郭葉青 王曉艷

(1. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 湖北 宜昌 443003; 2. 中南大學(xué) 湘雅三醫(yī)院 消化內(nèi)科， 湖南 長沙 410013)

結(jié)腸癌是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來我國結(jié)腸癌的發(fā)病率、死亡率有逐步升高趨勢，嚴(yán)重危害國民健康[1]。手術(shù)、化療、免疫治療等是目前主要治療方案，但結(jié)腸癌晚期患者治療效果欠佳，且預(yù)后較差，其主要原因與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制非常復(fù)雜，這一過程涉及腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換、侵襲黏附、血管生成、胞外基質(zhì)的降解及微環(huán)境趨化作用[2]。因此，深入研究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)測患者預(yù)后具有重要意義。

microRNA是一種小分子的非編碼RNA，可參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，通過與下游靶基因mRNA的完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因mRNA發(fā)生降解或抑制其翻譯，發(fā)揮負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)的作用[3]。目前已有較多研究證實miR-126與腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移發(fā)生相關(guān)[4-6]。其下游靶蛋白趨化因子受體4(chemokine C-X-C motif receptor 4，CXCR4)是趨化因子配體12 (chemokine C-X-C motif ligand 12， CXCL12)的特異性受體。CXCL12/CXCR4軸參與調(diào)控胃癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等多種腫瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[7-10]。然而，CXCR4在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用尚未闡明。已有研究證實，CXCR4為miR-126的靶基因，miR-126可抑制CXCR4蛋白的表達(dá)[11]。本文分別運(yùn)用原位雜交、免疫組化方法檢測結(jié)腸癌組織芯片中miR-126、CXCR4蛋白表達(dá)，分析二者與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，并進(jìn)行生存分析，探討miR-126和CXCR4與結(jié)腸癌生物學(xué)行為以及患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織芯片

本研究所用的2張組織芯片購自上海芯超公司，芯片的編號是OD-CT-DgCo105-106，每張組織芯片上含75例結(jié)腸癌患者的癌組織及癌旁的正常黏膜各1點，共150點。組織芯片上每塊組織直徑1.5 mm，厚4 μm，其中男性患者38例，女性患者37例，共75例。所有患者均在2012年1月～2013年1月行手術(shù)治療，均具備完整隨訪資料。截至2018年10月，以最后一次的隨訪日期或者患者的死亡日期為隨訪結(jié)束點；以手術(shù)日期到隨訪結(jié)束或者死亡的日期為生存期；最短的隨訪時間為1個月，最長的隨訪日期為66個月?；颊吣挲g分布范圍為30～82歲，年齡≥60歲患者49例，<60歲患者26例?；颊呤中g(shù)前均未接受化放療，其中Dukes A期12例，Dukes B期23例，Dukes C期31例，DukesD期9例。高分化10例，中分化53例，低分化12例。合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。標(biāo)本均通過HE染色驗證。

1.1.2 主要試劑

hsa-miR-126原位雜交探針購自Exiqon公司，hsa-miR-126探針序列：/5DigN/GCATTATTACTCACGGTACGA/3Dig_N/。鼠抗人單克隆抗體CXCR4購自美國Santa Cruz公司。DAB顯色試劑盒、即用型免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。

1.2 方法

1.2.1 原位雜交方法

組織芯片常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫滅活，3%胃蛋白酶消化，0.1 mol/L PBS緩沖液固定；滴加預(yù)雜交液20 μL，電熱恒溫箱59℃孵育3 h；滴加20 μL雜交液，電熱恒溫箱59℃孵育24 h；37℃的SSC緩沖液洗滌切片；滴加封閉液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，在濕盒中避光反應(yīng)NBT/BCIP 24 h；加200 μL核固紅染液1 min，酒精脫水；封片、拍照。采用已知的結(jié)腸癌原位雜交陽性切片作陽性對照，以不加探針的預(yù)雜交液作為陰性對照。

1.2.2 原位雜交結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)及觀察評分

綜合miR-126陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比例及染色強(qiáng)度兩個指標(biāo)評分。陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比例評分標(biāo)準(zhǔn)：<5%，記0分；5%～25%，記1分；26%～50%，記2分；51%～75%，記3分；>75%，記4分。染色程度強(qiáng)弱評分：淡紅色，記0分；淺藍(lán)紫色，記1分；藍(lán)紫色，記2分；深藍(lán)紫色，記3分。兩位病理專家根據(jù)上述的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行雙盲評分后，取兩項相加為最終評分。結(jié)果的評判：0分為陰性(-)；1～2分為弱陽性(+)；3～5分為中等陽性(++)；6～7分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.2.3 免疫組化

結(jié)腸癌組織芯片經(jīng)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)，PBS液漂洗之后以3%過氧化氫孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS液漂洗后滴加非免疫動物血清封閉。室溫孵育，PBS沖洗后滴加CXCR4抗體(1∶2 000)，置于4℃冰箱過夜。PBS液漂洗后滴加二抗，室溫30 min，PBS液漂洗，DAB試劑顯色，蘇木精進(jìn)行復(fù)染，再行脫水、透明、封片。用已知的陽性染色結(jié)腸癌組織切片作陽性對照，用PBS液替代一抗為陰性對照，樹膠干后顯微鏡下拍照。

1.2.4 免疫組化評判標(biāo)準(zhǔn)及觀察評分

根據(jù)目的蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)比例及染色強(qiáng)度評分。染色程度的強(qiáng)弱評分：陰性染色為0分；淡黃色染色，為1分；棕黃色，為2分；棕褐色染色，為3分。陽性細(xì)胞計數(shù)：<5%，記0分；5%～25%，記1分；26%～50%，記2分；51%～75%，記3分；>75%，記4分。兩位病理專家根據(jù)上述的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行雙盲評分后，取兩項相加為最終評分。結(jié)果的評判：0分為陰性(-)；1～2分為弱陽性(+)；3～5分為中等陽性(++)；6～7分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用率(%)表示，各組間率的比較采用卡方檢驗或者Fisher確切概率法。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。生存分析方法采用Kaplan-Meier法、Log-rank檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-126在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)及與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

由于脫片原因?qū)е虏糠謽?biāo)本未能染色成功。因此，本研究共分析了75例患者結(jié)腸癌組織及59例癌旁正常粘膜組織中miR-126的表達(dá)。結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織及癌旁正常粘膜組織中miR-126陽性表達(dá)定位在胞漿，陽性染色呈深藍(lán)紫色(見圖1)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miR-126的表達(dá)顯著低于癌旁正常黏膜(64.00% vs. 91.53%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，miR-126的表達(dá)與結(jié)腸癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期明顯相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度等無明顯相關(guān)性(均P>0.05)，見表2。

表1 miR-126在結(jié)腸癌及癌旁正常粘膜組織中的表達(dá)[n(%)]

表2 miR-126與結(jié)腸癌臨床病理特征間的關(guān)系[n(%)]

2.2 miR-126的表達(dá)對結(jié)腸癌患者術(shù)后生存時間的影響

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果示，miR-126陽性表達(dá)組的術(shù)后生存時間為53.14±2.93月，5年生存率是64.20%；陰性表達(dá)組術(shù)后生存時間為33.00±2.28月，5年生存率為42.80%。miR-126陰性表達(dá)組的生存率明顯低于陽性表達(dá)組。Log-rank檢驗結(jié)果顯示，兩組間的生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 CXCR4在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)及與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

由于脫片原因?qū)е虏糠謽?biāo)本未能染色成功。因此，本研究共分析了66例患者結(jié)腸癌組織及64例癌旁的正常粘膜組織中CXCR4蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織及癌旁正常粘膜組織中，CXCR4蛋白表達(dá)陽性定位在胞漿、胞膜，陽性的染色呈棕黃色或者棕褐色(見圖3)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中CXCR4蛋白表達(dá)顯著高于癌旁正常黏膜(P<0.05)，見表3。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CXCR4蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期明顯相關(guān)(均P<0.05)，而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度等無關(guān)(均P>0.05)，見表4。

2.4 CXCR4的表達(dá)對結(jié)腸癌患者術(shù)后生存時間影響的分析

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CXCR4蛋白表達(dá)陽性組的術(shù)后生存時間為38.79±4.67月，5年生存率為38.10%；而CXCR4蛋白表達(dá)陰性組術(shù)后生存時間為53.84±3.20月，5年生存率達(dá)61.20%。CXCR4蛋白陽性表達(dá)組的生存率明顯低于陰性表達(dá)組。兩組間的生存率經(jīng)Log-rank檢驗，結(jié)果示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

表3 CXCR4蛋白在結(jié)腸癌及癌旁正常粘膜組織中的表達(dá)[n(%)]

表4 CXCR4蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征間的關(guān)系[n(%)]

2.5 結(jié)腸癌組織中miR-126、CXCR4蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

在48例miR-126表達(dá)陽性的結(jié)腸癌組織中，CXCR4蛋白陰性表達(dá)占14例；在50例CXCR4陽性的結(jié)腸癌組織中，miR-126陰性表達(dá)的占16例。經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中miR-126與CXCR4蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.43，P<0.05，見表5)。

表5 結(jié)腸癌組織中miR-126與CXCR4蛋白表達(dá)的關(guān)系

3 討論

miRNA調(diào)控人類約三分之一的基因表達(dá)，且參與多個腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控。人類的miRNA基因中有一半以上定位于腫瘤相關(guān)基因，這個區(qū)域易發(fā)生染色體的缺失、易位或者異常擴(kuò)增[12]。大量研究發(fā)現(xiàn)，miR-126、miR-34b、miR-143、miR-448、miR-766等多種miRNA的異常表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[13-16]。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可通過調(diào)控胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)，從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲。Alhasan等[18]研究證實，miR-126可通過靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子基因表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miR-126的表達(dá)陽性率明顯低于癌旁正常黏膜組織，且miR-126的表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，而與患者年齡、性別、分化程度、腫瘤大小等無關(guān)。進(jìn)一步行生存分析顯示，miR-126陰性表達(dá)組生存率明顯低于miR-126表達(dá)陽性組。此結(jié)果提示，miR-126在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，可能與抑制結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。CXCR4在腫瘤的增殖、血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[19-21]。本研究結(jié)果顯示，癌組織中CXCR4蛋白的表達(dá)陽性率明顯高于癌旁正常黏膜組織，且CXCR4蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。進(jìn)一步行生存分析顯示，CXCR4蛋白陽性表達(dá)組生存率明顯低于CXCR4蛋白表達(dá)陰性組。此結(jié)果提示，CXCR4蛋白可能促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移，且與結(jié)腸癌患者不良預(yù)后有關(guān)。

目前，miR-126在結(jié)腸癌細(xì)胞中具體調(diào)控機(jī)制尚未闡明。Li等[11]在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，miR-126可通過靶向抑制CXCR4的表達(dá)從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，但目前仍缺乏miR-126和CXCR4在組織水平的相關(guān)證據(jù)。因此，本研究通過在結(jié)腸癌組織芯片檢測miR-126及CXCR4蛋白的表達(dá)，對兩者的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示miR-126的表達(dá)與CXCR4蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，在組織水平證實miR-126在結(jié)腸癌中可能存在對CXCR4的靶向負(fù)調(diào)控作用。

綜上所述，與癌旁正常粘膜組織相比，結(jié)腸癌組織中miR-126的表達(dá)降低，而CXCR4蛋白的表達(dá)升高，二者的表達(dá)異常均與結(jié)腸癌患者臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，并顯著影響了患者預(yù)后。因此，miR-126和CXCR4有可能成為結(jié)腸癌診斷、治療及預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。