布天杰 潘雨煙 張寧

摘要 目的：通過網絡藥理學方法探討經方真武湯治療糖尿病腎?。―KD）的核心作用靶標基因以及潛在通路機制，旨在指導臨床用藥同時為更深入的實驗研究提供依據(jù)。方法：通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索真武湯所含藥物的有效成分、潛在作用靶點，在Genecards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫篩選與糖尿病腎病有關的疾病靶點，借助Cytoscape3.7.2繪制并構建“藥物-成分-靶點-疾病”可視化交互網絡。利用STRING平臺繪制關鍵靶點PPI網絡，在David數(shù)據(jù)庫里針對關鍵靶點蛋白開展GO基因功能、KEGG信號通路富集分析。結果：檢索查篩出真武湯中有效活性成分59個、潛在靶點108個，其中涉及DKD的關鍵靶點47個，從蛋白互作網絡中分析發(fā)現(xiàn)TNF、ATK1、JUN、RELA、IL6、MAPK8、CASP8、NOS2可能是真武湯治療糖尿病腎病的核心靶點。GO富集分析得到180個條目，主要涉及細胞增殖、代謝、凋亡及脂肪細胞因子、葡萄糖穩(wěn)態(tài)等。KEGG信號通路富集分析得到94條信號通路，主要涉及TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路等。結論：本研究初步驗證真武湯治療糖尿病腎病的作用機制涉及多成分、多靶點、多信號通路，給予真武湯的臨床應用及更深層次對糖尿病腎病的研究以一定理論依據(jù)。

關鍵詞 真武湯;糖尿病腎病;網絡藥理學;作用機制

Network Pharmacology Study on Mechanism of Zhenwu Decoction in the Treatment of Diabetic Kidney Disease

BU Tianjie1，2， PAN Yuyan2， ZHANG Ning1

（1 Department of Nephrology and Endocrinology， Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100102， China; 2 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract Objective：Through network pharmacology methods， the core target genes and potential pathway mechanisms of Jingfang Zhenwu Decoction in the treatment of diabetic nephropathy （DKD） are explored， aiming to guide clinical medication and provide basis for more in-depth experimental research. Methods：The active ingredients and potential targets of the drugs contained in Zhenwu Decoction were searched through the TCMSP database， and disease targets related to diabetic nephropathy were screened in the Genecards， OMIM， and DisGeNET databases. With the help of Cytoscape 3.7.2， the visualized interactive network of "drug-component-target-" was drawn and constructed. The STRING platform was used to draw the key target of PPI network， and carry out the GO gene function and KEGG signal pathway enrichment analysis for the key target protein in the David database. Results：A total of 59 effective active components combined with 108 potential targets were searched from Zhenwu Decoction， of which 47 key targets involved in DKD. TNF， ATK1， JUN， RELA， IL6， MAPK8， CASP8 and NOS2 may be the core targets of Zhenwu Decoction in the treatment of diabetic kidney disease. GO enrichment analysis yielded 180 entries， mainly involving cell proliferation， metabolism， apoptosis and adipocytokines， and glucose homeostasis. KEGG signaling pathway enrichment analysis resulted in 94 signaling pathways， mainly involving TNF signaling pathway， HIF-1 signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway and FoxO signaling pathway. Conclusion：The mechanism of Zhenwu Decoction in the treatment diabetic kidney disease involves multiple components， targets and pathways， aiming to give Zhenwu Decoction clinical application and deeper research on diabetic nephropathy with a certain theoretical basis.

Keywords Zhenwu Decoction; Diabetic kidney disease; Network pharmacology; Mechanism of action

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.24.001

糖尿病腎病（Diabetic Kidney Disease，DKD）是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）患者的常見并發(fā)癥之一，在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前已超過了腎小球腎炎，成為慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease，CKD）的首要病因[1]。糖尿病腎病以高血糖為特點，在糖脂代謝紊亂、炎性反應刺激及氧化應激等因素影響下，導致腎代謝功能降低[2]。臨床上治療糖尿病腎病的主要原則有維持血糖水平穩(wěn)定、改善腎功能、糾正酸堿平衡及代謝紊亂。而現(xiàn)如今中醫(yī)藥的介入使得患者在進行基礎西藥治療的同時對本病擁有進一步獲取更好療效的機會。

中醫(yī)學并無糖尿病腎病的病名及相關記載，而根據(jù)其病因病機進行認識歸納，目前較為認可的是“腎消”或“消渴腎病”[3]。中醫(yī)認為，DKD亦屬消渴病范疇，系消渴氣陰兩虛日久，病變及腎，陰損及陽而導致的以“脾腎陽虛，濕毒內蘊”為基本病機的病證。真武湯出自古籍《傷寒論》，乃東漢醫(yī)家張仲景治療少陰陽氣虛衰，氣不化水，水濕泛濫而創(chuàng)立的經方。后世醫(yī)者在掌握其“溫補腎陽”的理論基礎上將真武湯廣泛應用于臨床實踐，在治療糖尿病腎病中亦取得了良好的療效[4-5]。

鑒于中藥復方具有多成分、多靶點的特點，真武湯治療DKD的作用機制尚未被明確闡明。而近年來網絡藥理學的興起為醫(yī)者提供全新的角度及思路，通過“基因靶點”及“信號通路”，以微觀、精準的層次探索中藥治療有關疾病的作用機制。本研究采用網絡藥理學研究方法，以探討真武湯治療DKD的作用靶點及信號通路為目的展開研究。

1 資料與方法

1.1 真武湯有效活性成分及潛在靶點的篩選

真武湯由附子、茯苓、白術、生姜、芍藥五味中藥組合而成。使用TCMSP分別篩選出上述五味藥物的所有化學成分[6]，根據(jù)藥代動力學參數(shù)確定以口服生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18作為化學成分中有效活性成分的篩選條件[7]進行篩選，再剔除其中重復的化學成分以及沒有靶點的化學成分。將得到的結果進一步搜索得到藥物的潛在靶點。同時，借助靶點標準化數(shù)據(jù)庫Uniprot（http：//www.uniprot.org/），對靶基因名稱進行規(guī)范化校正[8]。

1.2 糖尿病腎病相關靶點檢索與篩選

本研究利用人類基因組數(shù)據(jù)庫Genecards、OMIM以及DisGeNET，以“diabetic kidney disease”“diabetic nephropathy”作為關鍵詞進行檢索。對搜索到的結果進行匯總并剔除多余的重復項。在Genecards數(shù)據(jù)庫檢索過程中，為提高研究結果的準確性，本研究選取相關性分數(shù)（Relevance score）大于30分的靶點基因進行預測[9]。OMIM數(shù)據(jù)庫作為基因和遺傳表型以及它們之間關系的精確信息的主要儲存庫，包括基因圖譜的基因組協(xié)調搜索、表型系列中表型遺傳異質性的視圖和臨床概要的并排比較[10]。DisGeNET是一個整合和標準化多來源的疾病相關基因和變異數(shù)據(jù)的知識管理平臺，涵蓋了人類疾病的全譜以及正常和異常性狀[11]。

1.3 真武湯治療糖尿病腎病作用靶點的篩選及可視化網絡構建

將真武湯有效活性成分的靶點與疾病的靶點進行匹配，利用OmicShare平臺繪制韋恩圖，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.2，構建真武湯治療糖腎的“藥物-成分-靶點-疾病”可視化交互網絡。將共有靶點導入String在線數(shù)據(jù)庫中，限定物種為“Homo sapiens”，選取相互作用閾值高于0.9的高置信度數(shù)據(jù)，隱藏無蛋白互作關系的靶點，繪制出蛋白質間相互作用關系PPI網絡圖[12]。再將數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.2軟件進行可視化處理及分析，以degree值和combined score值分析靶點之間相互的作用關系。

1.4 GO功能及KEGG通路富集分析

借助David6.8在線數(shù)據(jù)庫，對真武湯治療糖尿病腎病的關鍵靶點開展GO及KEGG富集分析，探討相關靶點在基因功能和信號通路中的作用[13]。以富集結果P值<0.05作為篩選條件從小到大進行排序，P<0.01被認為顯著富集，篩選排名靠前的功能及通路，借助OmicShare平臺進行數(shù)據(jù)可視化處理。

2 結果

2.1 真武湯有效活性成分及潛在靶點的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索真武湯組成藥物附子、茯苓、白術、生姜和白芍的相關有效活性成分，依據(jù)上述篩選條件，結果依次得到有效活性成分21、15、7、5、13個。剔除重復項后，共得到59個有效活性成分，見表1及107個藥物潛在靶點，見表2。

2.2 DKD相關靶點檢索與篩選

在Genecards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索DKD相關靶點，分別收集到659、517、560個基因，通過篩選并剔除重復，最終得到DKD相關靶點基因1 462個。

2.3 真武湯治療DKD作用靶點的篩選及可視化網絡構建

將篩選得到的DKD相關靶點與真武湯有效活性成分靶點映射篩選出共同靶點47個，見圖1。通過Cytoscape3.7.2軟件構建真武湯“藥物-成分-靶點-疾病”可視化網絡，見圖2。在圖2中節(jié)點的顏色與形狀區(qū)分各自意義，黃色節(jié)點表示藥物的核心作用靶標，淺紅色節(jié)點表示藥物的有效活性成分，藍V節(jié)點表示真武湯組成藥物，淺藍色圓形節(jié)點代表DKD。

將交叉共有的靶點基因導入STRING數(shù)據(jù)庫，得到蛋白互作PPI網絡圖，見圖3，再將數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.2軟件進行可視化處理及分析，以degree值和combined score值分析靶點之間相互的作用關系。見圖4。節(jié)點的顏色和形狀大小代表degree值，藍色越深，圓形越大，degree值越高;橘色越深，圓形越小，degree值越低。節(jié)點之間連線的粗細代表combined score值，線條越粗，互作分數(shù)越高;線條越細，互作分數(shù)越低。以此篩選出網絡中信息傳遞效率更高、影響作用更大的核心蛋白質簇和核心靶點。結果顯示TNF、ATK1、JUN、RELA、IL6、MAPK8、CASP8、NOS2為其核心靶點。

2.4 真武湯治療DKD GO與KEGG通路富集分析

運用David將真武湯治療DKD的靶標蛋白基因上傳，開展GO功能富集分析，富集分析涉及其生物學過程、細胞組件及分子功能。結果共得到180個條目，以P<0.05作為篩選條件得到123個條目，其中顯著富集P<0.01的有59個。主要涉及細胞增殖的正調節(jié)、細胞凋亡及RNA聚合酶轉錄的正調控等生物學過程，膜筏、細胞膜外間隙等細胞組件和蛋白激酶活性、細胞因子活性及葡萄糖穩(wěn)態(tài)等分子功能。根據(jù)P值，將前30個條目借助OmicShare平臺進行數(shù)據(jù)可視化處理，氣泡圖中氣泡的大小代表該條目的基因數(shù)量，顏色代表富集顯著性。見圖5。

以相同方法進行KEGG通路富集分析共得到94條信號通路，P<0.05篩選出81條信號通路，其中顯著富集P<0.01的有65條。主要涉及TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、NF-κB信號通路等。以相同方法繪制氣泡圖。見圖6。

3 討論

中醫(yī)學認為糖尿病腎病，系“消渴腎病”，是由消渴病誤治、失治發(fā)展而來，消渴日久可耗氣傷陰，累及脾腎虛損，腎無以主水，脾失健運，而致痰濕、瘀血、濁毒互結于腎之脈絡，引起一系列相關癥狀。呂仁和教授在治療DKD時指出，DKD在不同時期的病機處于持續(xù)變化的狀態(tài)。初起以陰虛熱結為主，日久氣陰兩虛，腎氣不固而引發(fā)其他臟腑病變，脾腎陽虛證作為常見變證之一，治宜溫陽益氣，補腎健脾[14]。真武湯乃仲景方，出自《傷寒論》中，作為溫陽利水方主治陽虛水泛證，為后世所推崇。方中附子為君，辛溫大熱，溫腎陽而散寒;臣以茯苓、白術健脾益氣，利水燥濕;佐生姜助附子溫陽之力，又合白術、茯苓化濕利水;白芍可利尿養(yǎng)陰并調和附子燥烈之性。據(jù)臨床研究表明，真武湯可以顯著改善DKD患者臨床癥狀并改善腎功能[4-5]。

現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，DKD的病理學特征主要以腎小球肥大，基底膜增厚，系膜基質增生，腎間質纖維化及腎動脈硬化等為主[15]。DKD的發(fā)病機制較為復雜，除遺傳因素外包括糖代謝異常、腎臟血流動力學變化、脂代謝紊亂、細胞因子參與、高糖誘導的氧化應激反應以及自噬作用等。根據(jù)現(xiàn)代藥理學研究，附子中含有附子多糖，有通過促進GLUT4轉位而增加3T3-L1胰島素抵抗脂肪細胞對葡萄糖消耗的功能[16];白術多糖能夠增強外周靶器官對胰島素的敏感性從而改善血糖水平[17];茯苓多糖一方面可以利水消腫，另一方面也可以抑制腎臟細胞凋亡保護腎臟[18];生姜中姜黃素可降低DKD小鼠尿蛋白、改善腎小球硬化，降低腎臟炎性反應水平[19];白芍總苷能夠抑制炎性因子，保護足細胞，改善蛋白尿癥狀，延緩DKD的病情進展[20]。

本研究結果顯示，真武湯共含有59個有效活性成分，主要包括芍藥苷、水黃皮素、谷甾醇、山柰酚等。芍藥苷（Paeoniflorin）是白芍總苷中的主要生物活性成分。有研究表明，芍藥苷可通過抑制高糖環(huán)境下巨噬細胞的活化，減少TNF-α、IL-1β、MCP-1及巨噬細胞活化標志物iNOS等炎性因子的產生，發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用，從而改善腎臟炎性狀態(tài)達到保護腎臟的目的[21]。相關動物實驗證實芍藥苷可減少DKD大鼠尿蛋白，抑制腎小球肥大，改善腎臟炎性水平[22]。附子中的水黃皮素（Karanjin）是一種黃酮類化合物，具有降血糖、胃保護以及抗菌作用[23]，且在大鼠中具有良好的耐受性[24]。谷甾醇（Sitosterol）作為一種附子與生姜共同含有的甾體化合物，具有抗高血糖活性。其降糖作用可能是通過刺激胰島存活的β細胞導致更多的胰島素釋放[25]。Rangachari等[26]發(fā)現(xiàn)，谷甾醇通過增加胰島素分泌并抑制糖異生改善血糖水平，DKD大鼠經口給予γ-谷甾醇后血糖和糖化血紅蛋白顯著降低，血漿胰島素水平明顯升高。另有研究表明，β-谷甾醇可通過激活2型糖尿病大鼠脂肪組織中的IR和GLUT4來改善血糖控制[27]。白芍中的山柰酚（Kaempferol）對應靶點最多，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化的作用，并能夠抑制高糖環(huán)境下腎系膜細胞的增殖從而保護腎臟[28]。

根據(jù)蛋白互作網絡分析，TNF、ATK1、JUN、RELA、IL6、MAPK8、CASP8、NOS2等是真武湯治療DKD的核心靶點。TNF具有廣泛的生物學活性，體現(xiàn)于TNF-α的雙重生物學效應中。當濃度較低時TNF-α具有抗感染的作用，能夠參與調節(jié)炎性反應及組織修復;當其濃度過高則可破壞免疫平衡，對機體產生病理損傷。研究表明[29-30]，高糖環(huán)境可刺激腎臟多種細胞釋放TNF-α，其進一步刺激系膜細胞產生氧自由基，過程中產生的大量的脂質代謝產物作用于細胞內膜和基底膜，引起局部微血管通透性增強而損傷腎小球，促進蛋白尿的產生。JUN是AP-1家族轉錄因子的成員之一，通過與靶基因啟動子中的TRE元件結合活化下游核轉錄因子激活轉錄，介導應激狀態(tài)下的細胞改變[31]。相關研究發(fā)現(xiàn)[32-33]，在DKD持續(xù)高糖的狀況下，轉化生長因子β1（TGFβ1）可被活性氧簇ROS激活，其過度表達導致細胞外基質（ECM）沉積以及腎小球硬化，最終導致腎纖維化的發(fā)生。而c-Jun能夠通過自動調節(jié)和磷酸化作用，與TGF-β1啟動子上的特定位點結合，促進其轉錄表達從而加快腎臟纖維化的發(fā)生。動物實驗證實[34]，抑制c-Jun的表達可明顯改善DKD大鼠的腎臟損傷狀況。RELA是NF-κB家族的重要成員，通過調控下游靶基因轉錄參與細胞多種生命活動[35]。最新的證據(jù)表明[36-37]，RELA一方面可以通過蛋白質磷酸化調節(jié)激活轉錄因子增加TNF-α、IL6等炎性因子的釋放增強炎性反應;另一方面在系膜細胞中RELA通過乙?；せ頝F-κB信號通路，下調LC3-II從而抑制高血糖誘導的足細胞自噬，導致腎臟細胞炎性反應加劇和線粒體功能障礙，進一步損傷腎臟功能和形態(tài)。以上結論充分表明真武湯通過多分子、多靶點的模式有效治療DKD。

GO功能富集分析結果表示細胞凋亡、細胞增殖的調控、細胞膜外間隙、外源性凋亡信號通路、RNA聚合酶啟動子轉錄的正調控等生物過程與真武湯治療DKD存在密切聯(lián)系。KEGG通路富集分析結果顯示，真武湯治療DKD主要涉及TNF、Toll樣受體、HIF-1、FoxO、NF-κB等多條信號通路。TNF信號通路主要參與細胞生長、分化、凋亡、炎性反應誘發(fā)及免疫調節(jié)等生物學效應。TNF-α的過度分泌可刺激促炎細胞因子MCP-1和瘦素的增加，從而引起胰島素抵抗;另外，TNF-α能夠誘導蛋白激酶C（PKC）的活化，激活NADPH氧化酶，誘導產生ROS，促進氧化應激過程從而加速損傷腎臟[38]。Navarro JF等[39]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α拮抗藥可有效減少腎皮質中的TNF-α mRNA表達，從而明顯改善腎臟炎性狀態(tài)并降低蛋白尿。馬俊杰等[40]發(fā)現(xiàn)，真武湯能夠降低大鼠血清TNF-α水平緩解其腎臟炎性反應。Toll樣受體作為模式識別受體之一，參與調節(jié)機體免疫炎性反應，并發(fā)揮重要作用。TLR2/4主要表達于腎小管上皮細胞和腎小球系膜細胞中，高糖環(huán)境促進TLR2/4 mRNA表達，通過介導下游MyD88蛋白表達激活NF-κB增加炎性反應因子的轉錄;或直接激活免疫細胞及腎臟實質細胞，持續(xù)分泌大量炎性遞質、細胞因子加劇腎臟炎性反應，加速腎小球硬化[41]。研究證實[42]，真武湯可有效降低心腎陽虛證大鼠TLR2/TLR4蛋白在腎臟組織中的表達，減緩腎臟病變。低氧誘導因子（Hypoxia Inducible Factor，HIF）通過特異性調節(jié)某些基因、蛋白的表達使細胞適應低氧狀態(tài)。HIF-1能夠與低氧反應元件結合，激活低氧靶基因轉錄從而影響組織生長發(fā)育及應激反應[43]。在高糖環(huán)境中，組織處于持續(xù)缺氧狀態(tài)，腎臟組織應激性提高HIF-1的表達。HIF-1通過調節(jié)線粒體呼吸使局部組織ROS水平及細胞凋亡增加，促進缺氧適應性的產生從而降低組織在缺氧狀態(tài)下的損傷，以達到保護腎臟細胞的目的[44-45]。孫靜等[46]發(fā)現(xiàn)，真武湯能夠上調HIF-1α的表達，減輕腎小管上皮細胞的氧化損傷，減緩腎臟纖維化的過程。

本研究借助網絡藥理學研究方法，探討真武湯治療DKD的潛在作用機制，結果表明其涉及多成分、多靶點、多通路，是通過多途徑系統(tǒng)協(xié)同來發(fā)揮作用。然而，由于中藥組方中君臣佐使間配伍的復雜性，單純從以大數(shù)據(jù)、生物信息技術為基礎的網絡藥理學研究闡述其作用機制稍顯單薄。本研究旨在預測探討真武湯治療DKD的作用靶點及通路，為進一步明確真武湯治療DKD的作用機制提供了科學的依據(jù)。通過本研究篩選得到的基因靶點及真武湯通過調節(jié)免疫、炎性反應及低氧誘導等信號通路治療DKD的作用機制仍需進一步的實驗驗證，為其基礎和臨床應用提供理論依據(jù)。

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（2020-05-27收稿 責任編輯：徐穎）

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81973801）;首都衛(wèi)生發(fā)展科研基金重點攻關項目（首發(fā)2018-1-4161）作者簡介：布天杰（1995.08—），男，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治腎病內分泌疾病，E-mail：tmacbu@163.com通信作者：張寧（1963.09—），女，醫(yī)學博士，主任醫(yī)師，博士研究生導師，研究方向：中醫(yī)藥防治腎病內分泌疾病，Tel：（010）84739029，E-mail：znice3927@126.com