有雌激素活性的污染物[13]。三級處理工藝如砂濾、膜濾、活性炭吸附、混凝和臭氧氧化等可不同程度提高雌激素污染物的削減率。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，絮凝和砂濾工藝對二級處理出水的雌激素活性削減率較低，分別為3%和25%，臭氧氧化具有較高的雌激素活性削減率，其出水雌激素活性接近檢測限。

綜上，僅采用活性污泥法二級工藝和紫外線消毒工藝對環(huán)境雌激素污染物去除率較低，紫外消毒處理后強極性組分的雌激素活性反而升高。采用混凝、反滲透等三級工藝進行深度處理，可有效提高雌激素削減率。污水處理廠工藝設(shè)計和改造過程中，采用重組酵母菌測試方法可簡便、快速評價雌激素削減率，以有效控制排水對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成的危害。

圖3 4個城市污水處理廠進水和各工藝出水總萃取物和分級組分的雌激素活性注：ND表示未檢測到，即低于檢測限；*(P<0.05)和**(P<0.01)表示與上一級工藝出水差異顯著；A1、A2和A3為A廠進水、二沉池出水和紫外線消毒出水；B1、B2和B3為B廠進水、SBR出水和紫外線消毒出水；C1、C2和C3為C廠進水、二沉池出水和紫外線消毒出水；D1、D2、D3和D4為D廠進水、二沉池出水、混凝出水和紫外線消毒出水。Fig. 3 Estrogenic activities of total extracts and fractional components in the influents and processing effluents of 4 municipal wastewater treatment plantsNote: ND stands for not detectable, below limit of detection * (P<0.05) and ** (P<0.01) represent significant difference with effluent from prior treatment process; A1, A2 and A3 indicated raw influent, secondary sedimentation tank effluent and UV disinfection effluent in plant A; B1, B2 and B3 indicated raw influent, SBR effluent and UV disinfection effluent in plant B; C1, C2 and C3 indicated raw influent, secondary sedimentation tank effluent and UV disinfection effluent in plant C; D1, D2, D3 and D4 indicated raw influent, secondary sedimentation tank effluent, coagulation effluent and UV disinfection effluent in plant D.

圖4 天津市某再生水廠進水和各工藝出水總萃取物和分級組分的雌激素活性注：ND表示未檢測到即低于檢測限；*(P<0.05)和**(P<0.01)表示與上一級工藝出水差異顯著；反滲透和臭氧氧化工藝后均未檢測到雌激素活性。Fig. 4 Estrogenic activities of total extracts and fractionated components in the influent and all process effluent of reclaimed water plant in TianjinNote: ND stands for not detectable, below limit of detection; * P-value<0.05, ** P-value <0.01, represent significant difference with effluent from prior treatment process; estrogenic activities of effluents from reverse osmosis and ozone oxidation were not detectable.