章 麗 龔一富 朱帥旗 劉 浩 李申睿 謝志浩 王何瑜

(寧波大學海洋學院,浙江 寧波 315800)

巖藻黃質(zhì)(fucoxanthin)是一類主要存在于褐藻、硅藻中的脂溶性天然類胡蘿卜素,占類胡蘿卜素總量的10%以上[1]。該色素與幾種蛋白質(zhì)以及葉綠素a結合,在類囊體中形成巖藻黃質(zhì)-葉綠素a/c-蛋白復合體(fucoxanthin chlorophyll a/c protein,FCP),可通過葉綠素a 將激發(fā)能傳遞到光合電子傳遞鏈,具有光捕獲和光保護能力[2]。巖藻黃質(zhì)具有一個丙二烯鍵、一個共軛羰基以及一個5,6-環(huán)氧化物特殊結構[3],這些結構賦予巖藻黃質(zhì)多種生物活性,包括抗肥胖、抗糖尿病[4]和抗腫瘤活性[5-9]。其中巖藻黃質(zhì)的多烯發(fā)色團的類胡蘿卜素端是抗肥胖作用的關鍵結構,它含有一個烯鍵和兩個羥基,能夠調(diào)節(jié)腹腔白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)線粒體產(chǎn)生解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1),促進脂肪酸的氧化以及WAT 的產(chǎn)熱；巖藻黃質(zhì)還能通過調(diào)節(jié)WAT 分泌的細胞因子來改善胰島素抵抗以及降低血糖水平[10]。在抗腫瘤方面,巖藻黃質(zhì)在膠質(zhì)瘤[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]、結腸癌[8]和大腸癌[9]等多種癌癥中具有抗增殖作用。Yu 等[11]發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)能夠調(diào)控胃癌細胞(MGC-803細胞)周期停滯在G2/M 期,同時通過降低酪氨酸激酶/轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)通路中CyclinB1 基因的表達,抑制MGC-803 細胞的增殖。此外,研究表明巖藻黃質(zhì)可誘導Hela 細胞凋亡,并能通過提高人宮頸SIHA 細胞對腫瘤壞死因子(TNF)相關的凋亡誘導配體(TNFrelated apoptosis-inducing ligand,TRAIL)敏感性,選擇性誘導腫瘤細胞凋亡[12-13],因此巖藻黃質(zhì)與TRAIL 聯(lián)合預防或治療宮頸癌具有很大潛力。

巖藻黃質(zhì)具有潛在保健、抗癌功能,且可進行微藻培養(yǎng),因此對微藻的巖藻黃質(zhì)合成調(diào)控研究具有重要意義。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutumBohlin)作為主要產(chǎn)巖藻黃質(zhì)的微藻之一,已報道可通過培養(yǎng)條件、營養(yǎng)成分的改變或誘導子來提高巖藻黃質(zhì)含量。如Kosakowska 等[14]發(fā)現(xiàn)三角褐指藻在缺鐵的培養(yǎng)條件下,巖藻黃質(zhì)含量降低,而在氮源充足的條件下,三角褐指藻的巖藻黃質(zhì)含量提高[15]；張南南等[16]利用高光處理三角褐指藻6 h 后,巖藻黃質(zhì)含量較對照組提高近1 倍；朱帥旗等[17]發(fā)現(xiàn)低濃度硫酸鈰(0.2～0.4 mg·L-1)能提高三角褐指藻巖藻黃質(zhì)含量。水楊酸(salicylic acid,SA)是植物發(fā)育以及脅迫耐受性相關信號傳遞的酚類物質(zhì),作為植物內(nèi)源性誘導子參與并調(diào)節(jié)植物重要的生理生化活動；而SA 對三角褐指藻巖藻黃質(zhì)合成影響的相關研究尚鮮見報道。本研究通過向?qū)?shù)期三角褐指藻中添加一定濃度乙酰水楊酸(acetylsalicylic acid,ASA),并對誘導過程中的三角褐指藻的生長、巖藻黃質(zhì)含量及相關合成基因表達水平進行檢測,以期為三角褐指藻巖藻黃質(zhì)的研究和利用提供一定的理論依據(jù)和技術指導。

1 材料與方法

1.1 三角褐指藻的培養(yǎng)

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutumBohlin)由寧波大學海洋生物工程重點實驗室藻種室提供。經(jīng)過f/2 固體培養(yǎng)基培養(yǎng),挑斑純化擴大培養(yǎng),以1×105cells·mL-1初始濃度接種到f/2 液體培養(yǎng)基中,置于20℃、62.5 μmol photons·m-2·s-1、12 h/12 h(黑光暗)條件下培養(yǎng)。

1.2 ASA 處理

待三角褐指藻生長至對數(shù)期(1×106cells·mL-1),采用0(CK)、10、25、50、100 mg·L-1的ASA 對其進行處理,每個處理設3 組平行。

1.3 三角褐指藻生長曲線測定

取1 mL 對數(shù)期藻液,通過6800 型雙光束紫外可見分光光度計(英國bibby 科技有限公司)進行全波段掃描,確定藻液最大吸收峰波長。將藻液稀釋成濃度梯度,測定最大吸收峰的OD 值,同時用XB-K-25 型血球計數(shù)板(玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠)計算相應濃度的藻細胞密度。通過OD 值和藻細胞密度建立光密度回歸方程。以加入ASA 為初始時間,處理持續(xù)到第8天,期間每隔24 h 取1 mL 三角褐指藻溶液并測定OD680值,每組均設3 個平行。根據(jù)光密度回歸方程,繪制三角褐指藻的生長曲線。

1.4 巖藻黃質(zhì)的提取

培養(yǎng)第6 天收集三角褐指藻細胞,參考Kim 等[3]的方法提取三角褐指藻的巖藻黃質(zhì),4℃、52 000×g離心10 min 收集藻體,冷凍干燥并研磨后加入無水乙醇重懸,然后靜置1 h,4℃、52 000×g離心10 min 后取上清液過一次性針頭式濾器(0.22 μm,Millipore),得高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測液,備用。

1.5 巖藻黃質(zhì)含量的測定

精確稱取0.1 mg 巖藻黃質(zhì)標準品溶于1 mL 無水乙醇,依次稀釋成不同濃度的標準品。色譜系統(tǒng)為Aliance e2695 separations module HPLC 系統(tǒng)(Waters,美國),Waters 2998 二極管陣列檢測器。洗脫程序：先用甲醇/水(9∶1,v/v)洗脫30 min,再用100%甲醇洗脫10 min,最后用甲醇/水(9∶1,v/v)洗脫15 min。進樣量10 μL,檢測波長445 nm。通過巖藻黃質(zhì)標準品積分峰面積與濃度作回歸曲線,根據(jù)色譜圖中的色譜峰保留時間以及相應強度,計算樣品中巖藻黃質(zhì)含量。

1.6 巖藻黃質(zhì)生物合成相關基因的表達分析

收集不同濃度ASA 處理24 h 后的藻液,采用試劑盒(Plant RNA Kit,美國OMEGA-Bio-Tek 公司)提取RNA,PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa,大連)進行反轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)(TaKaRa,大連)進行熒光定量PCR 檢測,目的基因[17-19]和參照基因[20](表1)采用同一擴增程序,應用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。

表1 定量PCR 引物序列Table 1 The primer sequences of quantity PCR

1.7 巖藻黃質(zhì)含量的主成分分析

以不同濃度ASA 處理下PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LYCB和ZEP基因表達量和巖藻黃質(zhì)含量作為數(shù)據(jù)集,利用SAS 9.0 統(tǒng)計軟件進行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2012 進行數(shù)據(jù)處理,SPSS 19.0 進行單因素方差分析,LSD 法進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 ASA 對三角褐指藻細胞生長的影響

對數(shù)期的三角褐指藻最大吸收峰的波長為680 nm,對數(shù)期的三角褐指藻密度與OD680呈良好的線性關系,回歸方程為y＝0.009 5x- 0.000 5(y為OD680值,x為1 mL 藻液的細胞密度,R2＝0.996 2)。由圖1可知,各試驗組三角褐指藻生長曲線趨勢相似,培養(yǎng)第1～第6 天維持高速生長,且在培養(yǎng)第6 天時出現(xiàn)一個生長高峰,培養(yǎng)第7 天時藻細胞數(shù)量急劇下降。與CK 不同的是,不同濃度ASA 處理的三角褐指藻在培養(yǎng)第2 天時生長速度下降,培養(yǎng)第3 天又出現(xiàn)較大程度的增長。總體上,ASA 各處理組的三角褐指藻藻細胞數(shù)量始終低于CK,表明ASA 抑制了三角褐指藻的生長。

圖1 ASA 對三角褐指藻細胞生長的影響Fig.1 Effect of ASA on the growth of Phaeodactylum tricornutum cell

2.2 ASA 對三角褐指藻巖藻黃質(zhì)含量的影響

根據(jù)HPLC 檢測發(fā)現(xiàn),標準品和樣品的出峰時間均為13.5 min(圖2)。以巖藻黃質(zhì)濃度與HPLC 峰面積作回歸方程為y＝0.107 4x＋0.013 8(y為積峰面積,x為巖藻黃質(zhì)標準品不同濃度,R2＝0.999 9)。根據(jù)回歸方程得出的巖藻黃質(zhì)含量(圖3),結果顯示,三角褐指藻巖藻黃質(zhì)含量對不同濃度的ASA 均有一定程度的響應。與CK 相比,10、25、50 mg·L-1ASA 處理組中三角褐指藻巖藻黃質(zhì)含量分別極顯著提高了91%、77%、30%(P＜0.01),但100 mg·L-1ASA 處理組中巖藻黃質(zhì)含量略低于CK。

圖2 445 nm 光譜下巖藻黃素的HPLC 圖Fig.2 HPLC diagram of fucoxanthin in Phaeodactylum tricornutum under spectrum of 445 nm

2.3 ASA 對三角褐指藻巖藻黃質(zhì)生物合成相關基因表達的影響

比較不同濃度ASA 對三角褐指藻巖藻黃質(zhì)合成相關基因表達的影響,結果如圖4所示。隨著ASA 濃度的增加,PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LYCB和ZEP基因的相對表達量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,其中10 mg·L-1ASA 處理組的6 個基因表達量均最高,且極顯著高于CK(P＜0.01)；25 mg·L-1ASA 處理組,6 個基因的表達也得到顯著或極顯著上調(diào)。當ASA 濃度上升到100 mg·L-1時,大部分目的基因的表達仍然上調(diào),但上調(diào)趨勢漸緩。這可能是因為,低濃度ASA 誘導藻細胞產(chǎn)生信號分子,調(diào)控巖藻黃質(zhì)途徑基因的表達,但隨著ASA 濃度的增加,造成了藻細胞膜系統(tǒng)和功能受損,導致基因調(diào)控作用減弱。

圖3 不同濃度ASA 處理下三角褐指藻中巖藻黃質(zhì)含量的變化Fig.3 Variation of the content of fucoxanthin in Phaeodactylum tricornutum treated with different concentrations of ASA

2.4 三角褐指藻巖藻黃質(zhì)生物合成相關基因的主成分分析

利用熒光定量所檢測到的與巖藻黃質(zhì)相關的5 個基因表達數(shù)據(jù),結合5 種不同濃度ASA 處理下巖藻黃質(zhì)的含量,構成原始數(shù)據(jù)集,進行主成分分析,得到了主元向量中5 個主成分特征值的貢獻率(表2),其中,第一主成分(PC1)貢獻率(90.05%)和第二主成分(PC2)累計貢獻率(97.07%)超過85%,以第一主成分和第二主成分作圖(圖5)。結果表明,變量(PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LCYB和ZEP)與巖藻黃素含量存在正相關關系,其中,ZEP基因?qū)θ呛种冈逯袔r藻黃素含量的貢獻最高。

表2 6 個主成分的貢獻率和累積貢獻率Table 2 The Proportion and cumulative proportion of six principal components

3 討論

巖藻黃質(zhì)在抗氧化、抗肥胖[4]和抗癌[5-9]的治療中有重要的作用,三角褐指藻作為具有豐富巖藻黃質(zhì)的單細胞藻,其生長速率以及巖藻黃質(zhì)含量均優(yōu)于大型藻,如海帶(Laminaria japonica)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)等,目前已經(jīng)對其進行商業(yè)規(guī)模化養(yǎng)殖[21]。SA 是植物抗逆的關鍵激素,其結構類似物ASA 的誘導作用也得到了證實。目前國內(nèi)外已有學者報道了SA 對微藻生長的影響,Czerpak 等[22]研究結果表明,10-6、10-5、10-4mol·L-1SA 可促進小球藻的生長。而在微擬球藻和水華魚腥藻中,SA 對其生長影響呈現(xiàn)低促高抑的現(xiàn)象[23-24]。SA 在2.5～40 mg·L-1以及40～120 mg·L-1濃度范圍內(nèi)分別對三角褐指藻和銅綠微囊藻有抑制作用,且抑制作用與濃度呈正相關[23,25]。由于藻類之間的差異,SA 對微藻生長的影響沒有統(tǒng)一的規(guī)律,但外源SA 作為酚酸類化感物質(zhì)之一,可通過不同途徑來影響植物和藻類的生長,除了造成質(zhì)膜過氧化,最常見的是阻礙葉綠素合成,從而影響植物光合作用[26-27]。在高等植物中,葉面施用SA后,大麥和黑吉豆葉片的葉綠素含量均降低[28-29]。Moharekar 等[30]用不同濃度SA 處理小麥后,其葉綠素a/b 值隨著SA 濃度的升高而下降,由此推測SA 改變了捕光天線的尺寸。在微藻中,張誠鵬等[23]發(fā)現(xiàn)外源ASA 抑制了三角褐指藻光合效率。胡利靜等[25]發(fā)現(xiàn)SA 抑制了銅綠微囊藻葉綠素a 的合成,且高濃度的水楊酸(0.12 g·L-1)對葉綠素a 的降解作用更明顯。本試驗結果也表明,ASA 處理的三角褐指藻細胞數(shù)量低于對照組,10～40 mg·L-1ASA 抑制了三角褐指藻的生長。因此推測,ASA 能抑制三角褐指藻葉綠素a 的合成,影響光合作用,抑制藻細胞的生長。

圖4 不同濃度ASA 處理下三角褐指藻種各基因轉(zhuǎn)錄差異Fig.4 Transcriptional levels induced by different concentrations of ASA in Phaeodactylum tricornutum

大量研究表明,外源SA 能夠誘導高等植物和微藻中類胡蘿卜素等次級代謝產(chǎn)物的積累。Moharekar等[30]用不同濃度的SA 處理小麥和芒苗種子后,發(fā)現(xiàn)兩種植物中類胡蘿卜素的含量、葉黃素庫大小以及脫環(huán)氧化速率均顯著增加。Vidhyavathi 等[31]用SA 處理雨生紅球藻,在低光條件下,10、50 和100 μmol·L-1的SA 能促進蝦青素和β-胡蘿卜素的合成。SA 處理不僅能促進天然類胡蘿卜素的積累,還能增強抗氧化酶的活性,進而提高植物的抗逆性。Hu 等[32]發(fā)現(xiàn),ASA能顯著增加番茄葉片的多酚氧化酶和過氧化物酶的活性；經(jīng)過SA 和ASA 處理后的甜櫻桃,其抗氧化物濃度和抗氧化酶活性提高[33]。張穎等[34]用外源SA 處理蘋果,發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶(catalase,CAT)、多酚氧化酶(polyphenol,PPO)、過氧化物酶(peroridase,POD)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)活性顯著提高。以上抗氧化酶都是植物防止膜脂過氧化、維持細胞膜正常代謝的重要酶。本研究中,巖藻黃質(zhì)的含量隨著ASA 濃度的增加呈先上升后下降的趨勢,在10 mg·L-1ASA 下巖藻黃質(zhì)含量最高(P＜0.01),100 mg·L-1ASA 對三角褐指藻巖藻黃質(zhì)含量的影響不顯著(P＞0.05)。推測10 mg·L-1ASA 作為誘導子,通過影響藻巖藻黃質(zhì)合成途徑中相應基因表達,對巖藻黃質(zhì)的合成進行調(diào)控,進一步減輕膜脂過氧化。100 mg·L-1ASA 可能對藻細胞產(chǎn)生氧化脅迫,加劇膜質(zhì)過氧化,導致藻細胞數(shù)量減少甚至巖藻黃質(zhì)含量降低。

本研究中6 個巖藻黃質(zhì)含量合成相關酶表達水平與巖藻黃質(zhì)含量存在相關性,其中ZEP對巖藻黃質(zhì)合成貢獻度最大。張南南等[35]采用高光處理三角褐指藻6 h 后,ZEP1 和PSY表達量相對于對照組提高近2倍,巖藻黃素含量提高了2.16 倍,ZEP1 可能是編碼巖藻黃素合成途徑中的限速酶。本研究中,主成分分析也得出ZEP基因?qū)r藻黃質(zhì)合成貢獻度最高。ASA對三角褐指藻巖藻黃質(zhì)合成的促進作用,表現(xiàn)在合成途徑關鍵酶基因表達水平和巖藻黃質(zhì)含量上,其作用機理還需進一步研究。

目前,在巖藻黃質(zhì)的生物合成途徑中,紫黃素到巖藻黃質(zhì)的合成,仍然存在假說和分歧的觀點,一種是由Wilhelm 和Christian 提出紫黃質(zhì)通過硅甲藻黃素轉(zhuǎn)化成巖藻黃質(zhì)[36],而另外一種推斷是新葉黃質(zhì)先后經(jīng)過酮醇化和乙?；瘍刹叫揎?最終轉(zhuǎn)化為巖藻黃質(zhì)[37]。本研究通過ASA 處理三角褐指藻,從生長、含量以及分子方面對其進行了探究,為巖藻黃質(zhì)的生產(chǎn)實踐提供了基礎。

圖5 巖藻黃質(zhì)生物合成通路中的基因與其含量的主成分分析Fig.5 The principal component analysis between the contents of fucoxanthin and gene involved in pathway of fucoxanthin biosynthesis

4 結論

本研究探究了不同濃度ASA 誘導對三角褐指藻生長和巖藻黃質(zhì)合成的影響,結果顯示,ASA 處理抑制了對數(shù)期三角褐指藻的生長,但10 mg·L-1ASA 對三角褐指藻巖藻黃質(zhì)合成途徑相關酶基因的表達具有促進作用,且10 mg·L-1處理組三角褐指藻中巖藻黃質(zhì)含量顯著高于對照組,表明ASA 可能通過影響三角褐指藻巖藻黃素合成的基因的表達從而調(diào)控巖藻黃質(zhì)的合成。本試驗為進一步研究外源誘導子對三角褐指藻的巖藻黃質(zhì)積累及分子機理奠定了一定的理論基礎。