譚宇彥 王晶敏 王 棟

(1.三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 普外科， 湖北 宜昌 443003； 2. 東南大學附屬中大醫(yī)院 普外科， 江蘇 南京 210009)

膽囊膽固醇結(jié)石是一種嚴重危害人類健康的常見病，我國發(fā)病率為4.42%～11%[1]。膽固醇結(jié)石成因復雜，膽囊收縮功能障礙在膽固醇結(jié)石的形成中起關(guān)鍵的作用[2]。Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是分布在消化道自主神經(jīng)末梢和平滑肌細胞之間的一類特殊細胞，特異性表達Ⅲ型酪氨酸激酶生長因子受體c-kit，主要參與消化道基本電節(jié)律的產(chǎn)生和調(diào)控，對維持消化道正常運動功能起決定性作用[3]。研究表明ICC存在于動物和人類膽囊，其功能異常與膽囊結(jié)石發(fā)病相關(guān)，并已成為研究熱點[4]。本實驗通過構(gòu)建兔膽囊膽固醇結(jié)石模型，研究膽固醇結(jié)石形成過程中膽囊收縮功能與ICC凋亡的關(guān)系，并對其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 兔膽囊結(jié)石模型建立

成年新西蘭大白兔52只(雌雄不限)，由江蘇省農(nóng)業(yè)廳模式動物研究所提供。依次稱重編號隨機分為實驗組(n=32)和對照組(n=20)，分別給予高膽固醇致石飼料和普通飼料喂養(yǎng)6周[5]。6周后禁食24 h、禁飲12 h行B超檢查成石情況。

1.2 主要試劑

膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)(美國Sigma公司)；二乙基乙酰苯胺亞氨二醋酸(99mTc-EHID)(南京森科醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；丙酮(成都科隆化工試劑廠)；25%烏拉坦溶液(東南大學機能實驗室)；正常山羊血清(丹麥DAKO 公司)；兔抗人CD117多克隆抗體、Cy3標記山羊抗兔二抗IgG(美國Santa Cruz公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TUNEL試劑盒(羅氏公司)，總膽固醇測定試劑盒、總膽汁酸測定試劑盒、磷脂測定試劑盒(北京金豪制藥有限公司)。

1.3 主要設備

單光子發(fā)射計算機斷層掃描儀(SPECT)(德國Siemens公司)，F(xiàn)V1000共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)，AU5400全自動生化儀(美國貝克曼公司)。

1.4 膽囊收縮功能核素顯像掃描

對照組和實驗組各9只，25%烏拉坦溶液經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢推注(4 mL/kg)，待兔麻醉后仰臥固定于兔臺，探頭置于中上腹部，耳緣靜脈彈丸注射1 mL99Tcm-EHIDA (3～5 mci/mL)，即刻起開始動態(tài)采集數(shù)據(jù)，采集矩陣為64×64，放大倍數(shù)1.5，采集速度1幀/min，待膽囊顯像后并達到最濃聚時，耳緣靜脈注射CCK(20 μg/kg)，繼續(xù)動態(tài)采集60 min。利用軟件工具勾畫膽囊感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，由計算機程序自動繪制膽囊時間-放射性曲線，記錄兩組膽囊半排時間和30 min的排膽分數(shù)(gallbladder ejection fraction，GEF)。GEF按照以下公式計算：

1.5 膽汁膽固醇飽和指數(shù)測定

應用全自動生化分析儀測定膽汁總膽汁酸、膽固醇、磷脂濃度。根據(jù)所測結(jié)果查Carey表[6]，得出理論膽固醇濃度，再計算膽汁膽固醇飽和指數(shù)(cholesterol saturation index，CSI)。CSI=實際膽固醇摩爾百分比濃度/理論膽固醇摩爾百分比濃度。

1.6 膽囊組織氧化應激指標測定

取80～100 mg新鮮膽囊標本4℃生理鹽水漂洗后勻漿、離心，取上清液測量MDA、GSH-PX和T-SOD的含量。

1.7 膽囊組織全層鋪片CD117/TUNEL雙染ICC凋亡熒光檢測

新鮮膽囊灌注丙酮固定24 h，沿縱軸剖開膽囊，剝離膽囊黏膜及黏膜下層，保留膽囊肌層，并修剪成2 cm×2 cm大小。再用PBS漂洗3次，山羊封閉血清孵育1 h后，加入CD117一抗(1∶100)，4℃冰箱過夜。PBS漂洗后加入二抗(1∶100)室溫下反應45 min。PBS洗脫二抗，每份標本加50 μL TUNEL檢測液反應1 h，PBS避光漂洗后撈片、風干，抗熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察，隨機挑選10個200倍隨機視野，利用image pro plus 5.0軟件計數(shù)CD117+/TUNEL+雙陽性細胞。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兔膽囊結(jié)石模型評估

B超發(fā)現(xiàn)，對照組兔膽囊內(nèi)未見有結(jié)石和其他病變；實驗組兔膽囊腔內(nèi)可見單個或多個強回聲光團，部分后方有聲影，膽囊透聲差，見表1。

表1 兩組兔死亡率和成石率[n(%)]

2.2 兩組膽囊收縮功能比較

計算機程序根據(jù)所選ROI區(qū)，自動繪制膽囊時間-放射性曲線(見圖1)。結(jié)果顯示注射CCK后30 min，實驗組GEF為86.30%±2.30%，對照組為60.00%±4.80%，兩組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2A；實驗組膽囊半排時間為25.60±2.80 min，較對照組17.30±3.10 min明顯延遲，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2B。

2.3 兩組膽汁膽固醇飽和指數(shù)比較

實驗組膽汁膽固醇濃度、膽固醇飽和指數(shù)顯著升高，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組膽汁CSI比較

注：與對照組相比，aP<0.05

2.4 兩組膽囊組織氧化應激情況比較

兩組膽囊組織氧化應激指標檢測結(jié)果見圖3。對照組T-SOD為94.81±8.07 U/mgprot，實驗組為46.95±5.36 U/mgprot；對照組GSH-PX為34.04±2.3 U/mgprot，實驗組為28.48±1.31 U/mgprot。對照組膽囊組織MDA為0.56±0.09 nmol/mgprot，實驗組為1.00±0.15 nmol/mgprot。上述指標兩組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

2.5 兩組膽囊組織ICC凋亡情況

在激光共聚焦顯微鏡下觀察，膽囊全層鋪片中CD117+的ICC發(fā)紅色熒光，呈網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)，TUNEL染色標記的凋亡細胞發(fā)綠色熒光，CD117+/TUNEL+雙標的細胞為凋亡的ICC，發(fā)黃色熒光，見圖4。正常膽囊組織可見極少的CD117+/TUNEL+雙標細胞，而結(jié)石膽囊組織CD117+/TUNEL+雙標細胞明顯增多(6.42±1.28 vs 14.28±3.52 cells/200，P<0.05)。

3 討論

膽囊收縮功能下降是膽囊結(jié)石形成的重要原因，膽囊ICC減少對膽囊收縮功能的影響也起到了至關(guān)重要的作用。ICC是西班牙神經(jīng)解剖學家Ramón Santiago y Cajal通過甲基藍及嗜銀染色法在胃腸道奧爾巴赫神經(jīng)叢、深肌層、環(huán)行肌層內(nèi)觀察到的一類特殊間質(zhì)細胞[7]。ICC主要的功能是：①慢波(slow wave, SW)電位的起搏細胞：ICC產(chǎn)生的SW電位，是消化道運動的基礎，決定著平滑肌收縮節(jié)律和傳播方向；②SW電位的傳導細胞：SW電位通過ICC網(wǎng)絡傳播給與之相連的平滑肌細胞，刺激并調(diào)節(jié)平滑肌收縮活動；③介導神經(jīng)信號傳遞：消化道神經(jīng)選擇性地支配ICC，控制釋放多種神經(jīng)遞質(zhì)作用于ICC，影響ICC的電生理活動和平滑肌SW頻率的產(chǎn)生，調(diào)控消化道運動[8]。ICC的減少或缺失與多種消化道動力障礙性疾病，如賁門失弛緩癥、糖尿病性胃輕癱、慢傳輸型便秘、先天性巨結(jié)腸等密切相關(guān)[9]。

2007年Lavoie等[10]首次在豚鼠膽囊內(nèi)發(fā)現(xiàn)ICC，從形態(tài)學和生理學證明了ICC存在于膽囊中，并發(fā)現(xiàn)膽囊ICC有自發(fā)的細胞內(nèi)鈣震蕩，參與膽囊平滑肌慢波電位的起搏，調(diào)控膽囊的收縮運動。Pasternak等[11]在患者切除的無瘤膽囊上確定了人類膽囊存在ICC，并認為膽囊能產(chǎn)生和傳播自發(fā)性節(jié)律與其密不可分。當用亞甲藍+光照射特異性破壞膽囊ICC后，膽囊肌條收縮能力顯著下降，膽囊SW電位明顯消失，這進一步證實了ICC對膽囊運動有直接影響[12]。ICC特異性表達III型酪氨酸激酶生長因子受體c-kit[7]。消化道肥大細胞亦表達c-kit，主要位于消化道粘膜層和粘膜下層，而膽囊ICC位于平滑肌層[13]。實驗中我們剝離膽囊黏膜及黏膜下層，保留膽囊肌層，盡可能消除肥大細胞的影響。全層鋪片是研究消化道肌間神經(jīng)叢和ICC形態(tài)和數(shù)量變化常用的一種方法，通過這項技術(shù)制備全層鋪片后再進行CD117/TUNEL雙染，能直觀地顯示ICC網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)和凋亡的變化。

在膽囊結(jié)石發(fā)病過程中，ICC減少的原因和機制仍不清楚。Matyja等[14]推測成石膽汁中高膽固醇含量與膽囊結(jié)石患者膽囊ICC減少可能有關(guān)。動物實驗發(fā)現(xiàn)，用高膽固醇飲食喂養(yǎng)豚鼠，膽囊組織c-kit mRNA及蛋白含量明顯減少[15]，在膽囊組織中表達c-kit的主要是ICC。在許多與膽固醇代謝紊亂相關(guān)的疾病和動物實驗研究中均發(fā)現(xiàn)，高膽固醇可誘發(fā)氧化應激反應導致組織細胞凋亡[16，17]。當組織內(nèi)膽固醇濃度增高時，氧自由基系統(tǒng)激活，釋放大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，使組織處于氧化應激狀態(tài)。同時，膽固醇濃度增高，可使血管內(nèi)皮粘附因子的表達增加，導致白細胞粘附和滲透活動增強，發(fā)生血小板-內(nèi)皮細胞聚集，使內(nèi)皮細胞ROS產(chǎn)生增多[18]。一項臨床雙盲隨機對照試驗發(fā)現(xiàn)，膽囊結(jié)石患者口服熊去氧膽酸調(diào)節(jié)肝臟膽固醇代謝，可降低膽汁中膽固醇濃度，同時可明顯降低膽囊組織中脂質(zhì)過氧化水平[19]。高膽固醇誘發(fā)的氧化應激反應與細胞凋亡有著密切的關(guān)系。當膽固醇濃度超過30 μg/mL時，血管組織中ROS水平明顯增加，動脈粥樣硬化斑塊中的泡沫細胞發(fā)生凋亡[20]。在體外培養(yǎng)的MIN6細胞株中，逐漸增加培養(yǎng)基中游離膽固醇的含量，以劑量-時間依賴性方式誘導了細胞凋亡，而且細胞內(nèi)ROS水平增加也暗示了膽固醇負荷后產(chǎn)生持久的高水平ROS，直接誘導了MIN6細胞的凋亡[21]。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)：實驗組膽汁CSI明顯高于對照組，膽囊組織氧化應激指標MDA較對照組明顯上升，而抗氧化應激指標T-SOD、GSH-PX顯著下降，結(jié)石膽囊組織中ICC凋亡顯著增多。以上結(jié)果顯示，膽囊膽固醇結(jié)石形成過程中，膽汁中膽固醇過飽和可誘發(fā)膽囊組織氧化應激反應，促使ICC凋亡。然而，高膽固醇通過氧化應激誘發(fā)ICC凋亡是通過哪一關(guān)鍵凋亡信號通路還有待進一步研究。