宋靚苑 林恬逸 許靜雯 柴明良

(浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院園藝系,浙江杭州 310058)

隨著人口數(shù)量及社會(huì)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)的急劇增加,鹽堿地作為備用土地的主要資源,成為亟待開發(fā)的對(duì)象[1]。目前我國鹽堿土總面積已有9 913 萬hm2[2],主要分布在干旱及沿海地區(qū)[3]。研究表明,與物理、化學(xué)防治技術(shù)相比,從生物學(xué)角度入手,采用耐鹽綠植可對(duì)鹽堿土進(jìn)行更有效的生態(tài)修復(fù)[4]。草坪作為主要陸地生態(tài)系統(tǒng)之一,對(duì)改善生態(tài)環(huán)境起著重要作用,選取抗鹽草坪草種和采用雜交育種、誘導(dǎo)育種等生物手段提高其抗鹽能力顯得越發(fā)重要[5]。

溝葉結(jié)縷草[Zoysia matrella(L.)Merr.]是一種應(yīng)用廣泛的優(yōu)良暖季型草坪草,其結(jié)實(shí)率極低,生產(chǎn)上通過匍匐莖無性繁殖,難于采用雜交育種對(duì)其進(jìn)行遺傳改良,且其耐鹽分子作用機(jī)制尚不明確,需要通過人工誘導(dǎo)體細(xì)胞無性系變異等生物技術(shù)提高其抗逆性[6-7]。溝葉結(jié)縷草是愈傷組織及誘導(dǎo)維持異常困難的草坪草種[8]。浙江大學(xué)園林植物組織培養(yǎng)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過多年離體試驗(yàn),已成熟掌握以匍匐莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織并高效再生的技術(shù),并在耐銅、耐鹽、輻射誘變、激素調(diào)節(jié)等體細(xì)胞無性系變異的研究中取得階段性成果[9-12]。溝葉結(jié)縷草是結(jié)縷草屬最耐鹽的種類[3]。研究表明,在鹽脅迫下溝葉結(jié)縷草可通過葉片鹽腺向外分泌Na＋以減少其在體內(nèi)的積累,具備較強(qiáng)的抗鹽能力[13],是鹽堿地改良中使用的重要綠植之一。溝葉結(jié)縷草正常生長可耐受的最高土壤含鹽量為0.6%～0.8%[14],但實(shí)際鹽堿地的可溶性鹽含量為0.6%～1.0%或更高[2],所以仍然需要提高其耐鹽性以適應(yīng)在不同條件的鹽堿地上種植。目前已有關(guān)于溝葉結(jié)縷草耐鹽性的相關(guān)報(bào)道[15-16],但鮮有研究提出增強(qiáng)其耐鹽性的相關(guān)技術(shù)措施。

植物激素在植物體內(nèi)的含量雖然十分微量,但在植物的抗逆生理中起著重要作用[17]。油菜素甾醇(brassinosteroids,BRs)是近40年發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于植物體內(nèi)的甾醇類激素,其中包括60 多種植物甾醇,具有較高的生理活性,參與植物生長發(fā)育及抗逆過程[18-20]。目前,BRs 中應(yīng)用最廣泛的包括油菜素內(nèi)酯(brassinolide,BL)、高油菜素內(nèi)酯(homobrassinolide,HBL)和表油菜素內(nèi)酯(epibrassinolide,EBL)3 種[21]。其中,EBL 能通過增強(qiáng)光合效率和抗氧化酶系統(tǒng),減輕高溫對(duì)茄科植物的危害[22]；對(duì)大麥?zhǔn)┯肊BL 能有效降低黃色鐮刀菌(Fusarium culmorum)產(chǎn)生的赤霉病危害并減少谷物損失[23]。本試驗(yàn)首次以溝葉結(jié)縷草胚性愈傷組織為材料,在鹽脅迫下對(duì)其進(jìn)行不同濃度EBL 處理,旨在篩選出緩解愈傷組織鹽脅迫傷害、促進(jìn)愈傷組織生長和再生的EBL 最適濃度,為其在溝葉結(jié)縷草耐鹽育種及植株水平上提高耐鹽性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

溝葉結(jié)縷草胚性愈傷組織,是本實(shí)驗(yàn)室以幼嫩匍匐莖誘導(dǎo)的并持續(xù)繼代、離體保存10年的愈傷組織。

1.2 溝葉結(jié)縷草愈傷組織鹽脅迫濃度的篩選

以MS ＋2.0 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorphenoxyacetic acid,2,4-D)＋1.15 g·L-1脯氨酸＋40 g·L-1蔗糖＋3.0 g·L-1植物凝膠(phytagel)為基本生長培養(yǎng)基,以1/2 MS＋30 g·L-1蔗糖＋3.0 g·L-1phtyagel為基本再生培養(yǎng)基,培養(yǎng)基在高壓滅菌前用NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至5.8[12]。愈傷組織經(jīng)繼代生長2 周后,取直徑約2.5 mm 的小塊,依次接種到NaCl 濃度分別為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的生長或再生培養(yǎng)基上,每皿(瓶)接種16 小塊,每個(gè)處理5 次重復(fù)。愈傷組織生長于25±2℃下暗培養(yǎng)并記錄其初始愈傷組織直徑和鮮重；愈傷組織再生于溫度25±2℃、光強(qiáng)約12 μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng),每天光照時(shí)長12 h。4 周后觀察愈傷組織的生長情況,并記錄愈傷組織直徑和鮮重,以直徑增長率[(4 周后直徑-初始直徑)/初始直徑×100%]和鮮重增長率[(4 周后鮮重-初始鮮重)/初始鮮重×100%]作為衡量其生長狀況的標(biāo)準(zhǔn)。愈傷組織再生過程中表面會(huì)產(chǎn)生綠色瘤狀凸起,并陸續(xù)分化形成綠色小苗。培養(yǎng)13 周后觀察愈傷組織再生生長情況,統(tǒng)計(jì)外植體中的成苗數(shù)和根長≥5 mm 的數(shù)量,衡量其再生能力[24]。以上述生長和再生數(shù)據(jù)指標(biāo)綜合衡量溝葉結(jié)縷草愈傷組織的耐鹽能力及表現(xiàn)出生長受迫害的鹽濃度。

1.3 EBL 處理鹽脅迫下的愈傷組織

在NaCl 濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的基礎(chǔ)上,于每一鹽濃度下的生長和再生培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 mg·L-1的EBL(中國PERFEMIKER 公司)。愈傷組織經(jīng)繼代生長2 周后,取直徑約2.5 mm 的小塊,接種到同時(shí)添加NaCl和EBL 的生長或再生培養(yǎng)基中,每皿(瓶)接種16 小塊,每個(gè)處理設(shè)置5 次重復(fù)。愈傷組織生長和再生培養(yǎng)條件及觀察記錄方法同1.2。

1.4 鹽脅迫下加入EBL 處理后愈傷組織及再生植株葉片相關(guān)抗氧化酶活性和丙二醛含量的測定

培養(yǎng)4 周后,取不同處理下愈傷組織0.1 g,加入3 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液,于冰浴中研磨,勻漿液于4℃下12 000 r·min-1離心20 min,保留上清液。培養(yǎng)13 周后,取不同處理下再生植株葉片0.1 g(0.8%鹽濃度下因無再生植株取其愈傷組織代替),加入3 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液,于冰浴中研磨,勻漿液于4℃下12 000 r·min-1離心20 min,保留上清液。上述所得上清液作為待測酶液用于過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測定,每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)。其中,CAT 活性測定采用過氧化氫比色法[25],向待測酶液中加入反應(yīng)液(含25 mmol·L-1pH 值7.0 磷酸緩沖液、225 mmol·L-1H2O2),混勻后立即測定其在290 nm 波長處的吸光度值；SOD 活性測定采用NBT(氮藍(lán)四唑)光還原法,向待測酶液中加入反應(yīng)液(含13 mmol·L-1甲硫氨酸、63 μmol·L-1核黃素、0.1 mmol·L-1EDTA 及50 mmol·L-1pH 值7.8 磷酸緩沖液),混勻,在25℃、4 000 Lux 條件下均勻照光5 min 后使用黑布覆蓋終止反應(yīng),并立即測定其在560 nm 波長處的吸光度值；POD 活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[26],向待測酶液中加入反應(yīng)液(含25 mmol·L-1pH 值7.0 磷酸緩沖液、1%愈創(chuàng)木酚溶液及20 mmol·L-1H2O2),混勻后立刻測定其在470 nm 波長處的吸光度值；MDA 含量采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法[27],取待測酶液并加入TBA 反應(yīng)液(含0.5%硫代巴比妥酸和20%三氯醋酸),在黑暗條件下煮沸10 min(自試管出現(xiàn)小氣泡開始計(jì)時(shí))后立即進(jìn)行冰浴冷卻至析出晶體,再于4℃下12 000 r·min-1離心5 min,取上清液,測定其在532、600 和450 nm 波長處的吸光度值。吸光度采用UV-2550 型分光光度計(jì)(日本SHIMADZU 公司)測定,根據(jù)所測數(shù)據(jù)計(jì)算各指標(biāo)的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 分析軟件,并應(yīng)用LSD、Duncan 多重比較法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽濃度對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長和再生的影響

不同鹽濃度對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織的生長和再生影響顯著。隨著鹽濃度的增加,溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長和再生能力均先升高后降低(圖1)。當(dāng)NaCl 濃度為0.2%時(shí),溝葉結(jié)縷草愈傷組織的直徑增長率達(dá)到最大值；當(dāng)NaCl 濃度為0.4%時(shí),溝葉結(jié)縷草鮮重增長率達(dá)到最大值。當(dāng)NaCl 濃度為0.2%時(shí),溝葉結(jié)縷草外植體中根長≥5mm 數(shù)及成苗數(shù)均達(dá)到最大值；隨著鹽濃度的增加,溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生能力呈明顯下降趨勢,當(dāng)NaCl 濃度為0.8%時(shí),無再生植株。即溝葉結(jié)縷草愈傷組織在低鹽脅迫下可正常生長和再生,而隨著鹽濃度的增加,其生長和再生受到明顯抑制。

圖1 不同鹽濃度下溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長和再生狀況Fig.1 Growth and regeneration of callus of Zoysia matrella under different salt concentrations

2.2 EBL 處理對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織耐鹽性的影響

2.2.1 鹽脅迫下EBL 對(duì)愈傷組織生長和再生的影響

添加EBL 后愈傷組織的耐鹽能力顯著加強(qiáng)。當(dāng)NaCl 濃度≥0.6%時(shí),溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長出現(xiàn)受抑制現(xiàn)象(圖1-A),而添加EBL 后,隨著EBL 濃度的增加,愈傷組織生長的直徑增長率和鮮重增長率先升高后降低(圖2-A)。當(dāng)EBL 濃度為0.05 mg·L-1時(shí),溝葉結(jié)縷草愈傷組織直徑增長率達(dá)到最大值(147.37%),為對(duì)照(0 mg·L-1EBL)的1.54 倍,且差異顯著；此時(shí),愈傷組織鮮重增長率也達(dá)到最大值(238.10%),為對(duì)照的1.26 倍,差異也顯著。

當(dāng)NaCl 濃度≥0.4%時(shí),溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生出現(xiàn)受抑制現(xiàn)象(圖1-B),而添加EBL 后,隨著EBL 濃度的增加,愈傷組織再生植株根長≥5 mm 數(shù)及成苗數(shù)先升高后降低(圖2-B)。當(dāng)EBL 濃度為0.02 mg·L-1時(shí),根長≥5mm 的愈傷塊數(shù)達(dá)到最大值(4塊),為對(duì)照(0 mg·L-1EBL)的1.20 倍,且差異顯著,成苗數(shù)也達(dá)到最大值(4.6 塊),為對(duì)照的1.38 倍,差異也顯著。

鹽脅迫下,當(dāng)EBL 濃度分別≥0.05 mg·L-1和≥0.10 mg·L-1時(shí),與對(duì)照相比,溝葉結(jié)縷草愈傷組織的生長和再生分別受到抑制,這可能是因?yàn)檩^高濃度的EBL 會(huì)對(duì)其生長產(chǎn)生抑制作用。綜上,添加適當(dāng)濃度的EBL 可顯著提高溝葉結(jié)縷草愈傷組織及再生植株的耐鹽能力。

2.2.2 鹽脅迫下EBL 對(duì)愈傷組織和再生植株葉片CAT、POD、SOD 活性及MDA 含量的影響 加入不同濃度EBL 會(huì)對(duì)鹽脅迫下溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長的生理活性起到顯著影響(圖3),其中CAT、POD、SOD活性隨著EBL 濃度的增加呈先升高后降低的趨勢,MDA 含量則呈先降低后升高的趨勢。當(dāng)EBL 濃度為0.05 mg·L-1時(shí),不同NaCl 濃度處理下的愈傷組織CAT、POD、SOD 活性在顯著水平上基本達(dá)到最大值,而MDA 含量降至最低值。其中,在0.6%NaCl 濃度下,與對(duì)照(0 mg·L-1EBL)相比,0.05 mg·L-1EBL 處理后愈傷組織的CAT、POD、SOD 活性分別增加了4.46%、24.07%、18.84%,而 MDA含量減少了48.29%；當(dāng)EBL 濃度≥0.1 mg·L-1時(shí),愈傷組織的CAT、POD、SOD 活性呈下降趨勢,MDA 含量則呈現(xiàn)上升趨勢,可能因?yàn)楦邼舛菶BL 對(duì)保護(hù)酶活性起到了抑制作用,膜脂過氧化反應(yīng)加劇。綜上,適當(dāng)濃度EBL處理可顯著提高保護(hù)酶活性,有效緩解植物細(xì)胞所受鹽迫害。

再生植株葉片中的保護(hù)酶活性和MDA 含量變化趨勢與愈傷組織基本相同(圖4),即CAT、POD、SOD活性隨著EBL 濃度的增加呈先升高后降低的趨勢,MDA 含量呈先降低后升高的趨勢,但當(dāng)EBL 濃度為0.02 mg·L-1時(shí),不同NaCl 濃度處理下再生植株葉片中CAT、POD、SOD 活性在顯著水平上基本達(dá)到最大值,MDA 含量則降低至最小值。與上述生理變化相對(duì)應(yīng)的,當(dāng)EBL 濃度小于0.02 mg·L-1時(shí),再生植株長勢隨EBL 濃度的增加而增加(圖5-A、B)；當(dāng)EBL 濃度為0.02 mg·L-1時(shí)生長狀態(tài)最佳(圖5-C)；當(dāng)EBL 濃度大于0.02 mg·L-1時(shí),再生植株長勢隨EBL 濃度的增加逐漸下降(圖5-D、E、F)。

圖2 0.6%NaCl脅迫下不同濃度EBL 處理后愈傷組織生長和再生狀況Fig.2 Growth and regeneration of callus treated with different concentrations of EBL under 0.6%NaCl stress

圖3 NaCl脅迫下不同濃度EBL 處理后愈傷組織生理特性Fig.3 Physiological characteristics of callus treated with different concentrations of EBL under NaCl stress

3 討論

3.1 鹽脅迫對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長和再生的影響

本試驗(yàn)中,當(dāng)NaCl 濃度為0.2%時(shí),溝葉結(jié)縷草愈傷組織的生長和再生均高于對(duì)照(0%NaCl),表明其具備一定的抗鹽能力,這與周興元等[14]的研究結(jié)果一致,可能是因?yàn)閷?duì)耐鹽植物而言,NaCl 為其生長所需物質(zhì),少量的鹽可以促進(jìn)其生長[28]。當(dāng)NaCl 濃度≥0.6%時(shí),溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長受到抑制；當(dāng)NaCl濃度≥0.4%時(shí),愈傷組織再生受到抑制,這與周興元等[14]的研究結(jié)果不同,可能與離體組織和田間植株在生理特性上的差異有關(guān)。

圖4 NaCl脅迫下不同濃度EBL 處理后愈傷組織再生植株葉片的生理特性Fig.4 Physiological characteristics of leaves from the regenerated plantlets with different concentrations of EBL under NaCl stress

圖5 0.2%NaCl脅迫下不同濃度EBL 處理后愈傷組織再生植株?duì)顩rFig.5 Regenerated plantlets treated with different concentrations of EBL under 0.2%NaCl stress

3.2 EBL 處理對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織耐鹽性的影響

3.2.1 鹽脅迫下EBL 對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長及再生的影響 BRs 提高植物抗病抗逆能力的機(jī)理已有報(bào)道[29]。在植物體內(nèi),BRs 參與激活抗病基因和光合途徑基因的表達(dá)、增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)等[30],其中,與泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑中的UBC32 蛋白相互作用,可有效提高植物的耐鹽性[31]。研究表明,外施EBL 能顯著減緩銅脅迫對(duì)番茄的傷害[30],施用BRs 后可有效減緩鹽脅迫對(duì)葉用萵苣造成的生長受損[31]。本試驗(yàn)中,在鹽脅迫下加入EBL 對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長及再生均有顯著的促進(jìn)作用,且不同濃度EBL 對(duì)其生長的作用效果不同,這與唐鑫華等[32]的研究結(jié)果一致。

3.2.2 鹽脅迫下EBL 對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織及再生植株葉片中CAT、POD、SOD 活性的影響 植物在逆境條件下通常伴隨大量活性氧的產(chǎn)生,如果不能及時(shí)清除會(huì)使得細(xì)胞膜及一些大分子物質(zhì)遭到破壞,從而影響植物的生長[33]。CAT、POD 和SOD 等保護(hù)酶在感知鹽脅迫時(shí)會(huì)提高活性,從而加快對(duì)活性氧的清除,具有維持活性氧代謝平衡、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的功能[34-35]。研究表明,BRs 可以增強(qiáng)逆境下防御基因,如加強(qiáng)POD、SOD 等酶的合成或調(diào)解特定基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯進(jìn)一步激活保護(hù)酶系統(tǒng)[36]。本試驗(yàn)中,在鹽脅迫下加入EBL 可顯著提升溝葉結(jié)縷草愈傷組織及再生植株CAT、POD、SOD 活性,與上述BRs 的相關(guān)研究結(jié)果一致,證實(shí)EBL 對(duì)溝葉結(jié)縷草耐鹽生理機(jī)制具有促進(jìn)作用。

3.2.3 EBL 對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織繼代及再生植株葉片中MDA 含量的影響 當(dāng)植物器官處于逆境條件時(shí),通常會(huì)發(fā)生膜脂過氧化作用,MDA 為其產(chǎn)物之一。MDA 含量可以表示細(xì)胞膜脂過氧化程度,即植物受逆境作用傷害程度[37]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫下加入EBL 可顯著降低愈傷組織及再生植株中的MDA 含量,這與康云艷等[38]施用BRs 后測得植物MDA 含量下降相一致,即EBL 可以顯著緩解鹽脅迫下溝葉結(jié)縷草愈傷組織及再生植株細(xì)胞膜的受害程度。本研究結(jié)果表明,鹽脅迫條件下,0.05、0.02 mg·L-1EBL 處理可有效提高溝葉結(jié)縷草愈傷組織繼代和再生的抗鹽性,而當(dāng)EBL 濃度增加到一定值時(shí),會(huì)出現(xiàn)降低耐鹽性的反作用,其原因可能是EBL 濃度超過閾值,對(duì)植物生長表現(xiàn)出抑制作用[39]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,溝葉結(jié)縷草愈傷組織可在低鹽濃度下正常生長和再生。鹽脅迫下添加適當(dāng)濃度EBL后,溝葉結(jié)縷草愈傷組織的CAT、POD 和SOD 活性顯著升高,MDA 含量顯著下降,同時(shí)愈傷組織和再生植株的生長也得到明顯改善,證明EBL 可有效提升溝葉結(jié)縷草愈傷組織及再生植株的耐鹽能力。本研究表明,EBL 處理結(jié)合離體篩選在溝葉結(jié)縷草耐鹽育種方面具有可行性,同時(shí)也為EBL 提高溝葉結(jié)縷草植株水平耐鹽性的研究提供了猜想和借鑒。