趙登奇 孫亞天 黃建穎 宋亦超

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院/浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018)

西蘭花(Brassica oleraceaL.var.italicPlanch.)，又名青花菜、花椰菜、意大利芥藍(lán)等，為兩年生十字花科(Brassicaceae)草本植物。 西蘭花中生物活性成分含量豐富[1-2]，種類(lèi)繁多，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極佳[3-4]，對(duì)癌癥以及一些慢性疾病的預(yù)防和治療具有一定的作用[5-7]，深受消費(fèi)者青睞，已成為日常飲食以及醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)中的常見(jiàn)原料之一[8-9]，其需求量呈不斷上升的趨勢(shì)[10]。 然而在西蘭花相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)過(guò)程中，由于觀(guān)念不一致、產(chǎn)地設(shè)備條件和規(guī)則制度不完善等，造成西蘭花莖葉等大量廢棄物的產(chǎn)生[11]，這些廢棄物除小部分被用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料和提取蘿卜硫苷外[12]，大部分都未得到應(yīng)有的開(kāi)發(fā)利用，不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且也引發(fā)相應(yīng)的環(huán)境問(wèn)題。

研究表明，西蘭花莖葉廢棄物與其可食用部分相比，同樣含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分[13-14]。Jo 等[15]在西蘭花小花和花梗中發(fā)現(xiàn)了大量植物活性物質(zhì)；Liang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)西蘭花種子中含有大量蘿卜硫素；Mihailovic 等[17]發(fā)現(xiàn)十字花科植物的根、莖、梗、葉柄和葉子中含有豐富的多酚，其中地上部分多酚含量達(dá)到59.42 mg·g-1DW，Domínguez-Perles 等[18]也得到類(lèi)似的結(jié)果；Ferreira 等[19]研究發(fā)現(xiàn)西蘭花葉中含有豐富的蛋白質(zhì)。 若能將西蘭花廢棄物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和潛在的功能性成分研制成具有附加價(jià)值的產(chǎn)品，既能實(shí)現(xiàn)資源的再利用，又可以減緩廢棄物造成的眾多負(fù)面影響。 目前，關(guān)于西蘭花中活性成分的研究大多集中于其可食用部分，近幾年對(duì)西蘭花副產(chǎn)品的研究才逐漸深入，此外，對(duì)于西蘭花葉中生物活性成分的研究大多只針對(duì)某一種，同時(shí)進(jìn)行多種生物活性成分的研究尚鮮見(jiàn)。 本試驗(yàn)分別采取酶法、福林酚法、比色法、三氯乙酸/丙酮沉淀法等方法對(duì)西蘭花葉中的4 種生物活性成分的組成和含量進(jìn)行測(cè)定與分析，并選取盡可能接近田間廢棄的西蘭花葉，以期為西蘭花葉進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供一定的數(shù)據(jù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花葉于9-10 月份在杭州勾莊蔬菜批發(fā)市場(chǎng)獲得，所選西蘭花葉大小均勻、顏色略發(fā)黃、葉片基本完整、無(wú)明顯病斑。

蘿卜硫素標(biāo)品(純度＞95%)，上海百靈威化學(xué)試劑有限公司；沒(méi)食子酸(純度＞99%)，β-巰基乙醇、福林酚均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司；石油醚、乙酸乙酯、三氯乙酸、丙酮，均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白標(biāo)品(純度＞99%)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVPP)、三羥甲基氨基甲烷(trishydroxymethyl aminomethane，Tris)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)均為分析純，上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；槲皮素(純度＞99%)，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100 液相色譜儀、Waters T3 色譜柱，美國(guó)沃特世公司；UV-2550 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；2-16KL 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)西格瑪公司；Mini-PROTEIN Tetra System 電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；Labconco 立式冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO 公司；90-1 型恒溫磁力攪拌器，上?？凭珜?shí)業(yè)有限公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海儀電儀器有限公司；QL-861 漩渦震蕩儀，海門(mén)其林貝爾儀器有限公司；KQ5200LH 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；XL-60C 中藥粉碎機(jī)，杭州旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘿卜硫素提取及測(cè)定 參考Liang 等[16]和Campas-Baypoli 等[20]的方法并稍作修改。 西蘭花葉于冷凍干燥機(jī)中-50℃凍干24 h，之后使用中藥粉碎機(jī)打碎至粉末狀(粒徑為50 ～150 μm)。 稱(chēng)取凍干粉100.0 mg，加10.0 mL 石油醚脫脂過(guò)夜，用布氏漏斗真空抽濾得到濾餅，移入離心管中，加入5.0 mL 0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH 值6.0)，塞好管塞，混合均勻后于45℃水浴2 h，待冷卻至室溫再向離心管加入20.0 mL 乙酸乙酯，于磁力攪拌器上2 000 r·min-1攪拌15 min，之后加入1.0 g 氯化鈉促進(jìn)兩相分層，移取上層乙酸乙酯相于錐形瓶中；剩余組分繼續(xù)用乙酸乙酯萃取2 次，隨后合并乙酸乙酯相，加入適量的無(wú)水硫酸鈉除去殘留水分。 于35℃旋蒸去除乙酸乙酯，剩余物用1.5 mL 甲醇重新溶解，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，待高效液相色譜法( high performance liquid chromatography，HPLC)分析。

HPLC 條件:waters T3 色譜柱(3 μm，3.0 mm×150 mm)；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)241 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.4 mL·min-1；流動(dòng)相A:超純水，流動(dòng)相B:甲醇。 洗脫梯度:初始流動(dòng)相10%甲醇，35 min 內(nèi)線(xiàn)性變化至90%甲醇，35～45 min 甲醇保持90%。

1.3.2 總酚含量測(cè)定 參考Pajak 等[21]的方法，稱(chēng)取0.25 g 西蘭花葉凍干粉于離心管中，加入5.0 mL 無(wú)水甲醇，以2 000 r·min-1磁力攪拌30 min，隨后10 000×g、4℃離心20 min，收集上清液。 殘余物再用5.0 mL無(wú)水甲醇重復(fù)提取2 次，合并上清液于4℃冰箱保存待測(cè)。

移取1.0 mL 提取液于10 mL 容量瓶中，加入1.0 mL 福林酚試劑和2.0 mL 15%碳酸鈉溶液，加蒸餾水稀釋至刻度，室溫靜置1 h，于760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，通過(guò)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總酚含量，結(jié)果表示為mg·g-1DW。

1.3.3 總黃酮含量的測(cè)定 參照Guajardo-Flores等[22]的方法并稍作修改。 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g 西蘭花葉凍干粉，加入10 mL 60%乙醇溶液，以2 000 r·min-1磁力攪拌1 h，再經(jīng)超聲(70℃，100 W)提取1 h，5 000×g離心15 min，取上清液，殘余物重復(fù)提取1 次，合并上清液待測(cè)。

移取0.6 mL 提取液于25 mL 容量瓶中，加入0.5 mL 5% 亞硝酸鈉溶液，反應(yīng)6 min 后加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，反應(yīng)6 min 后加入4.0 mL 4% 氫氧化鈉溶液，最后加入60%乙醇定容至刻度線(xiàn)。 室溫靜置15 min，于357 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。 根據(jù)槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果表示為mg·g-1DW。

1.3.4 蛋白質(zhì)成分分析

1.3.4.1 總蛋白質(zhì)提取 參照Xu 等[23]和Tenorio等[24]的方法，采用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取總蛋白質(zhì)。 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.4 g 西蘭花葉凍干粉末于研缽中，加入0.2 g PVPP，再加入15.0 mL -20℃預(yù)冷的三氯乙酸/丙酮溶液(10%，v:v)，冰浴研磨10 min，隨后轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管，-20℃冰箱中靜置過(guò)夜。 將混合物于10 000×g、4℃離心20 min，取沉淀用預(yù)冷丙酮(含0.07%β-巰基乙醇)洗滌1 ～2 次，將所得沉淀物在-50℃條件下冷凍干燥24 h，于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?；將蛋白質(zhì)凍干粉加入5.0 mL 蛋白溶解液{(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，2% 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽[(3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio ) propanesulfonate， CHAPS )， 40 mmol·L-1二硫蘇糖醇( dithiothreitol， DTT)， 5 mmol·L-1EDTA-Na2， 1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)}復(fù)溶，振蕩讓其充分分散，于30℃水浴超聲1 h(功率700 W)，然后12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，采用Bradford 法進(jìn)行定量測(cè)定。

1.3.4.2 Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 mg 牛血清白蛋白以蒸餾水溶解并定容，得到濃度為100.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

西蘭花葉蛋白提取液蛋白質(zhì)含量測(cè)定:移取1.0 mL 樣品提取液，加入5.0 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液(適當(dāng)稀釋)，渦旋混勻，靜置10 min 后于590 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.3.4.3 SDS-PAGE 電泳分析 采用5%濃縮膠、12%分離膠、電極緩沖液為T(mén)ris-甘氨酸(pH 值8.3)系統(tǒng)。 樣品溶液按1 ∶1 比例與上樣緩沖液混合，振蕩混勻后加熱，離心后取上清上樣進(jìn)行電泳[25]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行測(cè)定，數(shù)據(jù)采用Excel 2016統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜硫素含量分析

由圖1 可知，蘿卜硫素色譜分離效果較好，其出峰時(shí)間均為13.383 min。 以蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，液相色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性回歸方程為y＝737.9x-12.996，R2＝0.999 6，表明在此濃度范圍內(nèi)該方法測(cè)定蘿卜硫素含量可以呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得西蘭花葉凍干樣品中蘿卜硫素轉(zhuǎn)化提取量為92.5 μg·g-1DW。

圖1 蘿卜硫素液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograph and the standard curve of sulforaphane

2.2 總酚含量分析

將提取得到的總酚樣品和沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與福林酚試劑混合反應(yīng)后，在200 ～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。 由圖2 可知，此方法在760 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰，因此選擇760 nm 作為其測(cè)定波長(zhǎng)。 吸光值關(guān)于沒(méi)食子酸濃度的線(xiàn)性回歸方程為y＝112.62x-0.022，R2＝0.999 5，表明此方法測(cè)定結(jié)果在該濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總酚含量，凍干樣品中總酚含量為3.15 mg·g-1DW。

2.3 總黃酮含量分析

圖2 福林酚法測(cè)定總酚含量紫外-可見(jiàn)光譜Fig.2 UV/VIS spectra of total phenolic content measured by the Folin-Ciocalteu method

將提取得到的總黃酮樣品及槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液系列與各試劑依次反應(yīng)后，在300 ～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖3 所示，在357 nm 波長(zhǎng)處出現(xiàn)最大吸收峰，因此選擇357 nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)。 吸光值關(guān)于槲皮素濃度的線(xiàn)性回歸方程為y＝0.015 6x＋0.676 6，R2＝0.999 7，表明在此濃度范圍內(nèi)該方法的測(cè)定結(jié)果呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到凍干樣品中總黃酮含量為2.48 mg·g-1DW。

圖3 硝酸鋁法測(cè)定總黃酮含量紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.3 UV/VIS spectra of total flavonoid content measured by the Al (NO3)3 method

2.4 蛋白質(zhì)成分分析

2.4.1 Bradford 法測(cè)定蛋白含量結(jié)果 將西蘭花葉蛋白樣品及牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液系列與考馬斯亮藍(lán)試劑混合反應(yīng)后，在200 ～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。 由圖4 可知，在590 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰，因此選擇590 nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)。 吸光值關(guān)于蛋白質(zhì)濃度的線(xiàn)性回歸方程為y＝0.005 9x＋0.053 7，R2＝0.998 5，表明在此濃度范圍內(nèi)該方法的測(cè)定結(jié)果呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到西蘭花葉中總蛋白含量為89.375 mg·g-1DW。

2.4.2 SDS-PAGE 電泳結(jié)果 由圖5 可知，西蘭花葉蛋白提取樣品中條帶眾多，但濃度最大的為核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大、小亞基(箭頭標(biāo)注條帶，分別為53 kDa 和14 kDa)。 表明西蘭花葉在提取Rubisco 蛋白質(zhì)方面具有巨大的潛力，若能采取適當(dāng)?shù)姆椒右岳?，既能充分利用資源又能帶來(lái)可觀(guān)的經(jīng)濟(jì)效益。

圖4 Bradford 法測(cè)定蛋白紫外-可見(jiàn)光譜Fig.4 UV/VIS spectra of proteins measured by Bradford method

圖5 西蘭花葉SDS-PAGE 結(jié)果Fig.5 Result of SDS-PAGE analysis of broccoli leaves

3 討論

西蘭花和羽衣甘藍(lán)均為甘藍(lán)種(B. oleracea)，但甘藍(lán)葉為可食用部分，而西蘭花葉卻很少被食用。 通常西蘭花被食用的部分不到農(nóng)作物整體的50%，其余皆為西蘭花廢棄物(莖、花序和葉子等部分)。 事實(shí)上這些廢棄物同樣是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源，均可以創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值[26]。

本研究從西蘭花葉中提取蘿卜硫素采用的是酶法，與Bertelli 等[27]采用的溶劑萃取方法和季宇彬等[28]提及的化學(xué)合成方法相比，更利于工廠(chǎng)的大規(guī)模生產(chǎn)。 本研究結(jié)果表明，西蘭花葉中蘿卜硫素含量為92.50 μg·g-1DW，而Liang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，西蘭花種子中蘿卜硫素含量為3 200.00 μg·g-1DW；Matusheski等[29]從西蘭花種子中制得蘿卜硫素產(chǎn)量可達(dá)到4 000.00 μg·g-1DW； Campas-Baypoli 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，西蘭花花莖中蘿卜硫素含量為97.00 μg·g-1DW，花序中最高為378.00 μg·g-1DW，說(shuō)明西蘭花其他部位中蘿卜硫素含量普遍高于西蘭花葉中蘿卜硫素的含量，特別是西蘭花種子。 另外，Campas-Baypoli 等[20]研究發(fā)現(xiàn)， 西蘭花葉中蘿卜硫素含量?jī)H為 39.00 μg·g-1DW，低于本研究所測(cè)結(jié)果，這可能與西蘭花產(chǎn)地、品種、栽培地氣候等多種因素有關(guān)。 盡管西蘭花葉中蘿卜硫素含量低于其他部位，但西蘭花葉子占據(jù)西蘭花全部副產(chǎn)物的大部分，若合理利用也可創(chuàng)造出一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

本研究表明，西蘭花葉中總酚和總黃酮的含量分別為3.15 和2.48 mg·g-1DW，這與Liu 等[30]、Thomas等[31]和Bhandari 等[32]的研究中得到的結(jié)果相差不大:Liu 等[30]對(duì)比了西蘭花不同部位中總酚含量的差異， 發(fā)現(xiàn)西蘭花葉中總酚含量最高( 4.14 mg·g-1DW)，是花序總酚含量(2.51 mg·g-1DW)的1.6 倍，是花莖總酚含量(1.41 mg·g-1DW)的2.9 倍；Bhandari 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，西蘭花莖中總酚含量介于1.42～4.01 mg·g-1DW 之間，說(shuō)明西蘭花葉中總酚含量相對(duì)其他部位來(lái)說(shuō)處于較高水平，因此有必要合理利用西蘭花葉來(lái)提取總酚，這樣不僅可以防止西蘭花葉的浪費(fèi)而且還能帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益。 黃酮類(lèi)化合物作為酚類(lèi)物質(zhì)中的一種，具有良好的抗氧化作用，Thomas等[31]研究發(fā)現(xiàn)西蘭花加工業(yè)廢棄物混合物中總黃酮含量為4.30 mg·g-1DW，而西蘭花莖中總黃酮含量為2.40 mg·g-1DW，一般來(lái)講，西蘭花廢棄物以葉、莖和花序?yàn)橹饕糠?，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為西蘭花葉也可用來(lái)提取黃酮類(lèi)物質(zhì)。 因此，西蘭花葉可作為總酚和總黃酮物質(zhì)的豐富來(lái)源，以實(shí)現(xiàn)西蘭花葉最大價(jià)值的利用。

總蛋白質(zhì)的提取方法是三氯乙酸/丙酮沉淀法，采用Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，操作簡(jiǎn)單，能有效去除西蘭花組織中的其他干擾物質(zhì)。 本研究結(jié)果表明，西蘭花葉中總蛋白含量為89.38 mg·g-1DW，SDS -PAGE 分析結(jié)果顯示Rubisco 占比最大。 Ferreira 等[19]研究發(fā)現(xiàn)西蘭花中含有大量的蛋白質(zhì)，其中西蘭花花莖中蛋白含量為92.00 mg·g-1DW，葉子(和花序)中則達(dá)到159.00 mg·g-1DW。植物葉蛋白作為一種功能性蛋白質(zhì)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，可能會(huì)成為食品產(chǎn)業(yè)新的蛋白質(zhì)來(lái)源[33]，同時(shí)眾多研究顯示Rubisco 具有良好的應(yīng)用前景[34-35]，因此西蘭花葉是一種有較大潛力的植物蛋白源。 綜上，西蘭花葉中活性物質(zhì)含量較為豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，如果對(duì)其功能性成分采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ崛〔⒐I(yè)化生產(chǎn)，將會(huì)產(chǎn)生非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究著重進(jìn)行了西蘭花葉中4 種生物活性成分分析和含量測(cè)定，結(jié)果表明，西蘭花葉是蘿卜硫素、酚類(lèi)、黃酮類(lèi)物質(zhì)和蛋白質(zhì)的優(yōu)秀來(lái)源，合理利用能帶來(lái)較高的經(jīng)濟(jì)效益，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用西蘭花葉提供了一定的數(shù)據(jù)參考。 本研究對(duì)西蘭花葉中生物活性成分的研究存在局限，后續(xù)可利用多種方法對(duì)西蘭花生物活性成分進(jìn)行檢測(cè)分析，進(jìn)一步對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行研究，全面揭示西蘭花廢棄物的利用價(jià)值。