吳盤紅，謝婷，王海燕，范瑞強(qiáng)

（1.河南省中醫(yī)院，河南鄭州450002；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510120；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州450000）

外陰陰道念珠菌?。╒ulvovaginal candidiasis，VVC）是困擾育齡期女性的臨床常見病多發(fā)病，主要表現(xiàn)為外陰嚴(yán)重瘙癢和灼痛，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量。據(jù)估計(jì)約3/4的女性在育齡期至少患過1次VVC，其中一半患者經(jīng)歷過復(fù)發(fā)，有5%～8%的成年女性1年發(fā)作4次以上，即復(fù)發(fā)性VVC（Recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC）[1]。國內(nèi)外研究數(shù)據(jù)均表明，目前導(dǎo)致VVC的病原菌仍以白念珠菌為主，占比達(dá)70%～90%，而在非白念珠菌中感染中則以光滑念珠菌最為常見，其中光滑念珠菌對三唑類抗真菌藥物耐藥率也最高[2-3]。因此，對于RVVC患者人群，除白念珠菌感染外，光滑念珠菌感染扮演了重要角色。硝酸咪康唑被歐洲國際性病控制聯(lián)盟列為治療VVC首選藥物[4]，但由于該藥物多年來的臨床上的廣泛應(yīng)用，其耐藥現(xiàn)象也在不斷的增加，特別對于RVVC，讓臨床選擇可用的有效的藥物治療面臨嚴(yán)重困難，故尋找探索研究新型的抗真菌藥物成分或者已有及新型的抗真菌藥物增效劑已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)、重點(diǎn)和難點(diǎn)。

香蓮?fù)庀匆菏菑V東省中醫(yī)院的院內(nèi)名方，作為院內(nèi)制劑廣泛應(yīng)用于手足癬、體癬、VVC及其他外陰瘙癢性疾病的治療，臨床療效顯著。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)該藥物有顯著的抗真菌效應(yīng)，并可誘導(dǎo)對唑類耐藥的白念珠菌菌株恢復(fù)對唑類藥物的敏感性[5-6]。中藥黃連味苦，性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，是香蓮?fù)庀匆航M方的君藥成分之一。為更深入的探討香蓮?fù)庀匆旱木唧w作用機(jī)制，本研究以其君藥黃連為切入點(diǎn)，應(yīng)用微量肉湯稀釋法[7]測定并比較黃連煎煮液、2%硝酸咪康唑溶液單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用于白念珠菌和光滑念珠菌的最低抑菌濃度（MIC），同時(shí)采用聯(lián)合抑菌指數(shù)（FICI）來判斷二者是否有聯(lián)合效應(yīng)，以期為臨床VVC治療方案的選擇提供確切的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及試劑 科瑪嘉顯色培養(yǎng)基、RPMI-1 640液體培養(yǎng)基、薩布羅培養(yǎng)基（SDA）、無菌96孔培養(yǎng)板、可換濾膜針頭式過濾器（均購自廣州市迪景微生物科技有限公司），離心管、振蕩器、微量移液器、ESCO超凈工作臺、無菌聚乙烯小管、電子分析天平儀等。

1.2 藥物 黃連煎煮液：黃連（生產(chǎn)企業(yè)：康美藥業(yè)股份有限公司；產(chǎn)地：四川；批號：120300891；生產(chǎn)日期：2012年3月27日）10 g，放入藥煲后加純化水300 mL，浸泡30 min后，先用大火燒開，后用小火煎40 min，尼龍網(wǎng)過濾，藥渣再加300 mL純化水，大火燒開后小火煎煮40 min，尼龍網(wǎng)過濾出藥液，將2次煎煮的濾液合并，得到藥液269 mL，用純化水將藥液定容為200 g/L，用0.22 μm的可換濾膜針頭式過濾器重復(fù)過濾滅菌后，置于無菌離心管容器中，并封口置于-20℃冰箱中恒溫保存。

2%硝酸咪康唑溶液（上海世康特制藥有限公司；國藥準(zhǔn)字號：H31022700），規(guī)格：20 mL（含硝酸咪康唑0.4 g，濃度為2%）。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌種 所有菌種均來自于廣東省中醫(yī)院婦科門診VVC患者的白帶標(biāo)本（2010年9月1日—2011年2月30），所收集的臨床標(biāo)本用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基確證是白念珠菌菌株、光滑念珠菌菌株者各15株；質(zhì)量控制菌株：近平滑假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 22019、克柔假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 6258，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院贈送。置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.4 白念珠菌和光滑念珠菌的培養(yǎng)及鑒定 白念珠菌的培養(yǎng)和鑒定：取臨床確診為VVC的外陰陰道分泌物標(biāo)本，將棉簽蘸取適量的標(biāo)本成井字形涂于沙保氏培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，肉眼可見菌落后，將呈白色、奶油色菌落分離并轉(zhuǎn)種于科嘉瑪顯色板上，37℃恒溫箱中再培養(yǎng)24～48 h后，肉眼可見各色菌落，挑出呈綠色或者翠綠色的菌落，同時(shí)用YBC酵母菌鑒定卡進(jìn)行鑒定，選用鑒定為白念珠菌者，共選用15株。

光滑念珠菌的培養(yǎng)和鑒定：培養(yǎng)方法和操作步驟同白念珠菌，挑出紫紅色的菌落，并同時(shí)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒進(jìn)行檢測鑒定，確定為光滑念珠菌菌株者，共15株。

為了進(jìn)一步保證實(shí)驗(yàn)中選用菌株的純度及活力，再次將白念珠菌、光滑念珠菌二次接種在沙保氏培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，后放置10℃恒溫箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 選用微量液基稀釋法進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn) 依據(jù)是美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）提出的標(biāo)準(zhǔn)（M27-A3方案）[7]。

1.5.1 藥物的配制 在CLSI提出的標(biāo)準(zhǔn)中，因無2%硝酸咪康唑溶液的相關(guān)研究內(nèi)容，所以本研究實(shí)驗(yàn)操作及步驟均參照CLSI中提供的氟康唑的實(shí)驗(yàn)方法。藥物劑量公式：所需藥物量=稀釋劑用量（mL）×貯存液濃度（μg/mL）/藥物有效力（μg/mg）。2%硝酸咪康唑溶液用培養(yǎng)液來稀釋，使貯存液濃度為1280μg/mL，實(shí)際應(yīng)用濃度范圍為0.125～128μg/mL；黃連煎煮液原液濃度為200 mg/mL，實(shí)際應(yīng)用濃度范圍為0.244～20 mg/mL。（藥物貯存液置于無菌聚乙烯小瓶，并放置于-70℃冰箱保存）。

1.5.2 菌懸液的制備 首先用消毒接種環(huán)在實(shí)驗(yàn)菌株沙保氏培養(yǎng)基上刮取直徑＞1 mm的菌落，將菌落加至試管內(nèi)，試管內(nèi)裝適量0.85%的無菌生理鹽水，接著用消毒接種環(huán)研磨菌塊至均勻，為了更好的將菌塊混勻，最后將試管置于漩渦振蕩器上震蕩約10 s，至此菌懸液制成。用比濁儀測量菌懸液濁度，用0.85%的無菌生理鹽水菌使懸液濁度達(dá)調(diào)到0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，相?dāng)于（1×106～5×106）CFU/mL，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡來確定其是否在此范圍。用上述制備好的RPMI1640培養(yǎng)基1∶20倍稀釋后再1∶50倍稀釋至最終濃度為（1×103～5×103）CFU/mL。

1.5.3 接種 排列方式：96孔板上每4排為1組實(shí)驗(yàn)藥物，即每1個(gè)菌株每1組藥物設(shè)計(jì)平行4排實(shí)驗(yàn)。

單用2%硝酸咪康唑溶液組：在96孔板的平行4排每1排第1孔加入160 μL的RPMI培養(yǎng)基，其余各孔加入100 μL后，在第1孔加入40 μL的配制好的2%硝酸咪康唑溶液，攪拌混勻后，接著用微量移液器從第1孔中吸取100 μL到第2孔，攪拌混勻后，接著用微量移液器從第2孔中吸取100 μL到第3孔，攪拌混勻，同樣的方法和步驟，連續(xù)倍比稀釋至第11孔，攪拌混勻，從第11孔吸取100 μL棄去，每1排最后1孔為第12孔，為不含藥物的生長對照孔（只含培養(yǎng)液和菌液）。最后在每孔中加入100 μL菌懸液，攪拌混勻。此時(shí)單用2%硝酸咪康唑溶液組96孔板的平行4排從第1孔至第11孔經(jīng)過2倍的等比稀釋之后，每孔的藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。

單用黃連煎煮液組：分別在96孔板的平行4排的每1空加入100 μL的RPMI培養(yǎng)基，然后在每排第1孔加入100 μL的黃連煎煮液，攪拌混勻后，用微量移液器從第1孔中吸取100 μL移到第2孔，攪拌混勻，用同樣的方法和步驟，從第2孔中吸取100 μL移到第3孔，攪拌混勻，連續(xù)倍比稀釋至第11孔，攪拌混勻，從第11孔吸取100 μL棄去，每1排最后1孔為第12孔，為不含藥物的生長對照孔（只含培養(yǎng)液和菌液）。最后在每孔中加入100 μL菌懸液，攪拌混勻。此時(shí)單用黃連煎煮液組96孔板的平行4排從第1孔至第11孔經(jīng)過2倍的等比稀釋之后，每孔的藥物濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195、0.098、0.048 mg/mL。

2%硝酸咪康唑溶液+黃連煎煮液組：首先在96孔板平行4排第1孔到第12孔分別加入100 μL的RPMI培養(yǎng)基，接著在每排第1孔分別加入40μL的2%硝酸咪康唑溶液，和60 μL的黃連煎煮液，攪拌混勻，然后用微量移液器從第1孔中吸取100 μL到第2孔，攪拌混勻，按照同樣的方法和步驟，接著用微量移液器從第2孔中吸取100 μL到第3孔，連續(xù)倍比稀釋至第11孔，攪拌均勻，從第11孔吸取100 μL棄去；每排最后1孔為第12孔，為不含藥物的生長對照孔（只含培養(yǎng)液和菌液）。最后在12孔中分別加入菌懸液各100 μL，攪拌混勻。此時(shí)2%硝酸咪康唑溶液+黃連煎煮液組96孔板的平行4排從第1孔至第11孔經(jīng)過2倍的等比稀釋之后，每孔含有2%硝酸咪康唑溶液藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL，每孔含有黃連煎煮液的濃度為 30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375、0.468、0.234、0.117、0.059、0.025 g/L。

質(zhì)控菌株的接種方法同以上步驟。每組實(shí)驗(yàn)平行對照做4次。最后將制好的96孔板置37℃恒溫箱孵育48 h，觀察并記錄結(jié)果。同時(shí)棄掉結(jié)果差異大的孔板。

1.5.4 質(zhì)量控制 同時(shí)近平滑假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC22019、克柔假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株6258按照上述方法和步驟進(jìn)行MIC測定，進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.5.5 MIC的判定 48 h的孵育結(jié)束之后，肉眼比較各孔的生長情況，并與對照孔進(jìn)行比較評分。4分：濁度不減低，表示生長無抑制；3分：濁度輕度降低，表示生長輕微減少或者相當(dāng)于生長對照孔的75%；2分：濁度明顯減低，表示生長明顯減少或者相當(dāng)于生長對照孔的50%；1分：輕微模糊，表示輕微生長或者相當(dāng)于生長對照孔的25%；0分：肉眼觀察澄清或者未見生長。記錄每1組的每孔評分。實(shí)驗(yàn)過程中，如果發(fā)現(xiàn)藥物濃度高的孔反而較藥物濃度低的孔生長多，或者呈現(xiàn)出對照孔異常生長，或者結(jié)果表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)菌株不在質(zhì)控范圍時(shí)，均進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中以生長明顯減少，以及約相當(dāng)于生長對照孔的50%（約50%受試菌被抑制生長），作為MIC值判斷終點(diǎn)。

1.5.6 聯(lián)合用藥效果評價(jià)[7]實(shí)驗(yàn)結(jié)果以FICI來判斷二者的聯(lián)合效應(yīng)。FICI：MICA聯(lián)合/MICA單獨(dú)+MICB聯(lián)合/MICB單獨(dú)。當(dāng)FICI≤0.5時(shí)為協(xié)同作用；0.5＜ FICI≤1 時(shí)為相加作用；L＜FICI≤4 時(shí)為無關(guān)作用；當(dāng)FICI＞4時(shí)為拮抗作用。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)研究所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組計(jì)量資料間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若非正態(tài)分布或方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。組間率的差異比較采用卡方檢驗(yàn)。建議水平為α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控結(jié)果 質(zhì)控菌株ATCC22019、ATCC6258MIC值分別在 0.5～0.25 μg/mL 和 4～8 μg/mL 之間，結(jié)果符合CLSI所推薦的M27-A3的48 h標(biāo)準(zhǔn)，表示結(jié)果均在控，實(shí)驗(yàn)條件及操作均符合要求。

2.2 單用2%硝酸咪康唑溶液、黃連煎煮液及二者聯(lián)用作用于臨床15株白念珠菌、光滑念珠菌的MIC值。

單用2%硝酸咪康唑溶液作用于15株白念珠菌MIC 值見表 1，平均 MIC 值為（14.0±14.99）μg/mL；單用2%硝酸咪康唑溶液作用于15株光滑念珠菌的MIC 值見表 1，其 MIC 均值為（14.88±25.15）μg/mL。單用2%硝酸咪康唑溶液作用于白念珠菌、光滑念珠菌的MIC值比較，P＞0.05表明2%硝酸咪康唑溶液對白念珠菌、光滑念珠菌的敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

單用黃連煎煮液作用于15株白念珠菌MIC值見表 1，其 MIC 均值為（8.18±7.38）mg/mL。單用黃連煎煮液作用于15株光滑念珠菌的MIC值見表1，其 MIC 均值為（9.38±4.09）mg/mL。單用黃連煎煮液作用于白念珠菌、光滑念珠菌的MIC值比較，P＞0.05為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明黃連煎煮液對白念珠菌、光滑念珠菌的敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表1 單用和聯(lián)用2%硝酸咪康唑溶液、黃連煎煮液作用于白念珠菌、光滑念珠菌的MIC值 （±s）

表1 單用和聯(lián)用2%硝酸咪康唑溶液、黃連煎煮液作用于白念珠菌、光滑念珠菌的MIC值 （±s）

黃連煎煮液（g/L）白念珠菌 32 25 32 7.5 32 25 32 7.5 32 25 16 3.75 32 25 2 0.47 32 12.5 2 0.47 32 12.5 2 0.47 4 12.5 1 0.23 4 12.5 1 0.23 4 12.5 1 0.23 2 12.5 0.25 0.23 1 12.5 0.25 0.23 1 12.5 0.25 0.23 0.5 1.56 0 0 0.5 1.56 0 0 0.5 1.56 0 0光滑念珠菌 64 12.5 16 3.75 64 12.5 16 3.75 64 12.5 16 3.75 8 12.5 16 3.75 8 12.5 16 3.75 8 12.5 16 3.75 2 12.5 8 1.88 2 12.5 4 0.94 2 12.5 4 0.94 0.5 6.25 1 0.23 0.5 6.25 1 0.23 0.25 6.25 1 0.23 0 3.125 0.25 0.05 0 3.125 0.25 0.05 0 3.125 0.25 0.05方法 2%硝酸咪康唑溶液（μg/mL）黃連煎煮液（mg/mL）聯(lián)用2%硝酸咪康唑溶液（μg/mL）

2%硝酸咪康唑溶液+黃連煎液共同作用于15株白念珠菌的MIC值，其中2%硝酸咪康唑的MIC值見表 1，其均值為（5.98±11.28）μg/mL。黃連煎煮液的MIC值見表1，其MIC均值為（1.43±2.63）mg/mL。二者的FICI=0.53，表明黃連煎煮液+2%硝酸咪康唑溶液共同作用于白念珠菌后，表現(xiàn)為相加作用，見表2。黃連煎煮液對2%硝酸咪康唑溶液抗白念珠菌有較好的抗菌增效作用。

表2 單用和聯(lián)用2%硝酸咪康唑溶液、黃連煎煮液作用于臨床菌株的MIC均值及FICI值

2%硝酸咪康唑溶液+黃連煎煮液共同作用于15株光滑念珠菌的MIC值，其中2%硝酸咪康唑溶液的MIC值見表1，其MIC均值為（7.71±7.28）μg/mL。其中黃連煎煮液的MIC值見表1，其MIC均值為（1.80±1.71）mg/mL。二者的 FICI=0.70，表明 2%硝酸咪康唑溶液+黃連煎煮液共同作用于白念珠菌后，表現(xiàn)為相加作用，見表2。黃連煎煮液對2%硝酸咪康唑溶液抗光滑念珠菌有較好的抗菌增效作用。

2%硝酸咪康唑溶液、黃連煎煮液二者單用作用于白念珠菌、光滑念珠菌的MIC值和2%硝酸咪康唑溶液+黃連煎煮液共同作用后的MIC值比較，行單樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；說明聯(lián)用后二者對白念珠菌、光滑念珠菌的敏感性均明顯增加。

3 討論

黃連為毛茛科的黃連、三角葉黃連或云連的干燥根莖。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，一直被列為上品[8]?！侗静菥V目》載曰：“其根連珠而色黃，故名”[9]。該藥性寒味苦，氣味俱厚，歸心、胃、肝、大腸經(jīng)，可去除中焦?jié)駸?，瀉心火，為清熱燥濕、瀉火解毒之要藥。

黃連在臨床上的應(yīng)用非常廣泛，其抗菌作用是在歷年文獻(xiàn)報(bào)道中最多的，有“中藥抗生素”的美稱。黃連的抗菌譜較廣，無論是對于真菌如各類念珠菌感染[10-11]等，還是革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌[12]、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[13-14]、超廣譜-β內(nèi)酰胺酶肺炎球菌感染等，革蘭氏陰性菌如銅綠假單胞菌[15-16]、大腸埃希菌[17-18]、耐藥鮑曼不動桿菌[19-20]、淋病奈瑟氏菌感染[21]等，均有很好的抗菌作用。廣泛用于皮膚系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)以及淺表真菌感染類疾病。

現(xiàn)代藥理研究證明：黃連的主要有效成分為：黃連素、香草酸、落葉松樹脂醇、小檗堿，丹參素甲酯、氧化小檗堿等[22]。黃連尤其是黃連的活性成分如小檗堿在體外細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)有廣泛的藥理活性，廣泛應(yīng)用于抗菌抗炎、神經(jīng)調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗糖尿病等幾大方面。大量的研究表明黃連的功效可能和中藥黃連多靶點(diǎn)的作用機(jī)制有關(guān)[23]。對于深部真菌感染（白念珠菌），黃連提取液同樣有非常理想的抗真菌作用，研究表明黃連的醇提取物較黃連水提取物能更好地抑制白色念珠菌的活性[24]?；谝陨涎芯炕A(chǔ)及黃連作用機(jī)制的復(fù)雜性，筆者未采用黃連的某一成分如黃連素等進(jìn)行研究，而是選用黃連煎煮液，這樣能更全面的了解中藥黃連的抑制皮膚念珠菌的效果。而黃連在抗真菌的作用體外研究表明[25]：黃連能抑制白念珠菌生長，同時(shí)能下調(diào)陰道組織中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1的表達(dá)，通過下調(diào) TGF-β1的表達(dá)，來改善陰道局部的免疫狀態(tài)，這可能是黃連抑制白念珠菌病發(fā)生及復(fù)發(fā)的重要作用機(jī)制，因此推測黃連有望成為一種新的治療復(fù)發(fā)性白念珠菌陰道炎的靶向藥物，而其具體詳細(xì)的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

本體外實(shí)驗(yàn)表明，2%硝酸咪康唑溶液、黃連煎煮液在抗陰道白念珠菌、光滑念珠菌方面均有穩(wěn)定可靠的抑菌效果。2%硝酸咪康唑溶液聯(lián)用黃連煎煮液后，二者M(jìn)IC值均較單用明顯降低，而且這種降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；一定程度上說明，聯(lián)用黃連煎煮液后增強(qiáng)了2%硝酸咪康唑乳液對白念珠菌及光滑念珠菌對藥物的敏感性，增強(qiáng)了二者的抑菌作用，從而表現(xiàn)出較單用藥物更理想的抑菌作用。本課題組前期研究表明：香蓮?fù)庀匆涸谂R床研究和實(shí)驗(yàn)室的研究中對2%硝酸咪康唑溶液均有明顯的抑菌作用和增效作用[26-27]。而黃連是香蓮?fù)庀匆旱木幹?，黃連在本體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮的作用和香蓮?fù)庀匆旱淖饔眯Ч３忠恢?，單用即對白念珠菌、光滑念珠菌均有明確的抑菌作用，同2%硝酸咪康唑溶液聯(lián)用之后，對白念珠菌、光滑念珠菌的抑菌作用增強(qiáng)，表現(xiàn)出對2%硝酸咪康唑溶液明顯的協(xié)同作用和增效作用。這一發(fā)現(xiàn)為單藥外用及復(fù)方中藥治療VVC有效抑菌性及聯(lián)用抗真菌藥后的增效性進(jìn)一步提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，為治療頑固性復(fù)發(fā)性念珠菌陰道炎的治療提供一種新的有效的方法，同時(shí)也為臨床其他皮膚真菌治療的藥物選擇提供了參考方案。

值得說明的是，雖然二者聯(lián)用后對白念珠菌、光滑念珠菌的敏感性均明顯增加，但通過比較2%硝酸咪康唑溶液+黃連煎煮液共同作用于白念珠菌、光滑念珠菌的MIC值，筆者發(fā)現(xiàn)2%硝酸咪康唑溶液對白念珠菌、光滑念珠菌的MIC值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明白念珠菌和光滑念珠菌均對2%硝酸咪康唑溶液普遍敏感；另外，聯(lián)用后黃連煎煮液對白念珠菌、光滑念珠菌的MIC值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明白念珠菌、光滑念珠菌對黃連煎煮液普遍敏感；以上數(shù)據(jù)在一定程度上說明，二者聯(lián)用后對白念珠菌、光滑念珠菌的增效作用是相當(dāng)?shù)模瑳]有表現(xiàn)為對白念珠菌或者光滑念珠菌抑菌更明顯的現(xiàn)象。一定程度上表明二者對白念珠菌和光滑念珠菌抑制的普遍性、穩(wěn)定性和有效性。

由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本研究結(jié)果存在一定的局限性。其中可能的影響因素在于以下2個(gè)方面：一是藥物的選擇及實(shí)驗(yàn)方法本身的不足可能產(chǎn)生的對結(jié)果的影響，CLSL推薦的M27-A3方案中所用藥物為氟康唑藥粉劑，而本研究中所用藥物為2%硝酸咪康唑溶液，這主要是考慮到臨床的實(shí)際需求。因?yàn)獒t(yī)者們在臨床中治療外陰念珠菌性陰道炎最常用的藥物成分是硝酸咪康唑成分，硝酸咪康唑也是歐洲國際性病控制聯(lián)盟列為治療VVC首選藥物[4]，為了進(jìn)一步驗(yàn)證硝酸咪康唑成分在體外對念珠菌的抑菌能力，以及體外聯(lián)用黃連煎煮液的抑菌效果，所以實(shí)驗(yàn)中選用了硝酸咪康唑溶液（硝酸咪康唑沒有粉劑）。這樣實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對臨床VVC的治療方案的選擇更有指導(dǎo)意義說服力。此外，本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照CLSI推薦的M27-A3方案，參照氟康唑藥敏操作規(guī)范進(jìn)行的。而其他文獻(xiàn)報(bào)道中較少采用此標(biāo)準(zhǔn)，一般采用紙片法，通過觀察抑菌圈的大小等進(jìn)行判定，因此所采用的方法和判定標(biāo)準(zhǔn)有所不同，可能會導(dǎo)致最終結(jié)果的差異。二是菌株來源及保存，既往文獻(xiàn)報(bào)道中多采用標(biāo)準(zhǔn)菌株，而本實(shí)驗(yàn)所采用的菌株均為臨床VVC患者陰道分泌物中培養(yǎng)出的菌株，不同的菌株也有可能會導(dǎo)致結(jié)果有所不同。此外，由于廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室的條件所有限，標(biāo)本很難長時(shí)間保存。工作用的菌株置于10℃冰箱中貯藏，為了保證其活性，需要每隔2周進(jìn)行1次接種培養(yǎng)，雖然實(shí)驗(yàn)在最短的時(shí)間內(nèi)完成，但仍無法避免菌株的多次反復(fù)接種，菌株的反復(fù)接種是否會發(fā)生菌種變異，是否會導(dǎo)致對藥物的敏感性不同，也是值得思考的問題。綜上，在以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，部分結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差偏大，可能和以上因素導(dǎo)致的一定誤差有關(guān)。部分結(jié)果差異明顯的，均拋棄。本實(shí)驗(yàn)過程均設(shè)有質(zhì)控菌株，所有實(shí)驗(yàn)均在控，表明以上數(shù)據(jù)是可靠的。

綜上，在體外實(shí)驗(yàn)中，黃連煎煮液、2%硝酸咪康唑溶液有明顯的抑制白念珠菌、光滑念珠菌的作用；二者對白念珠菌和光滑念珠菌的抑菌作用是普遍的，有穩(wěn)定性和有效性特點(diǎn)。2%硝酸咪康唑溶液聯(lián)用黃連煎煮液后，明顯增強(qiáng)了對2%硝酸咪康唑溶液對白念珠菌及光滑念珠菌對藥物的敏感性，同時(shí)增強(qiáng)了2%硝酸咪康唑溶液的抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于臨床治療VVC的指導(dǎo)意義重大，尤其是對于RVVC，不僅為中藥單藥外用治療VVR有效抑菌性及聯(lián)用抗真菌藥后的增效性進(jìn)一步提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，同時(shí)也為治療頑固性復(fù)發(fā)性念珠菌陰道炎的治療提供一種新的有效的靶向治療方法。隨著相關(guān)研究的深入，可望為VVC的致病機(jī)制探究提供新的切入點(diǎn)，為VVC的臨床治療提供更加有效安全的方法。

備注：該研究是作者在廣東省中醫(yī)院攻讀博士研究生期間完成。