王依瀅，唐成林，邱國(guó)平，徐進(jìn)，隆令，許毅，王健蓉，甘勝偉，盛華均，朱淑娟

1.重慶醫(yī)科大學(xué)，a.人體解剖教研室；b.中醫(yī)藥學(xué)院，重慶市 400016；2.成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川成都市 610106；3.成都市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川成都市611130

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進(jìn)行性記憶力減退為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，β 淀粉樣蛋白(amyloid β,Aβ)沉積形成的老年斑和Tau 過(guò)度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)是其主要病理特征[1]。眾多學(xué)者對(duì)AD 的研究普遍集中于海馬這一與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū)[2]，但忽視了另一嚴(yán)重影響患者的癥狀，即以冷漠、抑郁和易激怒為主的精神行為癥狀(behavioral and psychological symptoms of dementia,BPSD)[3]。Huey 等[4]分析57 例AD 患者，發(fā)現(xiàn)腹內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(ventromedial prefrontal cortex,vPFC)與冷漠獨(dú)立相關(guān)。大腦額葉在認(rèn)知過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，其中注意力、工作記憶、決策是與前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex,PFC)相關(guān)的常見(jiàn)認(rèn)知功能[5]。PFC 病變可能同時(shí)與認(rèn)知功能損傷和BPSD 密切相關(guān)，成為AD 發(fā)病機(jī)制研究的另一重點(diǎn)區(qū)域。

目前，對(duì)AD 的治療并不理想。電針能有效改善AD 模型學(xué)習(xí)記憶能力，降低Aβ 沉積，并減少Tau 蛋白的過(guò)度磷酸化[6-8]。周期蛋白依賴性激酶5 (cyclindependent kinase 5,CDK5)及其調(diào)節(jié)因子P35/P25 在Tau 蛋白的過(guò)度磷酸化過(guò)程中具有重要作用。Aβ 的神經(jīng)毒性會(huì)破壞神經(jīng)元的鈣穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致鈣蛋白酶激活，并將P35 裂解為P25 和P10；CDK5 與其調(diào)節(jié)因子P35 或P25 結(jié)合后才具有生物活性。據(jù)報(bào)道[9-11]，P35和CDK5 結(jié)合形成的復(fù)合物具有神經(jīng)保護(hù)作用，而P25激活CDK5的功能更強(qiáng)，可能導(dǎo)致Tau蛋白的過(guò)度磷酸化。

本研究觀察電針百會(huì)、腎俞兩穴對(duì)AD 模型大鼠PFC P35/P25-CDK5-Tau 蛋白磷酸化信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為電針治療AD 的臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性成年Sprague-Dawley大鼠30只，體質(zhì)量240～280 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(渝)2018-0003。分籠飼養(yǎng)于恒溫恒濕環(huán)境中，自由進(jìn)食攝水。隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和電針組，每組6 只，剩余6只備用，并用苦味酸標(biāo)記。所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵循動(dòng)物福利與倫理準(zhǔn)則相關(guān)要求。

1.2 主要儀器和試劑

針灸針(直徑0.18 mm、長(zhǎng)25 mm)：北京中研太和醫(yī)療器械有限公司。6805-AⅡ電針儀：汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司。大鼠立體定位儀、Morris 水迷宮：美國(guó)瑞沃德公司。Legend Micro 17R 低溫離心機(jī)、1510酶標(biāo)儀：賽默飛世爾公司。37 ℃恒溫水浴箱：上海智城分析儀器制造有限公司。凝膠成像儀、蛋白電泳儀：BIO-RAD 公司。DM2000 光學(xué)顯微鏡、RM 2235ccwUS石蠟切片機(jī)：德國(guó)LEICA公司。

Aβ25-35(A4559)：SIGMA 公司。CDK5 兔單克隆抗體(ab400773)、Tau[pS199]兔單克隆抗體(ab81268)、Tau[pS202]兔單克隆抗體(ab108387)、Tau5 鼠單克隆抗 體(ab80579)：ABCAM 公司。P35/P25 兔單克隆抗體(2680)：CST 公司。β-actin 兔單克隆抗體(20536-1-AP)：PROTEINTECH 公司。HRP AffiniPure 山羊抗兔IgG (H+L) (E030120-01)、HRP AffiniPure 山羊抗鼠IgG (H+L) (E030110)：EARTHOX LIFE SCIENCE 公司。RIPA (P0013C)、PMSF (ST506)、一抗稀釋液(P0023A)、封閉液(P0023B)、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012S)：碧云天生物科技有限公司。Western blotting 配膠試劑盒(CW0022M)：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。ECL發(fā)光液(4AW011)：北京四正柏生物科技有限公司。SABC 免疫組化試劑盒(SA1050)：博士德生物工程有限公司。DAB 試劑盒(ZLI-9018)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。蘇木素染色液(G1080)：北京索萊寶科技有限公司。

1.3 AD模型建立

將Aβ25-35用無(wú)菌生理鹽水稀釋成1 g/L 的溶液，37 ℃水浴1 周。3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜選擇雙側(cè)海馬區(qū)域(前囟后4 mm，中線左右各旁開(kāi)2.9 mm，深度4.1 mm)，每側(cè)用微量注射器1 μl/min 注入Aβ25-3510 μl，留針10～15 min，1.0 mm/min 緩慢出針。牙托粉封固顱骨孔并縫合皮膚。每天肌肉注射青霉素G 10 萬(wàn)U，共3 d。假手術(shù)組雙側(cè)海馬注射等量生理鹽水。正常對(duì)照組不做處理。術(shù)后各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 電針治療

造模后第2 天，根據(jù)大鼠穴位定位圖譜，針刺電針組百會(huì)(頂骨正中部位)、腎俞(第2腰椎下旁開(kāi)7 mm左右)。百會(huì)向前平刺3～5 mm，腎俞稍向內(nèi)斜刺5 mm，連接電針儀，頻率2 Hz，電流2 mA，刺激15 min，每天1 次，共10 d。其余大鼠均只抓取不電針。由固定人員在固定時(shí)間操作。

1.5 Morris水迷宮

治療結(jié)束后次日進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。

可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)：第1～2 天，將水池均分為4 個(gè)象限，平臺(tái)位于第3 象限且高出水面約1 cm，將大鼠按照編號(hào)依次從4 個(gè)象限放入，每個(gè)象限各1 次且每只大鼠每次間隔30 min。單次尋找平臺(tái)時(shí)間為1 min，找到平臺(tái)則停止，若未找到則引導(dǎo)其至平臺(tái)并學(xué)習(xí)10 s。記錄大鼠找到平臺(tái)時(shí)間(逃避潛伏期)以及其搜索路徑。

隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)：第3～6 天，將平臺(tái)置于水面下約0.5 cm處，余同可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)。

空間探索實(shí)驗(yàn)：第7 天，撤掉平臺(tái)，將大鼠依次從4 個(gè)象限放入，記錄1 min 內(nèi)穿越原有平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.6 組織樣本取材

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)后，大鼠過(guò)量3%戊巴比妥鈉腹腔注射，心尖灌注0.9%氯化鈉溶液約200 ml，冰上取腦，左側(cè)PFC 組織用于提取蛋白，右側(cè)4%多聚甲醛固定24～48 h 后，蔗糖梯度脫水，石蠟包埋。連續(xù)冠狀切片，厚4 μm，室溫保存。

1.7 檢測(cè)方法

1.7.1免疫組織化學(xué)染色

切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，95 ℃下0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，洗片，3%H2O2室溫孵育，5% BSA 37 ℃封閉30 min，分別滴加P35/P25(1∶100)、CDK5(1∶100)、Tau5(1∶100)一抗4 ℃過(guò)夜。37 ℃復(fù)溫40 min，加入相應(yīng)二抗孵育60 min，洗片；滴加SABC 37 ℃孵育30 min，DAB 染色，蘇木素常溫染核30 s，光學(xué)顯微鏡下觀察顏色并適時(shí)終止，雙蒸水洗片，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，普通光學(xué)顯微鏡下采圖，Image J測(cè)量平均光密度(optical density,OD)。

1.7.2Western blotting

提取蛋白后，按40 μg 總蛋白進(jìn)行上樣，80 V恒壓電泳，截取目的和內(nèi)參條帶，250 mA恒流電轉(zhuǎn)1 h。將含有目的和內(nèi)參蛋白的PVDF膜放入封閉液中37 ℃孵育2 h，分別置于β-actin (1∶5000)、P35/P25 (1∶1000)、CDK5 (1∶2000)、Tau[pS199](1∶10000)、Tau[pS202](1∶10000)、Tau5 (1∶1000)一抗溶 液中4 ℃孵育過(guò)夜。PBST 常溫洗膜，加入相應(yīng)二抗(1∶10000)，37 ℃孵育1 h，PBST 清洗，ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行采圖，Quantity One 軟件分析各條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與β-actin 灰度比，作為相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組行動(dòng)緩慢、反應(yīng)遲鈍、食欲下降、毛發(fā)干燥。而電針組行動(dòng)、飲食和毛發(fā)情況等較模型組有明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 水迷宮測(cè)試

可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，各組逃避潛伏期和搜索路徑均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏期和搜索路徑延長(zhǎng)(P＜0.05)；與模型組比較，電針組縮短(P＜0.05)。見(jiàn)表2、表3。

空間探索實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P＜0.05)；與模型組比較，電針組穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

2.3 免疫組織化學(xué)染色

各組均有P35/P25、CDK5、Tau5 黃棕色陽(yáng)性表達(dá)，且集中表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。模型組P35/P25 和CDK5 陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P＜0.01)；電針組顯著低于模型組(P＜0.001)。見(jiàn)圖1、表5。

2.4 Western blotting

模型組Tau[pS199]、Tau[pS202]、CDK5、P35/P25 的相對(duì)表達(dá)高于正常組和假手術(shù)組(P＜0.05)，電針組低于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)圖2、表6。

表1 可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中各組逃避潛伏期和搜索路徑比較

表2 隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中各組逃避潛伏期比較(s)

表3 隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中各組大鼠搜索路徑的比較(cm)

表4 空間探索實(shí)驗(yàn)中各組穿越平臺(tái)次數(shù)比較

表5 各組PFC腦區(qū)P35/P25、CDK5、Tau5的表達(dá)(OD)

表6 各組PFC組織Tau5、Tau[pS199]、Tau[pS202]、CDK5、P35和P25蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(Western blotting)

圖1 各組PFC腦區(qū)P35/P25、CDK5、Tau5的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，bar=50 μm)

圖2 各組PFC組織Tau5、Tau[pS199]、Tau[pS202]、CDK5、P35/P25蛋白表達(dá)量比較

3 討論

既往對(duì)AD 發(fā)病機(jī)制和治療的研究主要集中在海馬區(qū)域。海馬與顳葉、頂葉、前扣帶回、基底節(jié)區(qū)等部位均有密切聯(lián)系[12-14]；之前被忽視的與工作記憶、社會(huì)認(rèn)知、情緒等密切相關(guān)的PFC 近年亦逐漸進(jìn)入研究者們的視野[15]。李傳明等[16]通過(guò)功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging,fMRI)等方法對(duì)AD 患者和健康老年人PFC 注意功能區(qū)進(jìn)行檢測(cè)與對(duì)比，結(jié)果顯示AD 患者雙側(cè)背外側(cè)PFC (dorsolateral prefrontal cortex,DLPFC)和vPFC 激活體積明顯小于正常組，提示AD患者的PFC存在一定程度的功能障礙。本研究選擇海馬注射Aβ25-35的方法建造AD 模型，觀察PFC P35/25、CDK5 及一些位點(diǎn)磷酸化的Tau 蛋白的表達(dá)變化，從Tau 蛋白的磷酸化路徑探究電針對(duì)AD的治療機(jī)制。

Aβ 沉積和Tau 蛋白過(guò)度磷酸化是AD 最主要的病理特征。許多研究發(fā)現(xiàn)二者間可能存在著聯(lián)系，共同導(dǎo)致AD 的發(fā)生[17-18]。Tau 蛋白的磷酸化程度主要取決于蛋白激酶和磷酸酶的平衡。CDK5 作為重要的激酶之一，是突觸發(fā)生與傳遞、神經(jīng)元遷移、細(xì)胞存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[19]，過(guò)度激活可能引起神經(jīng)退行性變等一系列病理改變[20]。P35 是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為35×103的蛋白，在興奮性毒性、氧化應(yīng)激等作用下，能夠被鈣蛋白酶分解為半衰期更長(zhǎng)且激活CDK5 能力更強(qiáng) 的P25[21-22]。Patrick 等[11]發(fā)現(xiàn)，P25/CDK5 復(fù)合物能夠使Tau 蛋白過(guò)度磷酸化，從而降低Tau 蛋白與微管結(jié)合的能力；并在原代神經(jīng)元中證明P25/CDK5 復(fù)合物的表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞骨架破壞、形態(tài)退化和凋亡。因此，P35/P25與CDK5的復(fù)合物可能與Tau蛋白磷酸化密切相關(guān)。

本研究顯示，模型組PFC 組織中的P35/P25、CDK5，以及Ser199 和Ser202 位點(diǎn)上的磷酸化Tau 蛋白表達(dá)增加，可能是Aβ的毒性作用影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，促進(jìn)P35 生成增多，并裂解形成的P25 亦增多，與CDK5 形成復(fù)合物，導(dǎo)致Tau 蛋白在Ser199 和Ser202 位點(diǎn)上的磷酸化程度增加。Shi 等[23]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Aβ25-35處理后的神經(jīng)元中P35 明顯減少，與本研究不符，這可能是由于離體和在體實(shí)驗(yàn)中組織細(xì)胞生存環(huán)境的差異所致。還有報(bào)道顯示，AD患者腦組織中P25含量并未增加[24]，在AD早期P25表達(dá)甚至減少[25]。模型選擇、樣本來(lái)源、病程階段以及實(shí)驗(yàn)方法的差異等都可能引起這些矛盾的結(jié)果。

目前，許多學(xué)者希望通過(guò)單一制劑對(duì)AD 發(fā)病機(jī)制中的某些相關(guān)因子進(jìn)行調(diào)控，如CDK5 抑制劑，并設(shè)想其能抑制CDK5 活性或干擾P25 與CDK5 復(fù)合物的形成，從而達(dá)到延緩AD 的發(fā)生發(fā)展的功效，但它可能同時(shí)影響CDK 家族的其他成員，導(dǎo)致嚴(yán)重副作用的發(fā)生[26]。針灸(電針)可能通過(guò)改善線粒體超微結(jié)構(gòu)[27]、提高突觸密度[28]、抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[29-30]、減輕腦內(nèi)自由基對(duì)神經(jīng)元的損傷[31]、改善炎性反應(yīng)[32]，維持AD 模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。本研究顯示，電針百會(huì)和腎俞減少AD 模型鼠PFC P35/P25和CDK5 的表達(dá)，減緩Ser199 和Ser202 位點(diǎn)上Tau 蛋白的磷酸化?？梢?jiàn)，針灸(電針)對(duì)AD 模型鼠的干預(yù)機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。

綜上所述，大鼠海馬注射Aβ25-35后，能激活PFC P35/P25-CDK5-Tau 蛋白磷酸化信號(hào)通路，誘發(fā)Tau 蛋白過(guò)度磷酸化；電針可抑制PFC P35/P25-CDK5-Tau蛋白磷酸化信號(hào)通路，從而抑制Tau 蛋白過(guò)度磷酸化從而延緩NFTs的形成。但Tau蛋白其他位點(diǎn)的變化情況及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的改變有待進(jìn)一步探討。另外，電針如何調(diào)節(jié)眾多信號(hào)物質(zhì)變化的關(guān)鍵步驟等也值得進(jìn)一步研究。