龔詩立，楊翠翠，胡朝英，王明洋，張?zhí)m

1.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義市 563000；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部，北京市100053

缺血性腦卒中是指由于腦的供血動脈(頸動脈和椎動脈)狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱，可導(dǎo)致突發(fā)的單側(cè)肢體麻木、力弱、眩暈等。靜脈溶栓療法是目前唯一臨床證實(shí)有效的治療方法，但該方法具有時間窗局限性，且存在引起嚴(yán)重腦出血的風(fēng)險。缺血后的炎癥反應(yīng)加快缺血性損傷的形成，并影響神經(jīng)元死亡和神經(jīng)組織再生。神經(jīng)炎癥的特征是小膠質(zhì)細(xì)胞激活和促炎細(xì)胞因子增加。針對炎癥反應(yīng)的干預(yù)被認(rèn)為是缺血性腦卒中的有效治療手段。

小膠質(zhì)細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的一種，約占成年腦細(xì)胞的5%～10%，是大腦中最大的免疫細(xì)胞群[1]。在外來微生物刺激或缺血缺氧后，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后表現(xiàn)為經(jīng)典的M1表型。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞不僅可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，而且具有抗原加工和呈遞的作用，也是細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)的促進(jìn)劑[2-4]。除了經(jīng)典的促炎M1 表型，小膠質(zhì)細(xì)胞亦可以呈現(xiàn)抗炎的M2 表型，該表型同時還具有促血管生成和免疫抑制、誘導(dǎo)效應(yīng)T 細(xì)胞失效和細(xì)胞毒性等諸多生理效應(yīng)。與M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞相反，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)抑炎癥因子[5-6]。

痘苗病毒致炎兔皮提取物(analgecine,AGC)是從牛痘病毒致炎的日本大耳白兔的兔皮組織中提取的一種生物活性制劑，含有多種多肽、氨基酸、核苷酸等物質(zhì)[7]；臨床用于頸肩腕綜合征的治療、腰痛患者疼痛等癥狀的緩解以及癥狀性神經(jīng)痛[8-10]。前期研究結(jié)果顯示，在大鼠中腦動脈栓塞模型中，靜脈給予AGC后，可以抑制炎癥因子的分泌，顯著縮小梗死面積，減輕腦水腫系數(shù)，提高大鼠行為學(xué)評分。但其作用機(jī)制不明確。本研究觀察AGC 調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化，從而抑制炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清：GIBCO公司。青鏈霉素混合液：THERMO FISHER 公司。連二亞硫酸鈉(Na2S2O2)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)：SIGMA 公 司。CD16+CD32抗 體、CD206抗體：ABCAM 公司。4%細(xì)胞固定液、PBS：HYCLONE 公司。PBST：自制。Alexa Fluor 488 山羊抗大鼠IgG (H+L)、Alexa Fluor 594 山羊抗兔IgG (H+L)：INVITROGEN 公司。山羊血清、含DAPI的封片劑：北京中杉金橋公司。干擾素-γ(interferon,IFN-γ)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α ELISA 試劑盒：R&D systems。IL-4：PEPROTECH 公司。FITC CD16/32 抗體、PE CD206抗體：BIOLEGEND 公司。流式管：CORNING公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

BV2 細(xì)胞于10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液配制的DMEM-HIGH Glucose 培養(yǎng)基中，37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至90%細(xì)胞匯合時，加0.25%胰酶消化液消化傳代。

在氧糖剝奪再恢復(fù)(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型中，將BV2 細(xì)胞懸液以6×104/ml 接種于6 孔培養(yǎng)板中，以3×104/ml 接種于放有已滅菌細(xì)胞爬片的24 孔板中。生長至80%細(xì)胞匯合時，更換為含10 mmol/L Na2S2O2的DMEM 無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞分為6 組。對照1 組：單用無血清DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。AGC1組：用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)1.5 h 后，換為含0.5 U/ml AGC 的DMEM 高糖培養(yǎng)基。OGD/R 組：用含10 mmol/L Na2S2O2的DMEM 無糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h 后復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)3 h。L1 組、M1 組、H1 組：在氧糖剝奪1.5 h 后分別換為含0.25 U/ml、0.5 U/ml、1 U/ml AGC 的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h。復(fù)氧3 h后，6孔板小心吸出上清備用。

采用IL-4 刺激將小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)成M2 型，再加入LPS+IFN-γ將其從M2型向M1型轉(zhuǎn)化的模型中，將BV2 細(xì)胞懸液以6×104/ml 接種于6 孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞分為7 組。對照2 組：生長至80%細(xì)胞匯合時，單用DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。AGC2 組：用含0.5 U/ml AGC 的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。IL-4 組：用含20 ng/ml IL-4的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。IFN-γ 組用含20 ng/ml IL-4 的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，換為含100 ng/ml LPS 和20 ng/ml IFN-γ 的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后，換為DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。L2 組、M2組、H2 組：用含20 ng/ml IL-4 的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，換為含100 ng/ml LPS 和20 ng/ml IFN-γ的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h 后，分別換為含0.25 U/ml、0.5 U/ml、1 U/ml AGC的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.2.2ELISA檢測

將OGD/R 后的培養(yǎng)上清液吸出，4 ℃3000 r/min離心5 min，取上清液。取出酶標(biāo)包被板，每孔加入RD1-14 或RD1-63 50 μl，然后加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50 μl，密封后拍打混勻，室溫孵育2 h。吸棄液體后，加入洗液反復(fù)洗滌4 次，拍干。每孔加入IL-6 或TNF-α酶連物100 μl，密封，室溫孵育2 h。吸棄液體后，加入洗液反復(fù)洗滌4 次，拍干。每孔加入底物溶液100 μl，室溫避光孵育30 min，加入終止試劑100 μl，用酶標(biāo)儀測量吸光度值，計算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNFα、IL-6的含量。

1.2.3免疫熒光染色

取出24孔板，加4%細(xì)胞固定液室溫固定20 min，PBS 洗滌，PBST 室溫透膜20 min，PBS 洗滌，37 ℃、5%山羊血清封閉30 min，加入CD16+CD32、CD206抗體(1∶200) 4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌，加山羊抗兔、山羊抗大鼠熒光二抗(1∶500)37 ℃孵育1 h，PBS 洗滌，封片劑封片，拍照。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測

IL-4、LPS 和IFN-γ 處理后，收集細(xì)胞，3000 r/min 離心5 min，PBS 離心洗滌，計數(shù)，流式檢測的各組細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml。采用細(xì)胞表面直接免疫熒光染色方法，在細(xì)胞懸液中加入CD16+CD32、CD206抗體，室溫避光孵育20 min，PBS 洗滌2 次，用PBS 重懸細(xì)胞，吹打混勻，將懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測CD16+CD32、CD206的表達(dá)。采用Flowjo 10.0計算各指標(biāo)陽性細(xì)胞率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 AGC對OGD/R細(xì)胞模型炎癥因子分泌的影響

OGD/R 組IL-6、TNF-α 的含量均明顯高于對照組(P＜0.01)；L1 組、M1 組、H1 組IL-6、TNF-α 含量均明顯低于OGD/R組(P＜0.01)。見表1。

表1 各組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的含量比較(pg/ml)

2.2 AGC 對OGD/R 后M1 和M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響

與對照1 組相比，OGD/R 組CD16++CD32+細(xì)胞數(shù)增多，CD206+細(xì)胞數(shù)減少；與OGD/R 組相比，L1 組、M1 組、H1 組CD16++CD32+細(xì)胞數(shù)減少，CD206+細(xì)胞數(shù)增多。見圖1。

2.3 AGC對BV2細(xì)胞活化后M1和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響

與對照2 組比較，IL-4 組CD206有增多趨勢，CD16+CD32有降低趨勢；與IL-4 組比較，IFN-γ 組CD206有降低趨勢，CD16+CD32有增多趨勢；與IFN-γ組比較，L2 組、M2 組、H2 組CD16+CD32表達(dá)有降低趨勢，L2 組、M2 組CD206有增多趨勢，H2 組CD206表達(dá)增多(P＜0.05)。結(jié)果見圖2、3、表2。

圖1 AGC對OGD/R后CD16+CD32、CD206的影響(免疫熒光染色，正置熒光顯微鏡，×200)

圖2 AGC對IL-4刺激BV2細(xì)胞CD16+CD32表達(dá)的影響

表2 AGC對IL-4刺激BV2細(xì)胞CD16+CD32、CD206表達(dá)的影響(%)

3 討論

缺血性腦卒中發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，趨化免疫細(xì)胞遷移，細(xì)胞因子級聯(lián)瀑布效應(yīng)導(dǎo)致持續(xù)的炎癥反應(yīng)[11-12]。小膠質(zhì)細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的一種，廣泛存在大腦中。OGD/R模型簡便、易行，是公認(rèn)的體外腦缺血模型[13-14]。細(xì)胞因子的過表達(dá)是炎癥損傷病理的經(jīng)典特征，TNF-α 能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性，并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放。它能預(yù)測復(fù)發(fā)性缺血性腦卒中，可能與其參與動脈粥樣硬化形成和動脈粥樣硬化血栓形成有關(guān)[15-16]。IL-6 能誘導(dǎo)B 細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，并誘導(dǎo)T 細(xì)胞活化增殖、分化，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑[17-22]。本研究顯示，AGC 能夠有效減少IL-6、TNF-α的分泌，抑制炎癥反應(yīng)。

在缺血性腦卒中病理過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞M1 表型和M2表型影響疾病的過程和發(fā)展：促炎的M1表型雖然能分泌炎癥因子，對抗感染，但過度活化會加重炎癥反應(yīng)[23-25]；抗炎的M2表型雖然分泌一系列保護(hù)因子，但其一般在最初3 d內(nèi)大量表達(dá)，之后M1型占據(jù)主導(dǎo)地位[5-6,26]。調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的表型極化能夠抑制炎性因子的過量分泌。CD16+CD32是M1型小膠質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)記物，而CD206是M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)記物。在氧糖剝奪模型中，AGC 能誘導(dǎo)OGD/R 后小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化。

本研究采用IL-4 將小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)為M2 型，然后加入LPS+IFN-γ 將其誘導(dǎo)為M1 型，AGC 干預(yù)能夠在一定程度上抑制M2 向M1 極化，但是無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明，AGC主要通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化來減少炎癥反應(yīng)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向M1極化作用較弱。

本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞分子水平上初步闡明AGC 抑制細(xì)胞缺糖缺氧損傷后炎癥反應(yīng)的機(jī)制，即AGC 能夠通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 轉(zhuǎn)化，減少炎癥因子分泌，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生。

圖3 AGC對IL-4刺激BV2細(xì)胞CD206表達(dá)的影響