黃 碩 畢艷紅 朱 春 王朝宇 張曉輝 趙希榮 韋潔玲

(淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安 223003)

糖苷是自然界普遍存在的一類具有重要生物學(xué)功能的次生代謝產(chǎn)物，在食品、化妝品及藥品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。 天然色素、揮發(fā)性香味化合物的前驅(qū)體及藥用植物藥劑中的主要成分大多屬于糖苷類化合物[1-2]。 因此，如何實(shí)現(xiàn)該類化合物的高效合成一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。

酶法合成糖苷具有反應(yīng)過程可控、選擇性高、條件溫和、工藝簡(jiǎn)單及產(chǎn)物純度高等優(yōu)勢(shì)，已逐漸成為糖苷合成領(lǐng)域的首選方法[4-6]。 糖苷水解酶是合成糖苷的重要酶類，其來源廣泛、性質(zhì)穩(wěn)定、底物譜廣，且可直接以非保護(hù)的糖作為反應(yīng)底物，通過逆水解反應(yīng)合成不同結(jié)構(gòu)的糖苷[7]。 近年來，研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)植物組織中種類繁多的糖苷水解酶可高效、高選擇性的催化糖苷的合成，如Yang 等[8]考察了11 種植物源β-葡萄糖苷酶催化7 種糖苷的合成過程，發(fā)現(xiàn)西梅籽β-葡萄糖苷酶合成乙基β-D-葡萄糖苷的產(chǎn)率高達(dá)78%。 此外，有研究發(fā)現(xiàn)，植物源β-葡萄糖苷酶的葡萄糖抑制常數(shù)通常為0.6 ～8.0 mmol·L-1，與微生物源β-葡萄糖苷酶相比具有更高的葡萄糖耐受性和潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[9]。 盡管植物源β-葡萄糖苷酶在合成糖苷方面具有優(yōu)越性，但其在有機(jī)溶劑中仍然存在穩(wěn)定性較差、回收利用困難等問題[10]。 因此，尋求β-葡萄糖苷酶的有效固定化方式將是解決上述問題的策略之一。

2000 年Sheldon 課題組首次提出了無載體的交聯(lián)酶聚合物(cross-linked enzyme aggregates， CLEAs)概念[11]。 該方法可通過改變液態(tài)酶的溶解性質(zhì)而使其物理沉降，隨后再利用雙功能試劑使酶蛋白直接相互連接，具有簡(jiǎn)單快速、原料廉價(jià)、單位體積酶活高以及對(duì)蛋白純度要求低等特點(diǎn)[12]。 Yu 等[13]將制備的綠豆環(huán)氧化物酶CLEAs 用于環(huán)氧苯乙烯的不對(duì)稱水解反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)與游離酶相比，該酶具有反應(yīng)速度更快、產(chǎn)率和對(duì)映體選擇性更高的特點(diǎn)；慕洋洋等[14]對(duì)青霉素?；高M(jìn)行了交聯(lián)固定化，發(fā)現(xiàn)其最適催化溫度、pH和穩(wěn)定性均有顯著提高。 制備β-葡萄糖苷酶CLEAs并探究其穩(wěn)定性的研究尚鮮見報(bào)道，因此，本研究以黑布林籽β-葡萄糖苷酶為目標(biāo)蛋白，在對(duì)其CLEAs 制備過程進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)其熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性進(jìn)行詳細(xì)研究，旨在為該酶的規(guī)模化應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑布林，市售。 紅景天苷標(biāo)品、對(duì)羥基苯乙醇、對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl β-Dglucopyranoside，pNPG)、戊二醛和對(duì)硝基苯酚，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，購自北京索萊寶科技有限公司。 其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Agilent1100 型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent Technologies 公司；S-3000N 型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；T6 型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；5804R 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；FA2004 型電子天平，上海菁海儀器有限公；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；GT2-8 型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)SRK 系統(tǒng)技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶的制備 將黑布林籽充分研磨，分別加入預(yù)冷(-20℃冰箱內(nèi)放置2.0 h)的乙酸乙酯和丙酮攪拌脫脂1 ～2 次，晾干后過60 目篩得到粗酶粉；之后加入少量二氧化硅及磷酸鹽抽提液(50 mmol·L-1，pH 值7.4，含有1 mmol·L-1EDTA 及100 mmol·L-1氯化鈉)研磨15 min，轉(zhuǎn)移至燒杯中溫和攪拌(4℃)1.0 h，經(jīng)離心(4℃、10 000 r·min-1、15 min)后取上清液得到粗酶液。

在冰浴條件下，將硫酸銨粉末加入到一定量的粗酶液中，使其飽和度至40%，攪拌30 min 后離心(4℃、10 000 r·min-1、15 min)；取上清液，再次加入硫酸銨，至飽和度為65%，取離心沉淀溶于Tris-HCl 緩沖液(50 mmol·L-1，pH 值7.4)中透析過夜。 濾膜過濾透析液，上樣至DEAE-52 陰離子交換柱(1.6 cm×20 cm)，用含氯化鈉濃度分別為0.10、0.15 和0.20 mol·L-1的Tris-HCl 緩沖液洗脫(1.5 mL·min-1)，制得β-葡萄糖苷酶。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶CLEAs 的制備及制備條件的優(yōu)化 取一定量的β-葡萄糖苷酶液緩慢加入預(yù)冷的沉降劑，溫和攪拌后聚集30 min；之后加入戊二醛交聯(lián)一定時(shí)間，離心(4℃，6 000 r min-1，10 min)后用Tris-HCl緩沖液(50 mmol·L-1，pH 值7.4)洗滌2 次，制得β-葡萄糖苷酶CLEAs。

1.3.2.1 沉降劑的確定 取1.0 mL β-葡萄糖苷酶液加入4.0 mL 預(yù)冷的不同種類沉降劑，包括甲醇、95%乙醇、二惡烷、正丙醇、異丙醇、無水乙醇、丙酮、四氫呋喃(tetrahydrofuran， THF)、N，N-二甲基甲酰胺( N， N-dimethylformamide， DMF)、 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide， OMSO)，以上述方法制得β 葡萄糖苷酶CLEAs 并測(cè)定酶活性。 探究不同種類沉降劑對(duì)β-葡萄糖苷酶CLEAs 活性的影響。

1.3.2.2 沉降劑比例的確定 確定沉降劑種類后，改變沉降劑與酶液的比例(1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1)，以上述方法制得β-葡萄糖苷酶CLEAs 并測(cè)定酶活性。探究沉降劑比例對(duì)β-葡萄糖苷酶CLEAs 活性的影響。

1.3.2.3 戊二醛濃度的確定 其他操作條件及方法不變，改變戊二醛濃度( 10、 20、 30、 40 和50 mmol·L-1)，以上述方法制得β-葡萄糖苷酶CLEAs并測(cè)定酶活性。 探究戊二醛濃度對(duì)β-葡萄糖苷酶CLEAs 活的影響。

1.3.2.4 交聯(lián)時(shí)間的確定 在確定戊二醛濃度后，其他操作條件及方法不變，改變戊二醛交聯(lián)時(shí)間(0.5、1、2、3 和4 h)，以上述方法制得β-葡萄糖苷酶CLEAs 并測(cè)定酶活性。 探究交聯(lián)時(shí)間對(duì)β-葡萄糖苷酶CLEAs活性的影響。

1.3.3 酶活性的測(cè)定 將一定量的β-葡萄糖苷酶液或其CLEAs 置于3.0 mL(含15.0 μL 濃度為200 mmol·L-1的pNPG)的檸檬酸-磷酸氫鈉緩沖液中(50 mmol·L-1，pH 值7.4)啟動(dòng)反應(yīng)，5 min 后加入3.0 mL 1.0 mol·L-1的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)液中對(duì)硝基苯酚含量。 以每分鐘β-葡萄糖苷酶水解釋放1 μmol 對(duì)硝基苯酚所需酶量為1 個(gè)酶活單位。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶CLEAs 的結(jié)構(gòu)特征 將β-葡萄糖苷酶CLEAs、粗酶粉及游離酶經(jīng)真空冷凍干燥(冷阱溫度-45℃，真空度0.01 kPa，干燥時(shí)間24 h)后，用掃描電子顯微鏡觀察其表面結(jié)構(gòu)。

1.3.5 酶促合成紅景天苷的研究 向7 個(gè)反應(yīng)瓶中分別加入1.6 mL 丙酮、二惡烷、叔丁醇、THF、DMF、OMSO 和乙腈有機(jī)溶劑，0.4 mL 磷酸鹽緩沖液(50 mmol·L-1，pH 值6.0)，0.5 mmol 葡萄糖和5.0 mmol對(duì)羥基苯乙醇，將其置于恒溫振蕩器內(nèi)(50℃，200 r·min-1)預(yù)熱30 min，之后加入6.0 U β-葡萄糖苷酶CLEAs 啟動(dòng)反應(yīng)。 定時(shí)取樣20 μL，加入流動(dòng)相稀釋50 倍，于275 nm 波長(zhǎng)處用高效液相色譜儀測(cè)定紅景天苷的產(chǎn)率。 流動(dòng)相為甲醇-水(60 ∶40，v ∶v)，流速為1.0 mL·min-1， 紅景天苷保留時(shí)間為2.47 min。

1.3.6 β-葡萄糖苷酶CLEAs 熱穩(wěn)定性的測(cè)定 在反應(yīng)瓶中分別各加入1.6 mL 二惡烷、0.4 mL 磷酸鹽緩沖液(50 mmol·L-1，pH 值6.0)、6.0 U β-葡萄糖苷酶CLEAs，置于恒溫振蕩器內(nèi)(200 r·min-1)于不同溫度(40～60℃)下保溫2.0 h，過濾除去溶劑，自然干燥4.0 h 后測(cè)定其剩余酶活性。

1.3.7 β-葡萄糖苷酶CLEAs 的操作穩(wěn)定性測(cè)定 1.3.5 中酶促反應(yīng)結(jié)束后，過0.45 μm 有機(jī)濾膜除去溶劑，用新鮮反應(yīng)溶劑洗滌β-葡萄糖苷酶CLEAs 2次，自然干燥4.0 h 后，再次加入至新鮮反應(yīng)體系中，在相同條件下啟動(dòng)酶促紅景天苷的合成反應(yīng)，并測(cè)定每次的剩余酶活性，重復(fù)操作數(shù)批次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2010 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Origin 8.5 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉降劑對(duì)β-葡萄糖苷酶CLEAs 活性的影響

在酶蛋白溶液中添加適宜的沉降劑如無機(jī)鹽、有機(jī)溶劑或非離子型高分子聚合物可改變?nèi)芤后w系的介電常數(shù)或蛋白的水合狀態(tài)，從而降低蛋白分子在溶液中的溶解度，引起蛋白分子聚集而形成非共價(jià)結(jié)合的超分子結(jié)構(gòu)[15]。 良好的沉降劑應(yīng)能使溶液狀態(tài)的酶完全析出，且對(duì)酶活性的影響較小。

圖1 沉降劑對(duì)CLEAs 活性的影響Fig.1 Effect of different precipitation on the activity of CLEAs

由圖1 可知，沉降劑的理化特性對(duì)β-葡萄糖苷酶CLEAs 活性影響較大。 當(dāng)以強(qiáng)極性溶劑如甲醇、丙酮、DMSO 和DMF 為沉降劑時(shí)，剩余酶活性僅為5.9%～21.5%，酶活性損失嚴(yán)重，不宜作為該酶溶液的沉降劑。 二惡烷、正丙醇、異丙醇、無水乙醇以及THF 雖然對(duì)酶分子的損傷較小，但酶活回收率仍較低(40.8%～58.9%)；而當(dāng)沉降劑為95%乙醇時(shí)，β-葡萄糖苷酶CLEAs 的酶活回收率最高， 達(dá)70.8%。 此外，在CLEAs 制備過程中，沉降劑濃度也是影響蛋白沉降效率的重要參數(shù)，過多的沉降劑會(huì)影響蛋白分子之間的相互作用和聚集狀態(tài)，導(dǎo)致酶失去活力[16-17]。 由圖2可知，當(dāng)95%乙醇的添加量是酶液體積的3 倍時(shí)，獲得的β - 葡萄糖苷酶 CLEAs 的酶活回收率最高(79.5%)，效果最好。 故后續(xù)試驗(yàn)選擇95%乙醇作為沉降劑，添加量為酶液體積的3 倍。

圖2 沉降劑比例對(duì)CLEAs 活性的影響Fig.2 Effect of different volume ratios of precipitant to enzyme liquid on the activity of CLEAs

2.2 戊二醛交聯(lián)劑對(duì)β-葡萄糖苷酶CLEAs 活性的影響

戊二醛是一種廉價(jià)易得的交聯(lián)劑，由于其分子較小，極易與蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基相互作用，使得蛋白分子緊密結(jié)合，因而廣泛用于蛋白的交聯(lián)[12，18]。 研究表明，交聯(lián)劑的濃度和交聯(lián)時(shí)間均會(huì)影響CLEAs 的大小和活性[19-21]。 由圖3 可知，當(dāng)戊二醛濃度由10 mmol·L-1逐漸增加至50 mmol·L-1時(shí)，β-葡萄糖苷酶CLEAs 的酶活回收率呈先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)戊二醛濃度為30 mmol·L-1時(shí)，β-葡萄糖苷酶CLEAs 的酶活回收率高達(dá)91.4%；當(dāng)戊二醛濃度為50 mmol·L-1時(shí)，酶活回收率降低至69.9%。 由此可見，戊二醛的濃度過低或過高均會(huì)導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶CLEAs 活性的損失。 與之類似，交聯(lián)時(shí)間也會(huì)對(duì)β-葡萄糖苷酶CLEAs 活性產(chǎn)生影響，在所考察的范圍內(nèi)，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為1.0 h 時(shí)，酶活回收率最高(圖4)。

2.3 β-葡萄糖苷酶CLEAs 的結(jié)構(gòu)特征結(jié)果

圖3 戊二醛濃度對(duì)CLEAs 活性的影響Fig.3 Effect of different glutaraldehyde concentrations on the activity of CLEAs

圖4 交聯(lián)時(shí)間對(duì)CLEAs 活性的影響Fig.4 Effect of different cross-linking time on the activity of CLEAs

CLEAs 是否具有適宜的大小和豐富的孔道結(jié)構(gòu)是決定其制備成功與否的關(guān)鍵。 Schoevaart 等[15]研究表明，不同種類的CLEAs 存在2 種類型，一種是表面糖基化率低且疏水性基團(tuán)多，而另一種則是表面糖基化程度高且親水性基團(tuán)豐富。 由圖5-A 可知，黑布林籽粗酶粉表面呈較大的顆粒狀，表面光滑；而游離酶交聯(lián)前則表面粗糙(圖5-B)，呈層狀結(jié)構(gòu)。 經(jīng)交聯(lián)固定化后(圖5-C)，CLEAs 屬于上述第二種類型，表面為無定型的致密多孔道結(jié)構(gòu)，與交聯(lián)前相比擁有更大的比表面積，酶分子可與底物結(jié)合的活性位點(diǎn)更多，有助于降低底物的擴(kuò)散限制，提高催化效率。

圖5 不同形式β-葡萄糖苷酶電鏡掃描結(jié)果(10 000×)Fig.5 Scanning electron mircophotographs of different forms of β-glucosidase (10 000×)

2.4 β-葡萄糖苷酶CLEAs 合成紅景天苷的研究結(jié)果

以有機(jī)介質(zhì)中紅景天苷的合成為模型反應(yīng)，對(duì)比研究了有機(jī)介質(zhì)中不同形式β-葡萄糖苷酶對(duì)合成紅景天苷的影響。 由表1 可知，對(duì)于同一溶劑中不同酶的催化特性而言，CLEAs 的催化效果最佳，其次是粗酶粉，而游離酶的效果最差。 其中，CLEAs 在二惡烷中表現(xiàn)出最高的催化活力，反應(yīng)72 h 后，紅景天苷的產(chǎn)率達(dá)到21.7%。 Laane 等[22]認(rèn)為酶在極性參數(shù)2＜logP＜4 的溶劑中表現(xiàn)出中等活性，而在logP＜2 的溶劑中酶活較低，在logP＞4 的溶劑中酶活較高。 本研究結(jié)果與上述規(guī)律不相符。 Yang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，除溶劑極性對(duì)酶分子表面必需水的影響外，溶劑分子的大小、空間結(jié)構(gòu)及進(jìn)出酶活性中心的能力也是重要的影響因素。 不同形式存在的酶其空間構(gòu)型不同，從而影響有機(jī)溶劑進(jìn)入酶分子活性位點(diǎn)的難易程度，進(jìn)而影響酶的催化過程。

2.5 β-葡萄糖苷酶CLEAs 的穩(wěn)定性研究結(jié)果

穩(wěn)定性參數(shù)是衡量固定化酶能否滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求的重要指標(biāo)，具有較高穩(wěn)定性的酶在應(yīng)用過程中可降低生產(chǎn)成本，并實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、自動(dòng)化的生產(chǎn)操作。將游離酶和CLEAs 分別在不同溫度下保溫一定時(shí)間后比較酶活回收率發(fā)現(xiàn)(圖6)，保溫溫度較低時(shí)(40 ～50℃)，二者之間的酶活回收率相差不大；但在60℃保溫2.0 h 后，CLEAs 的酶活回收率為75.1%，是游離酶的6.1 倍，表明CLEAs 有著較好的溫度耐受性和更寬的耐熱范圍。 同樣，盡管隨著使用批次的增加，CLEAs酶活回收率呈逐漸下降的趨勢(shì)，但在重復(fù)使用8 次后，其酶活回收率仍然保持為原來的73.5%(圖7)，表明CLEAs 具有良好的操作穩(wěn)定性，這有助于降低催化劑工業(yè)化使用的成本和滿足連續(xù)化操作的要求。

表1 不同的形式β-葡萄糖苷酶對(duì)合成紅景天苷的影響Table 1 Effect of different forms of β-glucosidases on the synthesis of salidroside

圖6 CLEAs 的熱穩(wěn)定性Fig.6 The thermal stability of CLEAs

圖7 CLEAs 的操作穩(wěn)定性研究Fig.7 The operational stability of CLEAs

3 討論

蛋白沉降劑是影響CLEAs 制備的關(guān)鍵因素，強(qiáng)極性沉降劑容易剝奪酶分子表面的結(jié)合水，會(huì)致其“柔性”降低，從而引起沉降酶蛋白的活性喪失[24-25]。 同時(shí)，針對(duì)不同的酶蛋白其最適沉降劑種類也會(huì)改變，如邢肖肖等[26]研究表明，β-半乳糖苷酶的最適沉降劑為異丙醇，區(qū)曉陽等[27]研究表明，堿性蛋白酶的最適沉降劑為90%叔丁醇。 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的最佳沉降劑為95%乙醇，而且沉降劑還會(huì)影響β-葡萄糖苷酶CLEAs 的形態(tài)，如以95%乙醇作為最優(yōu)沉降劑所制備的CLEAs 經(jīng)離心重懸后，可得顆粒均一、分散較好的懸濁液，且可以緩慢地自發(fā)沉降，這有利于固定化酶的分離及回收利用，而其他沉降劑制備的CLEAs在溶液中顆粒大小不一，分散性較差。

此外，諸多研究表明，戊二醛濃度對(duì)CLEAs 的活性有影響[18-19，26-28]。 較低濃度的戊二醛會(huì)導(dǎo)致蛋白交聯(lián)不充分，CLEAs 中酶蛋白的含量較低；而戊二醛濃度過高則會(huì)導(dǎo)致蛋白過度交聯(lián)，使CLEAs 的“剛性”較強(qiáng)，傳質(zhì)阻力增加，致使酶的活性降低[29]。

掃描電鏡觀察酶的表面結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，與粗酶粉和游離酶相比，CLEAs 表面呈無定型的致密多孔道結(jié)構(gòu)，且具有更大的比表面積，這種酶結(jié)構(gòu)可提供更多與底物結(jié)合的活性位點(diǎn)，更利于底物、產(chǎn)物的擴(kuò)散和CLEAs催化效率的提升。

本研究以酶促紅景天苷合成體系為反應(yīng)模板進(jìn)一步探討CLEAs 在實(shí)際應(yīng)用中的效果，結(jié)果顯示游離態(tài)的酶分子更容易受到有機(jī)溶劑的影響，進(jìn)而影響酶活性中心的“柔性”結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活性損失較大[30]；雖然粗酶粉中含有的脂質(zhì)、雜蛋白等成分有助于減弱有機(jī)溶劑對(duì)酶分子帶來的損傷，在一定程度上維持酶的活性，但其催化產(chǎn)率較低。 本研究發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶經(jīng)交聯(lián)固定化后，除具有優(yōu)良的表面結(jié)構(gòu)外，其適宜的“剛性”結(jié)構(gòu)可有效抵御有機(jī)溶劑對(duì)酶蛋白分子的失活作用，解決游離酶在合成紅景天苷過程中不穩(wěn)定的問題，最終提高該酶在有機(jī)溶劑中合成紅景天苷的效率。 這與邢肖肖等[26]利用β-半乳糖苷酶CLEAs 制備功能性低聚半乳糖、陳海龍等[18]利用脂肪酶CLEAs合成月桂酸淀粉酯、董守利等[28]使用交聯(lián)熒光假單胞菌脂肪酶聚集體催化甘油解制備甘油二酯等的研究結(jié)果相一致，CLEAs 具有比游離酶更好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，通過沉降交聯(lián)制備CLEAs 是一種較好的無載體固定化酶的方法。

4 結(jié)論

本研究通過考察沉降劑和交聯(lián)劑等因素制備了具有高酶活回收率的β-葡萄糖苷CLEAs，并以此為催化劑建立了高效合成紅景天苷的體系，該固定化糖苷酶具有高效、高選擇性合成糖苷類化合物的能力及良好的熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。 本研究不僅深化了交聯(lián)固定化酶領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論知識(shí)，也為糖苷類化合物的綠色合成提供了新途徑，具有重要的理論研究和工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。