汪建茹， 楊進(jìn)波， 張 馳

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 襄陽(yáng) 441000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430030）

2019年12月底以來(lái)，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）[1]感染引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）在全球范圍內(nèi)迅速蔓延。SARSCoV-2具有較強(qiáng)的傳染性，并多呈家庭聚集性，給疾病的診斷和治療帶來(lái)較大壓力。目前，在國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中，將SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性作為COVID-19的確診依據(jù)[2]。但SARSCoV-2核酸檢測(cè)對(duì)于實(shí)驗(yàn)室條件、檢測(cè)人員素質(zhì)和樣本采集及運(yùn)輸要求較高，且在疫情暴發(fā)流行初期存在試劑盒質(zhì)量參差不齊、供應(yīng)不足、檢驗(yàn)人員易感染、檢測(cè)通量較低等缺點(diǎn)[3-4]。另外，SARS-CoV-2在引物設(shè)計(jì)上可參考的序列有限，且會(huì)出現(xiàn)變異，采樣人員培訓(xùn)不到位導(dǎo)致采樣不合格，采樣部位不同（肺泡灌洗液、痰液、鼻咽拭子）會(huì)導(dǎo)致敏感性出現(xiàn)差異[5-7]，這些因素都會(huì)導(dǎo)致SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的假陰性結(jié)果的增多，使部分疑似患者不能及時(shí)確診。人體在感染病原體后，免疫系統(tǒng)會(huì)針對(duì)病原體抗原產(chǎn)生特異性抗體，因此檢測(cè)患者血液中的特異性抗體也是一種常用的病原體快速診斷方法。基于膠體金免疫層析法（colloidal gold immunochromatography assay，CGIA）開(kāi)發(fā)的SARS-CoV-2抗體檢測(cè)試劑盒具有操作簡(jiǎn)單，無(wú)需設(shè)備，對(duì)檢測(cè)人員和環(huán)境無(wú)特殊要求等優(yōu)點(diǎn)，可用于COVID-19的快速篩查。本研究采用CGIA檢測(cè)血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體，評(píng)估其在COVID-19診斷中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年1月28日—2月29日湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院COVID-19患者173例，其中男83例、女90例，年齡（57.4±15.4）歲。173例患者中有140例為首次SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性，有33例首次SARS-CoV-2核酸檢測(cè)為陰性，連續(xù)追蹤后檢測(cè)結(jié)果由陰性轉(zhuǎn)陽(yáng)性，最終確診。COVID-19診斷符合國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[2]：（1）發(fā)病前2周內(nèi)有武漢市旅行史或居住史；或發(fā)病前14 d內(nèi)曾接觸過(guò)來(lái)自武漢市的發(fā)熱伴有呼吸道癥狀，或有聚集性發(fā)?。唬?）發(fā)熱，肺部影像學(xué)檢查結(jié)果異常（呈斑片狀、亞段或節(jié)段性磨玻璃影或病灶實(shí)變，磨玻璃影與實(shí)變影或條索影共存，累及多個(gè)肺葉；或雙肺彌漫性病變，少數(shù)呈“白肺”表現(xiàn)），初期血象白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞降低等；（3）痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等樣本SARSCoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性；滿(mǎn)足（3）以及（1）或（2）中的任意一條即可確診。選取同期湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院排除COVID-19的疑似患者101例（對(duì)照組），其中男59例、女42例，年齡（57.9±14.7）歲。對(duì)照組均有發(fā)熱、咳嗽等癥狀，但痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等樣本多次SARS-CoV-2核酸檢測(cè)為陰性，血象和肺部影像學(xué)特征不符，伴或不伴甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等陽(yáng)性。本研究經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（批件號(hào)：2020GCP018），并通過(guò)知情同意的豁免申請(qǐng)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采用含分離膠的黃頭真空采血管采集所有對(duì)象空腹靜脈血5 mL，室溫下靜置，待血液完全凝固后1 260×g離心5 min，分離血清，2～8 ℃保存，5 d內(nèi)完成檢測(cè)。如5 d內(nèi)無(wú)法完成，則需將樣本-20 ℃保存，凍融不超過(guò)3次。含懸浮纖維蛋白或聚合物的血清樣本離心后取上清液進(jìn)行檢測(cè)，溶血及其他微生物污染樣本不可進(jìn)行檢測(cè)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序采集所有對(duì)象的鼻咽拭子樣本，用于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)。所有樣本均用密封袋單個(gè)密封，并使用帶有醒目生物危害標(biāo)識(shí)的專(zhuān)業(yè)轉(zhuǎn)運(yùn)箱轉(zhuǎn)運(yùn)，從密封袋取出樣本進(jìn)行操作前須用75%乙醇噴霧消毒采樣容器外壁。

1.2.2 SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測(cè) 采用CGIA檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體，試劑盒由北京新興四寰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)操作?；驹恚篒gM抗體檢測(cè)卡在金標(biāo)墊上包被膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgM單克隆抗體膠體金標(biāo)記物，在硝酸纖維素膜上檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）位置包被重組SARS-CoV-2 Np抗原，質(zhì)控線(xiàn)（C線(xiàn)）位置包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗體；IgG抗體檢測(cè)卡在金標(biāo)墊上包被膠體金標(biāo)記的鼠抗人IgG（γ鏈）單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）位置包被重組SARSCoV-2 S蛋白抗原，質(zhì)控線(xiàn)（C線(xiàn)）位置包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗體。將適量的待檢血清樣本加入檢測(cè)卡的加樣孔，血清會(huì)在層析作用下向前移動(dòng)，當(dāng)血清中含有SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體時(shí)，該抗體就會(huì)與相應(yīng)的金標(biāo)抗體結(jié)合，形成金標(biāo)抗體+抗體免疫復(fù)合物，該免疫復(fù)合物在層析作用下繼續(xù)在硝酸纖維素膜上向前流動(dòng)。當(dāng)該免疫復(fù)合物經(jīng)過(guò)T線(xiàn)時(shí)與包被的重組SARSCoV-2 Np抗原/S蛋白抗原結(jié)合，形成復(fù)合物而凝集顯色，游離的金標(biāo)鼠抗人IgM單克隆抗體/IgG（γ鏈）抗體則與C線(xiàn)處包被的羊抗鼠IgG多克隆抗體結(jié)合而凝集顯色。判斷標(biāo)準(zhǔn)：T線(xiàn)和C線(xiàn)處均顯色判定為陽(yáng)性，僅C線(xiàn)處顯色判定為陰性。如C線(xiàn)未顯色，則表明檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。

1.2.3 SARS-CoV-2核酸檢測(cè) 選取SARSCoV-2 RNA基因序列中開(kāi)放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）作為擴(kuò)增靶區(qū)域，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）進(jìn)行檢測(cè)。SMART32自動(dòng)核酸提取儀、AGS4800型熒光PCR儀、SARS-CoV-2ORF1ab/N基因雙重核酸檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）的判讀標(biāo)準(zhǔn)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，出現(xiàn)可疑結(jié)果重新采樣復(fù)查。以同一份樣本中SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因至少1個(gè)靶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性判定為SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，多組間比較采用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Dunn's檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用配對(duì)資料McNemarχ2檢驗(yàn)。采用kappa一致性檢驗(yàn)評(píng)估核酸檢測(cè)結(jié)果與抗體檢測(cè)結(jié)果的一致性。以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算SARS-CoV-2抗體診斷COVID-19的敏感性、特異性、臨床總符合率等指標(biāo)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線(xiàn)評(píng)估SARSCoV-2抗體診斷COVID-19的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2 IgM抗體診斷COVID-19的準(zhǔn)確性

SARS-CoV-2 IgM抗體診斷COVID-19的敏感性為76.9%，漏診率（假陰性率）為23.1%；特異性為94.0%，誤診率（假陽(yáng)性率）為6.0%；臨床總符合率為83.2%（表1）。SARS-CoV-2 IgM抗體診斷COVID-19的結(jié)果與臨床診斷（金標(biāo)準(zhǔn)）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 23.67，P＜0.000 1）。SARS-CoV-2 IgM抗體與臨床診斷的kappa值[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）]為0.663（0.577～0.749）。

表1 SARS-CoV-2 IgM抗體與臨床診斷的比較

2.2 SARS-CoV-2 IgG抗體診斷COVID-19的準(zhǔn)確性

SARS-CoV-2 IgG抗體診斷COVID-19的敏感性為74.6%，漏診率（假陰性率）為25.4%；特異性為95.1%，誤診率（假陽(yáng)性率）為4.9%；臨床總符合率為82.1%（表2）。SARS-CoV-2 IgG抗體診斷COVID-19的結(jié)果與臨床診斷（金標(biāo)準(zhǔn)）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=29.47，P＜0.000 1）。SARS-CoV-2 IgM抗體與臨床診斷的kappa值（95%CI）為0.664（0.558～0.731）。

表2 SARS-CoV-2 IgG抗體與臨床診斷的比較

2.3 SARS-CoV-2 IgM抗體和IgG抗體診斷COVID-19的效能

ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 IgM抗體和IgG抗體診斷COVID-19 的曲線(xiàn)下面積（area under curve，AUC）（95%CI）分別為0.855（0.807～0.894）、0.848（0.800～0.888），二者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 SARS-CoV-2 IgM抗體和IgG抗體診斷COVID-19的ROC曲線(xiàn)

2.4 20例SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陰轉(zhuǎn)陽(yáng)患者的抗體檢測(cè)追蹤結(jié)果

對(duì)20例首次SARS-CoV-2核酸檢測(cè)為陰性者，每隔1 d進(jìn)行核酸、IgG抗體和IgM抗體的檢測(cè)，直至所有指標(biāo)均呈陽(yáng)性為止。如始終為陰性，最長(zhǎng)觀察時(shí)限為25 d。首次SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的時(shí)間為9.5（6.3～12.8）d，IgM抗體首次呈陽(yáng)性的時(shí)間為6.0（5.0～8.0）d，IgG抗體首次呈陽(yáng)性的時(shí)間為11.0（9.5～15.0）d。所有患者IgM抗體均為陽(yáng)性，有3例患者IgG抗體始終為陰性。SARSCoV-2核酸、IgG抗體和IgM抗體的陽(yáng)性檢測(cè)時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 20例首次SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陰性患者血清SARS-CoV-2核酸、IgG抗體、IgM抗體陽(yáng)性檢出時(shí)間

3 討論

SARS-CoV-2屬于冠狀病毒β屬的單鏈RNA病毒，有蛋白質(zhì)包膜，其顆粒呈圓形或橢圓形，直徑為60～140 nm，是冠狀病毒家族中第7個(gè)能夠感染人類(lèi)的成員，其家族成員還包括可引起嚴(yán)重呼吸道疾病的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，SARSr-CoV）和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（middle east respiratory syndrome-related coronavirus，MERSr-CoV）[8]。SARS-CoV-2具有極強(qiáng)的人際傳播能力，致死率為3.4%[9]，僅次于MERSr-CoV和SARSr-CoV。應(yīng)對(duì)COVID-19最好的策略是“早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療”，但疫情初期，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)存在采樣風(fēng)險(xiǎn)高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)能力不足、檢測(cè)敏感性不高等問(wèn)題，以致“三早”策略較難實(shí)施。本研究使用的基于CGIA開(kāi)發(fā)的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測(cè)試劑盒具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)需設(shè)備，對(duì)人員和環(huán)境無(wú)特殊要求等優(yōu)點(diǎn)，已成為診斷COVID-19的重要補(bǔ)充方法[2]。

有研究結(jié)果顯示，試劑盒參次不齊的質(zhì)量、不合格的采樣管、有問(wèn)題的取材、不同的RNA提取技術(shù)、患者用藥情況等均會(huì)導(dǎo)致SARS-CoV-2核酸檢測(cè)出現(xiàn)假陰性結(jié)果[3]，與本研究SARS-CoV-2核酸檢測(cè)情況（假陰性率為19%）相符。因此，對(duì)于高度疑似患者，應(yīng)進(jìn)行多次核酸檢測(cè)予以確認(rèn)。SARS-CoV-2抗體檢測(cè)不受樣本取材、采樣管、臨床用藥等因素的干擾，在一定程度上可規(guī)避核酸檢測(cè)的固有缺陷。本研究結(jié)果顯示，SARS-CoV-2抗體檢測(cè)的臨床符合度較高。對(duì)首次核酸陰性而后轉(zhuǎn)為陽(yáng)性的20例患者進(jìn)行追蹤觀察，結(jié)果顯示，有8例患者SARS-CoV-2 IgM抗體在5 d內(nèi)轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，另12例患者IgM在25 d內(nèi)全部轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)100%；SARS-CoV-2 IgM抗體的陽(yáng)性中位檢出時(shí)間為6.0 d，比核酸陽(yáng)性時(shí)間早3.5 d（核酸陽(yáng)性中位檢出時(shí)間為9.5 d），提示IgM抗體作為初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，在用于COVID-19早期診斷時(shí)可較好地彌補(bǔ)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的不足。20例患者中有17例（85.0%）SARS-CoV-2 IgG抗體在5 d后才出現(xiàn)陽(yáng)性，有3例患者25 d的追蹤期內(nèi)IgG抗體始終呈陰性；SARS-CoV-2 IgG抗體的陽(yáng)性中位檢出時(shí)間為11.0 d，比核酸陽(yáng)性時(shí)間晚1.5 d，這說(shuō)明IgG抗體一般只在感染后期或恢復(fù)期出現(xiàn)，可用于SARS-CoV-2既往感染情況的調(diào)查，也可用于患者康復(fù)后再次感染風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估[10-11]。值得一提的是，本研究中3例IgG抗體始終為陰性的患者均出現(xiàn)呼吸衰竭，需要機(jī)械通氣，屬于危重癥患者，可能其病情較重，病毒感染對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的損傷和抑制作用導(dǎo)致機(jī)體遲遲無(wú)法產(chǎn)生保護(hù)性IgG抗體。

本研究采用CGIA檢測(cè)SARS-CoV-2抗體的敏感性低于徐萬(wàn)洲等[12]的化學(xué)發(fā)光免疫分析法的敏感性，原因可能為本研究采用的是入院時(shí)的單次檢測(cè)數(shù)據(jù)，而血清學(xué)抗體檢測(cè)存在窗口期、個(gè)體免疫應(yīng)答差異等固有缺陷；也可能與檢測(cè)原理及金標(biāo)試劑盒本身的檢測(cè)性能有關(guān)。另外，有研究結(jié)果顯示，血清中較高的類(lèi)風(fēng)濕因子水平會(huì)對(duì)GICA和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM抗體產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性[13]。因此，臨床上采用SARS-CoV-2抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行疾病評(píng)估時(shí)，應(yīng)充分考慮假陰性和假陽(yáng)性的情況，并結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查結(jié)果、疫區(qū)接觸史、核酸檢測(cè)結(jié)果等因素進(jìn)行綜合考慮。

綜上所述，SARS-CoV-2抗體檢測(cè)具有較高的敏感性、特異性和臨床符合率，可彌補(bǔ)SARSCoV-2核酸檢測(cè)的不足，為COVID-19的診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后等方面提供更多的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。