史云容，張峻嶺，康元

（1.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東濟(jì)寧272000；2.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津300120；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，天津300193）

皮膚老化，除了自然老化最重要的是紫外線照射引起的光老化。光老化皮膚表現(xiàn)為暴露部位皺紋加深、皮膚松弛，色素沉著與色素減退，毛細(xì)血管擴(kuò)張及皮膚微循環(huán)的改變等[1]。長期反復(fù)的紫外線照射是引起皮膚光老化的主要元兇，為了探討葡萄籽提取物原花青素（Grape-seed proanthocyanins，GSPE）是否可以改善光老化皮膚的微循環(huán)改變及血管擴(kuò)張，設(shè)計(jì)進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 DMEM高糖液態(tài)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、D-Hank’s液均購自天津?yàn)笊锟萍加邢薰?，噻唑蘭（MTT）比色法細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢驗(yàn)試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，葡萄籽提取物原花青素（GSPE）為天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司贈(zèng)送，TRANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR GreenⅠ、TRIzol購自天根生化科技有限公司，引物由徐世文教授設(shè)計(jì)惠贈(zèng)，GAPDH引物序列根據(jù)PubMed基因庫提供的等位基因核苷酸序列設(shè)計(jì)，均由南京金瑞斯生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HaCaT細(xì)胞以密度為1×105/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，8 mL（血清含量10%）培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件37℃，5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液1次，待細(xì)胞密度到達(dá)1×106～2×106/mL時(shí)進(jìn)行傳代。取細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期、密度近1×106/mL（融合度近80%）時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 長波紫外線（UVA）照射 照射光源為SS-03A UVA光療儀，波長320～400 nm，照射距離為15 cm。待HaCaT細(xì)胞生長至約80%融合，棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，96孔板加入約150 μL PBS或D-Hank’s液形成細(xì)胞上液面。分別用劑量為0、8、10、15、20、25、30、40 J/cm2UVA 照射 HaCaT 細(xì)胞，24 h后檢測(cè)其增殖活性。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 空白對(duì)照組、單純光照組（25 J/cm2的UVA照射）及照光加藥組（GSPE的實(shí)驗(yàn)濃度經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選后分別設(shè)定為 10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL），共 5 組，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法 引物序列根據(jù)PubMed基因庫提供的等位基因核苷酸序列設(shè)計(jì)，由南京金瑞斯生物科技有限公司合成。首先提取總RNA后進(jìn)行濃度和純度的鑒定及完整性的檢測(cè)。再以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行一系列RTPCR反應(yīng)。目的基因與內(nèi)參的擴(kuò)增斜率差值＜0.1，可以應(yīng)用ΔΔCt進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，符合正態(tài)分布以s表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，其中兩兩間比較用最小顯著差（LSD）法比較，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 單純光照組比空白對(duì)照組VEGF mRNA的表達(dá)量升高（P＜0.05）。相比單純光照組，照光加藥物各組 VEGF mRNA的表達(dá)量低（P＜0.05），且呈濃度依賴性。當(dāng)藥物濃度為100 μg/mL時(shí)可使VEGF mRNA表達(dá)量接近正常水平（與空白對(duì)照組比 P＞0.05）。

2.2 單純光照組比空白對(duì)照組色素上皮衍生因子（PEDF）mRNA的表達(dá)量降低（P＜0.05），照光加藥各組比單純光照組PEDF mRNA的表達(dá)量高（P＜0.05），且當(dāng) 藥 物 濃度為 50 μg/mL、100 μg/mL 時(shí)可 使PEDF mRNA的表達(dá)量接近正常水平（與空白對(duì)照組比 P＞0.05）。

表1 各組VEGF和PEDF mRNA相對(duì)表達(dá)量分析 （2-ΔΔCt，±s）

表1 各組VEGF和PEDF mRNA相對(duì)表達(dá)量分析 （2-ΔΔCt，±s）

注：兩兩間比較采用LSD法分析，兩基因的其他各組與單純光照組比，所有組*P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。余各組與空白對(duì)照組比，#P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別 VEGF PEDF空白對(duì)照組 1.00* 1.00*單純光照組 1.51±0.06# 0.65±0.18#照光加 GSPE 組 1（10 μg/mL） 1.27±0.10*△ 0.86±0.06*#照光加 GSPE 組 2（50 μg/mL） 1.17±0.07*# 0.89±0.03*照光加 GSPE 組 3（100 μg/mL） 0.92±0.08* 0.93±0.10*F 53.19 9.24

3 討論

隨著光老化研究的深入，越來越多的證據(jù)表明血管因素與紫外線引起的色素沉著有關(guān)。近期Hasegawa等[2]報(bào)道了24例面部日光性黑子患者活檢的研究，免疫組化結(jié)果一致顯示，血管密度顯著增加，血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平升高。所以血管因素也是研究皮膚光老化的一個(gè)重要窗口。

VEGF和PEDF已被證明是在生理病理?xiàng)l件下影響血管生成平衡的重要因子[3]。VEGF又稱血管滲漏因子，是機(jī)體內(nèi)影響血管結(jié)構(gòu)和功能的重要細(xì)胞因子，有多種生物功能，例如能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)毛細(xì)血管管腔的形成，延長血管內(nèi)皮細(xì)胞壽命，增強(qiáng)血管通透性等作用。已有研究顯示紫外線照射可上調(diào)VEGF的表達(dá)[4]，但新生的血管表現(xiàn)出通透性增高和滲透性增加，再加上從新生血管中滲漏出的炎性細(xì)胞與其產(chǎn)生的炎性介質(zhì)，共同造成的急性炎性反應(yīng)導(dǎo)致了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的進(jìn)一步退化，從而為正常內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能提供了一個(gè)惡劣的，不兼容的環(huán)境，導(dǎo)致了光老化皮膚血管的擴(kuò)張、最終血管減少。PEDF作為目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的內(nèi)源性血管生成抑制劑，有明確的抗腫瘤作用，還在維持組織穩(wěn)態(tài)，抑制氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和凝血反應(yīng)中起到重要作用[5]。PEDF在角質(zhì)層表達(dá)明顯高于真皮層[6]，而且體外培養(yǎng)的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞也有大量的表達(dá)[7]。既往對(duì)于角質(zhì)形成細(xì)胞分泌VEGF和PEDF的研究[8-9]多集中于銀屑病、腫瘤等方面，因?yàn)樗麄儏⑴c了角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、血管的新生等，罕見有光老化皮膚血管微循環(huán)方面的研究，尚未見報(bào)道紫外線照射對(duì)PEDF表達(dá)的影響。

經(jīng)查文獻(xiàn)[10]和筆者團(tuán)隊(duì)的前期研究[11-12]證明了GSPE是一種安全范圍廣有光保護(hù)作用的天然植物提取成分，為了探究其是否能夠抵御紫外線照射引起的皮膚血管改變進(jìn)行了本次研究。實(shí)驗(yàn)選取HaCaT細(xì)胞為靶細(xì)胞，研究UVA照射對(duì)皮膚血管生成和抑制因子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示UVA照射HaCaT細(xì)胞后，會(huì)升高VEGF mRNA、降低PEDF mRNA的表達(dá)，二者協(xié)同最終導(dǎo)致了光老化早期皮膚的毛細(xì)血管增多、毛細(xì)血管擴(kuò)張。而加入了GSPE后，可以下調(diào)VEGF基因的表達(dá)、同時(shí)上調(diào)PEDF基因的表達(dá)，二者協(xié)同作用的結(jié)果是抑制不穩(wěn)定的血管新生。證實(shí)了GSPE有抗紫外線所致光老化早期血管生成的作用。據(jù)此筆者也希望，這種廉價(jià)易得的GSPE能夠在抵抗光老化方面得到更廣泛的應(yīng)用。