張煦然，范德凱，孫武興，王曙賓

(漢義生物科技(北京)有限公司 生命科學(xué)研究院，北京 100176)

1 引言

大麻(CannabissativaL.)為?？埔荒晟荼局参?，又名麻、漢麻、火麻、山絲苗、黃麻, 具有重要的農(nóng)用及藥用價(jià)值，世界各地都有廣泛的栽培。作為一種古老的栽培植物，早在4000年前，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已有關(guān)于大麻的描述[1]。四氫大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)是大麻中重要的大麻素等[2,3]，其藥理活性強(qiáng)，醫(yī)藥用途廣泛，具有很好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。藥理研究證實(shí)，THC 的藥理活性主要表現(xiàn)為抗腫瘤、保護(hù)心血管和抗菌等，而CBD除上述活性外，還具有神經(jīng)保護(hù)、代謝和免疫調(diào)節(jié)、抗炎抗氧化和護(hù)肝等作用[4]。

THC和CBD互為同分異構(gòu)體[5]，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，有研究報(bào)道[6]，在正常胃腸運(yùn)輸過(guò)程中，口服CBD在酸性胃環(huán)境中會(huì)迅速形成Δ9-THC和其他精神活性大麻素。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)CBD和水溶性CBD在人工胃液、人工腸液中進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，并對(duì)CBD在人工胃液中是否快速產(chǎn)生THC的實(shí)驗(yàn)結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1 (a)四氫大麻酚(THC)和(b)大麻二酚(CBD)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 儀器與材料

2.1 儀器

島津LC-16型高效液相色譜儀(包括真空在線(xiàn)脫氣機(jī)、二元泵系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、LabSolutions工作站)，日本島津公司；SHA-B型水浴恒溫振蕩器(天津市賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠(chǎng))；SQP型電子天平(Satorious)；FE28-standand型pH計(jì)(METTLER TOLEDO)。

2.2 材料

大麻二酚(CBD，批號(hào)20180801，含量96.66%，來(lái)源：云南漢素生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)室標(biāo)定)；四氫大麻酚(THC，批號(hào)FE08221804，濃度1 mg/mL，規(guī)格1 mg，含量99.39%，來(lái)源：SIGMA-ALORICH)；水溶性CBD(含量：10%，批號(hào)20190706，來(lái)源：云南漢素生物科技有限公司)；甲酸和乙腈為色譜級(jí)；鹽酸、無(wú)水乙醇、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、磷酸二氫鉀為分析級(jí)；胃蛋白酶和胰蛋白酶為生化試劑。

3 方法與結(jié)果

3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密量取THC對(duì)照品適量，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋制成20 μg/mL的THC對(duì)照品貯備液。精密稱(chēng)取CBD對(duì)照品適量，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋制成300 μg/mL的CBD對(duì)照品貯備液。分別取CBD和THC對(duì)照品貯備液適量，混勻，得到每1 mL中含有CBD 150 μg和THC 10 μg的混合對(duì)照品溶液。

3.2 穩(wěn)定性考察試劑制備

(1)試劑①：人工胃液。取稀鹽酸(取鹽酸234 mL，加水稀釋至1000 mL制得)8.2 mL，加水約400 mL與胃蛋白酶5 g，搖勻后，加水稀釋成500 mL。

(2)試劑②：不含胃蛋白酶的人工胃液。取稀鹽酸(取鹽酸234 mL，加水稀釋至1000 mL制得)，加水稀釋至500 mL，配置成不含胃蛋白酶的人工胃液。

(3)試劑③：含0.2%NaCl人工胃液。取氯化鈉0.2 g，置100 mL量瓶中，加人工胃液溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

(4)試劑④：人工腸液。取磷酸二氫鉀3.4 g，加水250 mL使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8；另取胰酶5 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至500 mL。

(5)試劑⑤：不含胰蛋白酶的人工腸液。取磷酸二氫鉀3.4 g，加水250 mL使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至500 mL配置成不含胰蛋白酶的人工腸液。

(6)試劑⑥：含1%SDS、0.2%NaCl人工胃液。取稀鹽酸(取鹽酸234 mL，加水稀釋至1000 mL制得)8.2 mL，加水約400 mL，加5 g SDS。取1.0 g氯化鈉，1.6 g胃蛋白酶(豬粘膜)加水100 mL溶解，將兩溶液混合。

(7)試劑⑦：0.2%Nacl溶液。取氯化鈉0.2 g，置100 mL量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

(8)試劑⑧：含1%SDS人工胃液。取SDS 0.5 g，置50 mL量瓶中，加人工胃液溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備

CBD穩(wěn)定性考察：取CBD約12 mg，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入無(wú)水乙醇14 mL，溶解后分別精密加入配制試劑①、③、⑥、⑧各10 mL，搖勻，放置水浴恒溫振蕩器(溫度：37 ℃、轉(zhuǎn)速：160 r/min)中，分別于0 h、1 h、3 h、24 h精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

水溶性CBD穩(wěn)定性考察(加乙醇)：取水溶性CBD約120 mg(約含CBD 12 mg)，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入無(wú)水乙醇14 mL，溶解后分別精密加入配制試劑①、②、④、⑤、⑥、純化水各10 mL，搖勻，放置水浴恒溫振蕩器(溫度：37 ℃、轉(zhuǎn)速：160 r/min)中，分別于0 h、1 h、3 h、24 h精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液；

水溶性CBD穩(wěn)定性考察(未加乙醇)：取水溶性CBD約120 mg(約含CBD 12 mg)，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入純化水14 mL，溶解后分別精密加入配制試劑①、③、⑥、⑦，搖勻，放置水浴恒溫振蕩器(溫度：37 ℃、轉(zhuǎn)速：160 r/min)中，分別于0 h、1 h、3 h、24 h精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 色譜條件

采用Sepax GP-C18色譜柱 (4.6 mm×150 mm，3 μm，120 ?)；流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液(流動(dòng)相A)-0.1%甲酸的乙腈溶液(流動(dòng)相B)，梯度洗脫(0～6 min，30%A；6～12 min，30%～23%A；12～22 min，23%A；22～22.2 min，23%～30%A；22.2～32 min，30%A)；流速：1.2 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣量：10 μL。混合對(duì)照品中CBD和THC色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 CBD和THC對(duì)照品溶液的HPLC色譜圖1.CBD：9.134 min； 2.THC：16.322 min

2.5 水溶性CBD穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5.1 水溶性CBD穩(wěn)定性考察(加乙醇)

在人工胃液中，CBD含量在24 h內(nèi)降解1.83%，產(chǎn)生0.29%THC；不加胃蛋白酶人工胃液中，CBD降解速度與人工胃液條件試驗(yàn)結(jié)果一致；在含1%SDS、0.2%NaCl人工胃液中，CBD在24 h含量降解76.62%，THC產(chǎn)生21.25%。在人工腸液和水液中，CBD未降解，也未檢測(cè)出THC。水溶性CBD(加乙醇)溶液0 h～24 h穩(wěn)定性樣品色譜圖見(jiàn)圖3～6，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖3 水溶性CBD(加乙醇)溶液0 h色譜圖

圖4 水溶性CBD(加乙醇)溶液1 h色譜圖

色譜圖3～6中，a、b、c、d、e、f依次為人工胃液、人工腸液、不含胃蛋白酶的人工胃液、不含胰蛋白酶的人工腸液、含1%SDS和0.2%NaCl人工胃液、純化水。

圖5 水溶性CBD(加乙醇)溶液3 h色譜圖

圖6 水溶性CBD(加乙醇)溶液24 h色譜圖

2.5.2 水溶性CBD穩(wěn)定性考察(未加乙醇)

水溶性CBD在人工胃液中溶解，不用加乙醇助溶。在含1%SDS，0.2%NaCl人工胃液中，CBD含量在24 h內(nèi)降解28.1%，THC產(chǎn)生8.15%；在人工胃液、0.2%NaCl人工胃液、0.2%NaCl溶液中，CBD在24 h未降解，未檢測(cè)到THC。水溶性CBD(未加乙醇)溶液0 h～24 h穩(wěn)定性樣品色譜圖見(jiàn)圖7～10，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖7 水溶性CBD溶液0 h色譜圖

圖8 水溶性CBD溶液1 h色譜圖

圖9 水溶性CBD溶液3 h色譜圖

圖10 水溶性CBD溶液24 h色譜圖

色譜圖7～10中，a、b、c、d依次為含1%SDS和0.2%NaCl人工胃液、人工胃液、含0.2%NaCl人工胃液、 0.2%NaCl溶液。

2.6 CBD穩(wěn)定性考察結(jié)果

CBD不溶于人工胃液，加乙醇后全部溶解。在人工胃液中，CBD含量在24 h降解0.64%，THC產(chǎn)生0.28%；在含1%SDS、0.2%NaCl人工胃液中，CBD含量在24 h降解0.64%，THC產(chǎn)生0.28%；人工胃液?jiǎn)为?dú)加SDS、Nacl，CBD在24 h降解率，THC產(chǎn)生率與“含1%SDS、0.2%NaCl人工胃液人工胃液”結(jié)果一致。CBD粉溶液0 h～24 h穩(wěn)定性樣品色譜圖見(jiàn)圖11～14，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖11 CBD粉溶液0 h色譜圖

色譜圖11～14中，a、b、c、d依次為人工胃液、含1%SDS和0.2%NaCl人工胃液、含0.2%NaCl人工胃液、含1%SDS人工胃液。

3 討論

通過(guò)CBD和水溶性CBD在人工胃液及腸液穩(wěn)定性試驗(yàn)，可知使CBD降解的主要條件為HCL溶液，加入乙醇或者1%SDS后CBD降解迅速并產(chǎn)生THC，胃蛋白酶、胰蛋白酶、低濃度的NaCl(0.2%)溶液不會(huì)使CBD降解生成THC。水溶性CBD不含有乙醇和1%SDS的情況下，在人工胃液中比較穩(wěn)定，不會(huì)產(chǎn)生THC；CBD和水溶性CBD在加入乙醇的情況下，在人工胃液中會(huì)產(chǎn)生THC。

圖12 CBD粉溶液1 h色譜圖

圖13 CBD溶液3 h色譜圖

圖14 CBD溶液24 h色譜圖

表1 穩(wěn)定性考察結(jié)果

續(xù)表1

考察項(xiàng)目時(shí)間/h水溶性CBD(加乙醇)水溶性CBD(未加乙醇)CBD(加乙醇)CBD測(cè)得量/mg降解率/%THC含量/%CBD測(cè)得量/mg降解率/%THC含量/%CBD測(cè)得量/mg降解率/%THC含量/%2411.681.700——————純化水013.6800——————111.4916.010——————311.4916.030——————2411.4916.030——————

CBD對(duì)于多發(fā)性硬化癥、精神分裂癥、雙相躁狂、社交焦慮癥、失眠、亨廷頓病和癲癇等疾病的治療具有良好的效果[7,8]。如FDA審批上市的GW公司抗癲癇新藥Epidiolex，采用植物油溶解CBD，在進(jìn)入胃腸道過(guò)程中可以降低精神活性大麻素形成的可能性，提高用藥安全性。利用先進(jìn)的制劑技術(shù)開(kāi)發(fā)水溶性CBD，提高CBD在水中的溶解度，不僅可以提高其生物利用度，且極大拓展了其應(yīng)用場(chǎng)景。