雷 瓊，劉穎沙，李國(guó)秀

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

獼猴桃具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的藥用價(jià)值，其維生素C的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)柑橘、蘋果和梨，有VC之王的美稱[1]。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，我國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種植規(guī)模逐年增加，獼猴桃產(chǎn)量也隨之增加，獼猴桃采后在貯藏期出現(xiàn)的軟腐病問(wèn)題也日益突出[2]。在陜西、四川、貴州和江西等省獼猴桃主要生產(chǎn)區(qū)，獼猴桃軟腐病發(fā)生普遍，平均發(fā)病率達(dá)20%～50%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。段愛(ài)莉等[4]對(duì)陜西周至主栽獼猴桃品種貯藏期霉?fàn)€果實(shí)病原菌分離鑒定發(fā)現(xiàn)，其病原菌主要為青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、交鏈孢霉屬(Alternaria)、毛霉屬(Mucor)和擬青霉屬(Simplicillium)，其中青霉屬為優(yōu)勢(shì)菌。不同的研究報(bào)道顯示，青霉病的病原菌種類不同，且優(yōu)勢(shì)種類存在一定地域差異，對(duì)于青霉引起的腐爛病，其研究集中在室內(nèi)藥劑篩選和田間藥效防治方面[3，5-6]。目前，關(guān)于獼猴桃貯藏期由青霉引起的腐爛病的藥效驗(yàn)證及安全性檢測(cè)尚未有研究報(bào)道。青霉屬于真菌，真菌引起的獼猴桃采后及貯藏期病害的防治目前主要采用化學(xué)方法，但長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑一方面會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗性，另一方面化學(xué)殘留也威脅人類健康。隨著人們對(duì)食品安全和品質(zhì)要求的提高，化學(xué)殺菌劑的使用也受到了限制[7]。粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)作為一種生物防治的拮抗菌，具有拮抗效果好，不產(chǎn)生毒素，可以和化學(xué)殺菌劑共同使用等特點(diǎn)，對(duì)梨、蘋果、桃及草莓等水果在采后貯藏期青霉菌引起的腐爛病具有明顯的防治效果[8]。陜西楊凌獼猴桃采后貯藏期的腐爛病主要由青霉菌引起，為研究粘紅酵母對(duì)獼猴桃青霉菌的控制效果，進(jìn)行粘紅酵母對(duì)獼猴桃青霉菌的體外抑菌試驗(yàn)和果實(shí)接種試驗(yàn)，以期對(duì)陜西獼猴桃采后貯藏和保鮮提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 獼猴桃果實(shí) 以正常成熟的獼猴桃果實(shí)為試驗(yàn)對(duì)象，品種為海沃德，購(gòu)自陜西楊凌五泉鎮(zhèn)獼猴桃基地。選擇無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)蟲(chóng)傷、健康的獼猴桃果實(shí)，其大小、成熟度等外觀基本一致，分組待用。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)由楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供；擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)從腐爛的獼猴桃果實(shí)分離獲得，由楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 數(shù)顯恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F160)，臺(tái)式離心機(jī)(L550)，千分之一電子天平(AX223ZH/E)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GHP-9160N)，高壓滅菌鍋(上海申安LDZX-30KBS)，移液器(100 μL)、血球計(jì)數(shù)板(25×16)，光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯CX23)。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌制備 在 250 mL的三角瓶中裝入 50 mL的120Brix麥芽汁培養(yǎng)基，滅菌、接種，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，3 000 r/min離心10 min收集菌體。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整其濃度，制成相應(yīng)濃度的處理液。

1.2.2 病原菌孢子懸浮液制備 病原菌在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d后，刮取適量孢子，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌生理鹽水中，采用血球記數(shù)板計(jì)數(shù)，將其孢子濃度調(diào)至5×104個(gè)/mL。

1.2.3 粘紅酵母處理液制備 培養(yǎng)原液，將在麥芽汁培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)20 h的粘紅酵母培養(yǎng)液，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整其濃度為108CFU/mL；菌懸液，將上述培養(yǎng)原液離心后收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水制成的菌懸液，其濃度為108CFU/mL；濾液為離心后的上清液。

1.2.4 粘紅酵母對(duì)青霉菌的體外抑菌試驗(yàn) 取108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL和105CFU/mL粘紅酵母菌懸液、培養(yǎng)原液(108CFU/mL)、濾液(108CFU/mL)和無(wú)菌水各0.l mL，分別加至裝有5 mL PDB的無(wú)菌試管內(nèi)，向各試管加入0.l mL濃度為5×104個(gè)/mL青霉菌孢子懸浮液。試驗(yàn)共7個(gè)處理，2次重復(fù)。將所有試管置于28℃的振蕩培養(yǎng)搖床，80 min/r培養(yǎng)12 h，用普通光學(xué)顯微鏡和血球計(jì)數(shù)板分別測(cè)量各處理中青霉菌的孢子萌發(fā)率和芽管伸長(zhǎng)長(zhǎng)度。

1.2.5 不同處理粘紅酵母對(duì)青霉菌接種抑菌試驗(yàn) 用70%酒精將獼猴桃果實(shí)浸泡40～50 s，無(wú)菌水沖洗果實(shí)2～3次，無(wú)菌濾紙吸干果實(shí)表面水分。用直徑9 mm的無(wú)菌打孔器在每個(gè)果實(shí)表面赤道部位對(duì)稱打2個(gè)孔，深度為3 mm。每孔加入30 μL粘紅酵母不同處理液(108CFU/mL培養(yǎng)原液，108CFU/mL菌懸液，108CFU/mL濾液，無(wú)菌水CK)，4 h后再在每孔口處加入15 μL青霉菌孢子懸浮液。用保鮮膜密封孔口，然后將所有果實(shí)置于保鮮盒中，在室溫條件(20℃)貯藏5 d。試驗(yàn)共4個(gè)處理，每處理選擇5個(gè)果實(shí)，2次重復(fù)。5 d后取出果實(shí)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量果實(shí)的病斑直徑，計(jì)算發(fā)病率。

1.2.6 不同濃度粘紅酵母菌懸液對(duì)青霉菌接種抑菌試驗(yàn) 將粘紅酵母的菌懸液的濃度分別調(diào)整為109CFU/mL、108CFU/mL和107CFU/mL、106CFU/mL，以無(wú)菌水作為對(duì)照，按照1.2.5的方法接種獼猴桃，考察不同濃度粘紅酵母菌懸液處理獼猴桃果實(shí)的病斑直徑和發(fā)病率。試驗(yàn)共5個(gè)處理，每處理選擇5個(gè)果實(shí)，2次重復(fù)。5 d后取出果實(shí)，測(cè)量果實(shí)病斑直徑，計(jì)算發(fā)病率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 粘紅酵母不同處理對(duì)青霉菌孢子萌發(fā)的抑制效果

從表1看出，粘紅酵母菌菌懸液在低濃度(105CFU/mL)時(shí)，對(duì)青霉菌孢子具有抑制作用，孢子萌發(fā)率為30%。當(dāng)粘紅酵母菌懸液和培養(yǎng)液的濃度均為108CFU/mL，青霉菌孢子的萌發(fā)很低，分別為3%和5%，顯著低于濾液和對(duì)照；芽管的伸長(zhǎng)長(zhǎng)度也明顯低于濾液和對(duì)照。表明，粘紅酵母菌懸液和培養(yǎng)液均能在一定程度抑制青霉菌孢子的萌發(fā)，隨著粘紅酵母菌懸液濃度增大，孢子萌發(fā)率和芽管伸長(zhǎng)長(zhǎng)度均明顯降低；濾液和無(wú)菌水對(duì)青霉菌孢子均無(wú)抑制作用，芽管生長(zhǎng)良好。

表1 粘紅酵母不同處理對(duì)青霉菌孢子萌發(fā)的體外抑制效果

Table 1 In vitro inhibition effect ofR.glutiniswith different concentration on spore germination ofPenicillium

處理Treatment孢子萌發(fā)率/%Spore germination rate芽管長(zhǎng)度/μmGerm tube length粘紅酵母菌懸液 105CFU/mL 30.0 b23.3 c 105 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 106 CFU/mL 10.0 c16.4 c 106 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 107 CFU/mL 11.0 c9.3 c 107 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 108 CFU/mL 3.0 c8.4 c 108 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母培養(yǎng)液 108 CFU/mL5.0 c30.3 b 108 CFU/mL R. glutinis solution粘紅酵母濾液(108 CFU/mL)100.0 a50.8 b 108 CFU/mL R. glutinis filtrate無(wú)菌水(CK) Sterile water100.0 a65.0 a

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.05.

2.2 粘紅酵母不同處理對(duì)青霉菌的接種抑菌效果

病原微生物主要以果實(shí)表面的傷口侵入，引起果實(shí)采后貯存期腐爛變質(zhì)。有研究表明[9-10]，當(dāng)果實(shí)表面存在傷口時(shí)，果實(shí)表面的拮抗酵母與病原菌在短時(shí)間內(nèi)(24 h)產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)和空間上的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從而抑制病原菌生長(zhǎng)。由圖1看出，獼猴桃采后接種青霉病菌，粘紅酵母不同處理對(duì)青霉病的防治效果不同。粘紅酵母菌懸液(108CFU/mL)抑制獼猴桃采后青霉病害的效果最佳，其發(fā)病率和病斑直徑分別為40%和3 cm，二者均大幅低于其他3種處理液(培養(yǎng)原液、濾液和無(wú)菌水)。濃度相同(108CFU/mL)條件下，培養(yǎng)原液抑菌效果低于菌懸液，其發(fā)病率和病斑直徑分別為50%和3.5 cm。用粘紅酵母濾液處理獼猴桃果實(shí)，加重病害發(fā)生，發(fā)病率高達(dá)100%。原因可能是濾液中存在某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利于青霉菌的生長(zhǎng)。

2.3 不同濃度粘紅酵母菌懸浮液對(duì)青霉菌的抑菌效果

從表2看出，獼猴桃采后接種青霉菌，不同濃度粘紅酵母菌懸液對(duì)青霉病的防治效果存在差異。粘紅酵母菌懸液濃度越大，獼猴桃青霉病發(fā)病率和病斑直徑越小，抑菌效果越好。粘紅酵母菌懸液濃度為109CFU/mL時(shí)，發(fā)病率和病斑直徑分別為 6%和0.9 cm，顯著低于除108CFU/mL外的其余處理，幾乎完全控制青霉菌的發(fā)展。對(duì)照(無(wú)菌水)的發(fā)病率和病斑直徑分別為100%和3.4 cm。因此，在獼猴桃貯藏期間，綜合考慮經(jīng)濟(jì)價(jià)值和抑菌效果，可選用108CFU/mL的粘紅酵母菌懸液來(lái)降低青霉病的發(fā)生，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間。

表2 不同濃度粘紅酵母菌懸液對(duì)青霉菌的抑菌效果

Table 2 Inhibition effect ofR.glutinissuspension with different concentration onPenicillium

處理Treatment發(fā)病率/%Morbidity病斑直徑/cm Disease spot diameter粘紅酵母菌懸液 106 CFU/mL 42.0 b2.8 b 106 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 107 CFU/mL 33.0 b2.1 b 107 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 108 CFU/mL 10.0 c1.1 c 108 CFU/mL R. glutinis suspension粘紅酵母菌懸液 109CFU/mL 6.0 c0.9 c 109 CFU/mL R. glutinis suspension無(wú)菌水(CK)Sterile water100.0 a3.4 a

3 結(jié)論與討論

粘紅酵母作為一種生防菌對(duì)多種水果采后引起的腐爛病具有較好的防治效果[8]，前人的研究多集中在蘋果、梨、草莓、甜櫻桃及柑橘等水果采后病害的研究。通過(guò)粘紅酵母不同濃度(108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL和105CFU/mL)和不同類型(培養(yǎng)原液、菌懸液、濾液)處理液進(jìn)行青霉菌體外抑制試驗(yàn)和獼猴桃果實(shí)青霉菌接種防治試驗(yàn)，研究粘紅酵母對(duì)獼猴桃貯藏期由青霉菌引起的腐爛病的抑制效果，結(jié)果表明，粘紅酵母菌懸液、培養(yǎng)液均能在一定程度抑制青霉菌孢子的萌發(fā)，而濾液沒(méi)有抑制作用。在粘紅酵母不同處理液中，以粘紅酵母菌懸液處理的青霉菌抑菌效果最佳，當(dāng)粘紅酵母菌懸液處理濃度為109CFU/mL時(shí)，獼猴桃果實(shí)在20℃的室溫條件貯藏，接種青霉病菌的果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑分別為 6%和0.9cm，幾乎完全控制青霉菌的發(fā)展，但防治效果與粘紅酵母菌懸液108CFU/mL處理的差異不顯著。因此，在獼猴桃貯藏期間，綜合考慮經(jīng)濟(jì)價(jià)值和抑菌效果，可選用108CFU/mL的粘紅酵母菌懸液來(lái)降低青霉病的發(fā)生，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間。

研究表明，采用粘紅酵母菌懸液處理獼猴桃果實(shí)，能一定程度抑制獼猴桃腐爛病發(fā)生，但獼猴桃的其他理化性質(zhì)是否發(fā)生改變，需要進(jìn)一步研究。因此，為了進(jìn)一步提高粘紅酵母的抑菌效果，還需深入研究其抑菌機(jī)理。