陳翠翠，賴宏銳，梁煥坤，鐘樹海，黎杰星，李來慶

（廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510663）

犬瘟熱（Canine distemper，CD）是肉食動物的一種急性、高度接觸性、熱性傳染病[1]，由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）感染引起，其死亡率可高達(dá)90%[2]，雪貂高達(dá)100%[3]，在家養(yǎng)犬CDV 病死率約為50%。CDV 自然感染宿主除食肉目8 個科外， 還擴(kuò)展到豬、靈長目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動物，其危害性也越來越大[4-5]。因此早期、快速、準(zhǔn)確的診斷犬瘟熱病，對養(yǎng)犬業(yè)和野生動物保護(hù)業(yè)具有重要意義。目前，檢測CDV 的方法常見有病毒分離、免疫熒光抗體技術(shù)、免疫組化、RT-PCR 方法等，但均存在繁瑣、重復(fù)性差等不足，而且在基層難以推廣應(yīng)用。

時間分辨免疫熒光分析法（Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是一種超微量免疫分析定量檢測技術(shù)，具有靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便等特點(diǎn)[6]。該方法用具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物為示蹤物[7-9]，標(biāo)記蛋白質(zhì)、抗體、核酸探針等，利用TRFIA 檢測儀測定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度，可以快速、精準(zhǔn)的定量檢測病原感染情況。目前，尚未有CDV TRFIA 的報道。本研究使用一株抗CDV 的單克隆抗體（MAb）作為包被抗體，Eu3+標(biāo)記的另一株MAb 作為檢測抗體，建立了CDV 的雙抗體夾心TRFIA，為檢測CDV 提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 抗CDV單克隆抗體（MAb）3H7（包被抗體，效價1∶160 000）、2G4（檢測抗體，效價1∶320 000）和CDV 標(biāo)準(zhǔn)抗原（由犬瘟熱病毒的H 蛋白和F 蛋白列通過一段柔性連接肽（GGGGS）n 連接并進(jìn)行真核表達(dá)的重組蛋白，G 表示為甘氨酸，S 表示為，絲氨酸，n≥1。經(jīng)Meridian Life Science 公司，#2A02219 CDV 病毒標(biāo)定，相當(dāng)于1.46×103TCID50/mL）均由廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司制備；銪（Eu3+）標(biāo)記試劑盒購自PerkinElmer 公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Fitzgerald 公司；Sephades-G50 填料購自GE 公司；96 孔板購自Costar 公司；包被緩沖液、洗滌液、封閉液、增強(qiáng)液均為自制。Victor 1420 全自動時間分辨熒光免疫分析檢測儀購自PerkinElmer 公司。65 份疑似CDV 患病犬的眼鼻分泌物，15 份CDV 陰性樣品均由廣州富懋動物醫(yī)院提供。

CDV、犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus virus，CPV）、犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus, CPIV）、犬腺病毒1 型（Canine adenovirus type 1，CAV-1）、犬冠狀病毒（Canine coronavirus，CCV）均購由廣州優(yōu)迪生物科技股份有限公司制備保存。

1.2 固相包被抗體的制備 將包被抗體3H7 采用50 mmol/L、pH9.6 的碳酸鹽緩沖液稀釋為5 μg/mL，10 μg/mL 和15 μg/mL，利用方陣法進(jìn)行包被濃度的優(yōu)化。包被抗體加入96 孔微孔板中包被，4 ℃過夜，棄包被液，加入封閉液（5% BSA 的PBS 溶液，pH 7.4），每孔250 μL，37 ℃封閉2 h，棄掉封閉液，洗滌液（0.5%Tween-20 的PBS 溶液，pH 7.4）洗滌2 次，真空冷凍抽干，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Eu3+標(biāo)記檢測抗體及其純化 將0.5 mg 檢測抗體2G4 加入到帶有濾膜的離心管中，以8 000 r/min離心8 min。設(shè)置Eu3+標(biāo)記試劑：標(biāo)記抗體比例分別 為70 μL∶30 μL，60 μL∶40 μL，50 μL∶50 μL，40 μL∶60 μL 和30 μL∶70 μL，利用銪（Eu3+）標(biāo)記試劑盒采用方陣法進(jìn)行優(yōu)化標(biāo)記比例，并根據(jù)Eu3+標(biāo)記試劑盒說明書所提供的公式計算標(biāo)記率。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用含0.2% BSA、0.1% NaN3、50 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液（pH 7.8），將CDV 抗原配制成濃度為0、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL、640 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每瓶1 mL 分裝凍干，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用時分別加入1 mL分析緩沖液（8 mmol/L NaCl，0.1%明 膠，0.1% NaN3，0.1 mL/L Tween-80 的Tris-HCl 溶液，pH 7.8）溶解使用。

1.5 TRFIA 方法檢測性能評估

1.5.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 使用CDV系列標(biāo)準(zhǔn)品（0、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL、640 ng/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個濃度測定3 個復(fù)孔，共測定3 次，用雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型（Log-Logit）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。以無CDV 標(biāo)準(zhǔn)品為樣本，將其測定的20 次熒光值均值加上2 倍的標(biāo)準(zhǔn)差（mean+2SD）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算TRFIA 方法的靈敏度。

1.5.2 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 對濃度已知的3 個CDV 標(biāo)準(zhǔn)品（17.6 ng/mL、21.0 ng/mL 和34.8 ng/mL）分別按1∶2、1∶4、1∶8 倍比稀釋，每個樣本重復(fù)檢測3 次，比較樣本的測定值、真值并計算其稀釋回收率（測定值/真值×100），用稀釋回收率分析該檢測方法的準(zhǔn)確度。

1.5.3 特異性實(shí)驗(yàn) 利用本研究建立的TRFIA 方法同 時 檢 測CDV 標(biāo) 準(zhǔn) 品、 CPV、 CPIV、 CAV-1、CCV，進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。

1.5.4 精密度實(shí)驗(yàn) 將CDV 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至高（500 ng/mL）、中（100 ng/mL）、低（10 ng/mL）3 個濃度，各設(shè)3 個復(fù)孔重復(fù)檢測10 次，計算高、中、低3 個濃度標(biāo)準(zhǔn)品測定的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)（CV），評價該試劑盒精密度。

1.5.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 用本研究制備的TRFIA 試劑盒置于4 ℃6 個月和37 ℃7 d，對試劑盒的物理外觀，劑量-反應(yīng)曲線的線性、靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性等指標(biāo)進(jìn)行測定，具體檢測方法同上。

1.6 臨床樣本的檢測 采用本研究建立的TRFIA 方法與RT-PCR[10]同時檢測65 只具CD 臨床癥狀并經(jīng)CDV 膠體金試紙條診斷為陽性的疑似感染犬和15 只健康犬的眼鼻分泌物，對檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析，以評估本TRFIA 法的臨床檢測效果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。結(jié)果以mean±SD 表示，GraphPad Prism 5 軟件計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程， Origin8 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 TRFIA 最佳反應(yīng)條件的確定 本研究建立的雙抗體夾心TRFIA 分析法，經(jīng)過對包被濃度、Eu3+標(biāo)記試劑：標(biāo)記抗體比例、反應(yīng)體系的體積、增強(qiáng)液配方等條件的優(yōu)化，最終確定了最佳的TRFIA 反應(yīng)條件如下：包被抗體的濃度為10 μg/mL，100 μL/孔；Eu3+標(biāo)記試劑：標(biāo)記抗體最佳比例70 μL∶30 μL（標(biāo)記物的標(biāo)記率為每個檢測抗體上平均標(biāo)記9.41 個Eu3+）；反應(yīng)體系為25 μL 標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品+200 μL分 析緩沖液+200 μL/孔Eu3+-檢測抗體+200 μL/孔增 強(qiáng) 液；增 強(qiáng) 液 配 方：20 μmol β-NTA，50 μmol TOPO，0.1% Triton X-100，0.1 mol/L 鄰苯二甲酸氫鉀，0.5% 冰醋酸，pH 3.2。具體檢測步驟參照文獻(xiàn)進(jìn)行[11]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及其靈敏度結(jié)果 以CDV 標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的熒光值為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示，方程為：y=2.36+1.025x，線性范圍為2.5 ng/mL～640 ng/mL，R2=0.9998，表明本檢測方法具有良好的劑量-反應(yīng)效應(yīng)。平行測定10 次無CDV 參考標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值，并計算其均值（Mean）及標(biāo)準(zhǔn)差（SD），用mean+2SD 代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算得出TRFIA 法的檢測下限為0.58 ng/mL。

圖1 CDV TRFIA 試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及變異系數(shù)Fig.1 Standard curve and coefficient of variation of CDV TRFIA Kit

2.3 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，3 個樣品3 個水平稀釋度的稀釋回收率在98.98%～105.91%，稀釋倍數(shù)與濃度呈線性關(guān)系，表明本研究建立的TRFIA 法準(zhǔn)確度較高。

表1 CDV TRFIA 試劑盒的稀釋回收率測定(%)Table 1 Determination of dilution recoveries of CDV TRFIA Kit

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 利用本研究建立的TRFIA 法檢測寵物臨床常見病毒，結(jié)果顯示，除CDV 為陽性外， CPV、CPIV、CAV-1、CCV 均為陰性，無明顯交叉反應(yīng)（表2）。表明該試劑盒特異性良好。

表2 CDV TRFIA 試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Determination results of the specificity of CDV TRFIA Kitt

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用本研究制備的TRFIA 試劑盒進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：批內(nèi)CV 值5.60%～7.58%，批間CV 值5.67%～7.64%，批內(nèi)批間CV 值均小于10%（表3），符合臨床檢測試劑盒要求。表明該TRFIA 方法制備的試劑盒精密度較高。

表3 CDV TRFIA 試劑盒的精密度測定結(jié)果Table 3 Determination results of the CV of CDV TRFIA Kit

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對本研究制備的TRFIA 試劑盒穩(wěn)定性測試結(jié)果顯示，參考標(biāo)準(zhǔn)品的各點(diǎn)熒光值并未隨著條件的改變而發(fā)生明顯變化，試劑盒檢測性能無明顯改變，符合試劑盒穩(wěn)定性要求。試劑盒置于4 ℃能穩(wěn)定保存6 個月以上，37 ℃熱破壞性試驗(yàn)?zāi)芊€(wěn)定保存7 d 以上。表明該TRFIA 方法制備的試劑盒穩(wěn)定性好。

2.7 臨床樣本的檢測結(jié)果 利用本研究建立的CDV TRFIA 檢測試劑盒與RT-PCR 法同時檢測臨床眼鼻分泌物樣品，結(jié)果顯示，疑似樣本63 份陽性，2 份陰性；15 只健康犬均為陰性， 兩種檢測方法的符合率為100%。表明本研究建立的CDV TRFIA 方法可快速、準(zhǔn)確、定量檢測CDV 臨床樣本。

3 討 論

犬瘟熱是由CDV 引起的一種具有高度傳染性和致命的全身性疾病，不僅感染犬和其它食肉動物，也在一些非食肉動物發(fā)現(xiàn)[12-13]。近幾年，寵物犬業(yè)發(fā)展迅速，CDV 危害嚴(yán)重，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，CDV 快速檢測技術(shù)在該病綜合防治中至關(guān)重要。

目前，檢測CDV 的方法較多。病原學(xué)方法主要是實(shí)驗(yàn)室對病毒的分離、培養(yǎng)及其鑒定，所需時間長，特異性差。近年來隨著科研用儀器設(shè)備的不斷更新，PCR 和核酸雜交大大提高了CDV 檢測的準(zhǔn)確性和特異性，縮短了檢測時間，但其需要專業(yè)的儀器和人員，限制了其廣泛應(yīng)用[14]。在此背景下，膠體金檢測試紙因其方便、快捷和成本低廉的優(yōu)勢，在CDV 初級篩查（定性分析）中得到廣泛應(yīng)用[15]。但是對于CDV 的定量分析，目前尚缺乏簡便快捷的檢測方法。TRFIA 法可實(shí)現(xiàn)完全定量分析，具有敏感性強(qiáng)、特異性好、便捷等優(yōu)勢，成為目前最有發(fā)展?jié)摿Φ臋z測方法。

本研究所研制的試劑盒測定結(jié)果顯示，試劑盒的靈敏度達(dá)到0.58 ng/mL，檢測樣本濃度在2.5 ng/mL～640 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好，檢測范圍寬，實(shí)現(xiàn)了CDV 定量分析，優(yōu)于病原學(xué)和膠體金法僅定性分析的局限性[14-15]。本試劑盒研制參照人體臨床檢測試劑研制的相關(guān)要求（必須設(shè)置高中低3 個濃度），并從臨床樣本實(shí)際情況考慮（犬感染瘟熱病毒輕重程度不一，造成血液中病毒含量有高有低），設(shè)置了高中低3 個濃度，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，其批內(nèi)與批間的CV 小于10%，達(dá)到臨床測試要求（批內(nèi)CV＜10%，批間CV＜15%）；此外，臨床樣本對比試驗(yàn)表明，本TRFIA法與傳統(tǒng)的PCR法相比，檢測結(jié)果的符合率達(dá)到了100%，操作簡單快捷，可以替代PCR 法用于CDV 的快速定量分析[6,16]。

綜合比較CDV 的病原學(xué)分析、膠體金法和PCR法檢測的優(yōu)缺點(diǎn)，本研究研制的TRFIA 法能快速、定量、準(zhǔn)確診斷CDV 感染，具有強(qiáng)特異、高敏感、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量臨床樣品檢測，具有極大的應(yīng)用前景。