王 丹 張 靜 賈曉曼 翟 浩

(山東省果樹研究所，山東 泰安 271000)

甜櫻桃(Prunus aviumL.)又名大櫻桃，薔薇科李屬(Prunus salicina)，于19 世紀70 年代在中國開始栽培，目前是中國北方地區(qū)露地栽培最早成熟的落葉果樹[1]。 甜櫻桃果大味美，具有較高的營養(yǎng)價值，已成為中國消費增長最快的水果之一[2]。 但甜櫻桃皮薄、柔軟、多汁，易受機械損傷，加之其采收多在高溫高濕季節(jié)，致使采前及貯運過程中潛伏的微生物繁殖速率加快，易導(dǎo)致果實腐爛變質(zhì)，失去商品價值[3-4]。 據(jù)報道，每年因病原真菌引起的甜櫻桃采后腐爛損耗在25%以上[5]。 因此，對甜櫻桃果實采后主要真菌致病菌的分離鑒定，是選擇采后防腐保鮮方法的前提，明確甜櫻桃采后病害種類和發(fā)生規(guī)律，對于制定有效的防治措施尤為重要。

目前，化學(xué)藥劑防治仍然是降低果蔬采后病害的主要措施，但致病菌的耐藥性不斷增加，且易引發(fā)安全問題，因此研究人員將致病菌的防治轉(zhuǎn)向來源廣泛的植物源抑菌劑[6-7]。 植物精油(plant essential oil)是從植物中提取的含萜烯類、醛類、酯類、醇類等芳香化學(xué)成分的混合物，作用方式主要有熏蒸、噴施、浸泡[8-9]。研究表明，植物精油不僅具有較強的抑菌活性，而且其抑菌機制呈多靶點效應(yīng)，因此，植物精油較化學(xué)殺菌劑更為安全高效，不易產(chǎn)生抗性[10]。 近年來，植物精油及其主要功能成分對果蔬采后病原菌的抑制作用在國內(nèi)外已有諸多報道，證明其能顯著降低采后病害的發(fā)生[11-13]。 丁香精油提取自植物丁香(Syzygium aromaticumL.)的葉子或花苞，具有抗菌和抗氧化作用，特別是對食源性細菌如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)[14]和真菌如灰葡萄孢 菌(Botrytis cinerea)、擴展青霉(Penicillium expansum)、黑曲霉(Aspergillus niger)[15]等抑制效果顯著。 此外，植物精油還具有一定的抗自由基及金屬螯合作用，其主要作用組分為丁香酚(4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)和一些其他酚類化合物[14]。

國內(nèi)外報道的從采后甜櫻桃果實分離到的主要真菌病原體有核盤菌(Sclerotinia sclertiorum)、鏈格孢菌(Alternaria alternata)、 螺旋聚孢霉(Clonostachyssp.)和毛霉菌(Mucorsp.)[10，16]。 關(guān)于植物精油作用于櫻桃采后病原菌的報道不多，且缺乏較系統(tǒng)的深入研究。 本研究從山東泰安地區(qū)主栽品種紅燈甜櫻桃中分離優(yōu)勢致病菌，采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法并結(jié)合ITS 序列分析對病原菌進行鑒定；選用丁香精油對主要致腐菌的抑制作用及抑菌機理進行深入探討，以期為甜櫻桃采后病害的綠色防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試甜櫻桃為山東泰安地區(qū)主栽品種紅燈，于2017年5月22日采摘。 挑選無機械損傷、無腐爛且成熟度一致(八到九成熟)的果實，室溫放置，待發(fā)病后分離病原菌進行后續(xù)試驗。 丁香精油提取自丁香花苞，購自廣州恒信香料有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SPX- 320 生化培養(yǎng)箱， 寧波江南儀器廠；GR110DR 全自動高壓滅菌鍋，美國ZEALWAY 公司；PowerPac Basic 電泳儀、S1000 PCR 儀，美國BioRad 公司；3730XL全自動 DNA測序儀，美國 Applied Biosystems 公司；ChamlGel 6000 全自動凝膠成像分析系統(tǒng)，美國SAGE CREATION 公司；UV/Vis 分光光度計，日本島津公司；SU8020 掃描電鏡，日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 優(yōu)勢病原真菌的分離純化 參照《植病研究方法》[17]，采集自然發(fā)病果實上病健交界處約2 mm組織，用75%醫(yī)用酒精表面消毒30 s，然后用無菌水沖洗孢子接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基上，26℃恒溫培養(yǎng)，繼續(xù)純化至連續(xù)3 次純化過程均無其他菌落出現(xiàn)。

1.3.2 形態(tài)鑒定 將純化菌株接種于PDA 培養(yǎng)基，26℃恒溫箱培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡下觀察菌落顏色、形狀及菌絲疏密性。 培養(yǎng)5 ～7 d，待產(chǎn)孢后觀察并記錄孢子形態(tài)和結(jié)構(gòu)，并測量孢子大小。

1.3.3 ITS 序列鑒定 采用CTAB 法提取菌株DNA，應(yīng)用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對病原菌進行PCR 擴增。 擴增程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72℃終延伸10 min。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對分析，搜索同源性較高的已知序列，用DNAMAN 軟件對已知序列計算相似性；利用MEGA 5.2 軟件以鄰接(neighbor-joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 丁香精油體外抑菌試驗 熏蒸試驗:將培養(yǎng)7 d 的直徑7 mm 的菌餅接種于玻璃培養(yǎng)皿(直徑75 mm×高度20 mm，加入12.5 mL PDA 培養(yǎng)基后，可提供37.5 mL 空間)，取滅菌的濾紙片(直徑30 mm)貼附于蓋子內(nèi)表面中心，將不同量的丁香精油(1.5 ～4.5 μL/皿)滴加于濾紙片，快速蓋上蓋子，精油的最終濃度分別為40、60、80、100、120 μL·L-1。 對照組除不加精油外，其他處理均一致。 所有平板于26℃條件下倒置培養(yǎng)4 d。

接觸試驗:使用10 mL 0.2%吐溫80 分散適量的精油，在PDA 培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿之前，迅速加入到50 mL PDA 中，使其最終體積為15 mL/皿，4 個重復(fù)，設(shè)置精油的最終濃度分別為200、400、600、800 μL·L-1。對照組用同樣量的吐溫80 與PDA 混合，不加精油。將培養(yǎng)7 d、直徑7 mm 的菌餅接種于玻璃培養(yǎng)皿。 所有平板于26℃條件下倒置培養(yǎng)4 d。

以48 h 內(nèi)抑制率100%的最低精油濃度為其最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration， MIC)。 每個處理4 次重復(fù)。 按照公式計算抑菌率:

1.3.5 孢子萌發(fā)試驗 參照Singh 等[18]的方法。 吸取一定量的丁香精油溶于0.2% 吐溫80 中，充分乳化，待用。 在PDA 平板上刮取孢子，加馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth，PDB)培養(yǎng)基稀釋至濃度為2×105的菌懸液(血球計數(shù)法)。 各取2 mL 加入到15 mL 玻璃試管中，再加入乳化后的精油(0.5 mL/管)，使精油最終濃度達100、200、400、800 μL·L-1，以未加精油為對照組。 所有試管置于28℃、200 r·min-1恒溫回轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)20 h，用普通光學(xué)顯微鏡觀察至少200個孢子(每個平行)，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率及芽管長度。 每個處理3 個平行。

1.3.6 細胞膜透性試驗 向0.2%吐溫80 溶液中加入一定量的丁香精油，使其充分乳化。 取5 mL 加入到含有50 mL PDB 培養(yǎng)基的搖瓶中，使精油終濃度為100、200、300、400 μL·L-1，以未加精油為對照組。 向每個搖瓶中加入0.1 mL 孢子懸浮液(1×107mL-1)。將懸浮液于28℃、200 r·min-1孵育5 d。 將收集的樣品4 000 r·min-1離心15 min 獲得上清液，分光光度計測量260 nm 波長處的吸光度值。

同時，將具有相同重量的上述沉淀的菌絲研磨，于4 000 r·min-1離心5 min 獲得上清液，采用考馬斯藍染色測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.7 丁香精油的氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)成分分析 氣相色譜條件:Agilent-7890 色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度為250℃，柱室溫度以5℃·min-1的速率從50℃(保持2 min)升至260℃(保持10 min)，進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件:接口溫度280℃，電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃。 數(shù)據(jù)采集模式:全掃描模式，掃描范圍10 ～550 amu。 精油的主要成分通過比較其相對保留時間來匹配其質(zhì)譜庫(D.01.00NlST98)，從而確定具體對應(yīng)的物質(zhì)。

1.3.8 掃描電鏡觀察菌絲形態(tài) 取丁香精油(300 μL·L-1)接觸處理YT3 菌絲3 h，用2. 5%戊二醛溶液固定24 h，然后依次放入濃度為50%、75%、100%的乙醇中逐級脫水20 min。 采用臨界點干燥法進行樣品的干燥，噴金處理。 在掃描電鏡下觀察樣品并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Excel 2010 與DPS 16.05 軟件對結(jié)果進行方差分析和顯著性檢驗(Duncan 新復(fù)極差法)。 試驗結(jié)果為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜櫻桃采后主要病原菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)鑒定 由圖1-A、B 可知，YT1 在PDA 培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，邊緣規(guī)則，菌絲初為白色絨狀，后顏色變?yōu)闇\褐色，形成黑色菌核。 分生孢子梗數(shù)根叢生，直立或稍彎曲，具隔膜，頂端呈1 ～2 次分枝，分枝的末端膨大，上密生小梗，小梗上聚生大量分生孢子。分生孢子無色至淡褐色，單孢，卵圓形、橢圓形或葫蘆形，大小為(10.3～19.0) μm×(7.8～12.1) μm。

由圖1-C、D 可知，YT2 在PDA 培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，邊緣規(guī)則，菌落初為灰色絨狀，后顏色變?yōu)楹诤稚?，有同心圈?菌絲透明，有分隔，分生孢子褐色，單生或2 個孢子形成短孢子鏈。 分生孢子頂端微曲，大小為(10. 1 ～55. 0) μm×(5. 2 ～10. 3) μm，倒棒錘形或卵圓形，有縱橫分隔，縱隔1 ～2 個，橫隔1 ～7 個，分隔處縊縮，具有圓錐狀或圓柱狀短喙，喙長2. 2 ～7. 1 μm。

由圖1-E、F 可知，YT3 在PDA 培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，邊緣規(guī)則，有同心圈，菌絲初為白色絨狀，后顏色變?yōu)闇\灰至深灰色，菌落表面產(chǎn)生橘紅色分生孢子團，菌落背面形成黑色斑點。 分生孢子無色，單胞，長橢圓形、短桿狀，兩端鈍圓，大小為(15.5 ～22.4) μm×(4.3～6.0) μm。

圖1 3 種病原菌的菌絲及分生孢子的特征形態(tài)Fig.1 The morphological characteristics of conidia and hyphae for the three pathogens

2.1.2 ITS 序列比對鑒定 將所測序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源比對，將病原菌的序列及其相似序列用MEGA 5.2 軟件的NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以明確病原菌分類地位結(jié)果如圖2 所示。

菌株 YT1 與美國寄生葡萄的灰葡萄孢菌(KR909190.1)聚在同一枝。 結(jié)合孢子形態(tài)特征，將菌株YT1 鑒定為灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。 其中富氏葡萄孢盤菌為有性世代，灰葡萄孢菌為無性世代。

菌株YT2 與分離自印度毛地黃的蕓苔鏈格孢(KU982593)、 澳大利亞本生煙的鏈格孢菌(KU059919. 1 )、 中國丹參的細極鏈格孢(JX406538)、 巴基斯坦番茄的早疫病菌(LC339939)、伊朗油菜的喬木鏈格孢(MF462297)聚為一類。 結(jié)合孢子的形態(tài)特征，鑒定菌株YT2 為鏈格孢菌(Alternaria alternata)。

菌株YT3 與分離自中國南天竹、巴基斯坦草莓、中國衛(wèi)矛、中國枇杷、中國核桃、巴基斯坦柑橘、中國紅葉石楠的膠孢炭疽菌( MF322895、MH168106、KY45484、JN704145、HQ845105、MH742312、MH311619)聚為一類。 結(jié)合孢子的形態(tài)特征，鑒定菌株YT3 為膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。

圖2 基于ITS 序列和鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree derived from ITS domain sequences and neighbor-joining analysis

2.2 丁香精油不同作用方式對3 種病原菌的抑制作用

由表1、表2 可知，隨著精油濃度的升高，無論是精油熏蒸還是接觸處理，PDA 培養(yǎng)基上3 種病原菌的菌絲生長抑制率均逐漸增強，這與前人研究結(jié)果一致，即在體外試驗中，抑菌效果依賴于精油的暴露濃度，即精油暴露濃度越高，抑菌效果越好[19]。 丁香精油對B.cinerea的MIC 較A. alternata、C. gloeosporioides更高，說明相比于其他2 株病原菌，B. cinerea對丁香精油的抗性更強，敏感性更高。 此外，要達到同樣的抑制效率，熏蒸作用較接觸作用的有效使用濃度更低，這主要是由于菌絲體具有較高的親脂性，而熏蒸作用使得精油的主要作用成分充斥在菌絲周圍的空間，作用的比表面積遠大于菌餅本身，熏蒸作用較接觸作用積累的精油量更多[20]。

表1 丁香精油熏蒸處理對3 種病原菌的抑制活力(n＝3)Table 1 Antifungal activity of clove oil on the three pathogens by fumigation (n＝3)

表2 丁香精油接觸處理對3 種病原菌的抑制活力(n＝3)Table 2 Antifungal activity of clove oil on the three pathogens by contact (n＝3)

2.3 丁香精油對病原菌抑制作用的機理分析

2.3.1 丁香精油的化學(xué)組分 由表3 可知，丁香精油的主要成分是丁香酚(78.952%)和乙酸丁香酚酯(17.891%)，與之前的報道一致，但具體含量以及次要組分存在一定差異[21]。 植物的生長條件、遺傳因素、收獲時期、營養(yǎng)狀況及其他因素可能會影響所提取精油的組成，最終導(dǎo)致上述化學(xué)形式的多樣性。

表3 丁香精油的主要化學(xué)組分Table 3 The main chemical components of Clove (Syzygium aromaticum L.) oil

2.3.2 丁香精油處理對YT3 孢子萌發(fā)的影響 由表4 可知，丁香精油有效抑制了C. gloeosporioides孢子的萌發(fā)及芽管的伸長。 經(jīng)28℃恒溫回轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)20 h，對照組孢子幾乎全部萌發(fā)(孢子萌發(fā)率97%)，精油濃度為100 μL·L-1時孢子萌發(fā)率下降至52.9%，精油濃度為200 μL·L-1及以上時孢子萌發(fā)率在5%以下。 與對照組相比，精油濃度為100 μL·L-1時芽管長度略有減少，下降了9.5%；精油濃度為200、400 μL·L-1時，芽管長度分別較對照組顯著降低了73.3%和94.7%，精油濃度為800 μL·L-1時孢子萌發(fā)全部受到抑制。

表4 不同濃度丁香精油處理對C. gloeosporioides孢子萌發(fā)率及芽管長度的影響(n＝3)Fig. 4 Effect of different concentration of clove oil on spore germination and germ tube elongation of C. gloeosporioides (n＝3)

2.3.3 丁香精油處理對YT3 細胞膜透性的影響 由圖3 可知，關(guān)于細胞外核酸含量，丁香精油濃度為200、300、400 μL·L-1時，260 nm 波長處的吸光度值顯著高于對照組及100 μL·L-1處理(P＜0.05)，表明200 μL·L-1以上濃度的丁香精油會導(dǎo)致C. gloeosporioides細胞膜透性增強，進而引起胞內(nèi)核酸物質(zhì)的外泄。 但200、300、400 μL·L-1處理間核酸含量無顯著差異(P＞0.05)，這可能是由于隨著精油濃度的升高，菌絲生長總量不斷受到抑制，從而導(dǎo)致總的核酸含量變化不顯著，這與Shao等[22]的結(jié)果不完全一致。 此外，在100～400 μL·L-1濃度范圍內(nèi)，隨著精油濃度的升高，相同菌絲重量的胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量呈顯著下降趨勢(P＜0.05)，這也進一步說明了精油處理對細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞作用。

圖3 丁香精油對C. gloeosporioides 核酸外泄和蛋白含量的影響Fig.3 Effect of clove oil on nucleic acid leakage and protein content of C. gloeosporioides

2.3.4 丁香精油處理對YT3 菌絲形態(tài)的影響 由圖4 可知，丁香精油對YT3 菌絲微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)有較大程度的破壞。 對照組(A)菌絲生長狀態(tài)正常，健康飽滿，表面平整光滑；處理組(B)菌絲出現(xiàn)嚴重變形并伴有褶皺、凹陷、不平整等現(xiàn)象。 表明丁香精油處理對YT3產(chǎn)生了嚴重影響，導(dǎo)致菌絲發(fā)生了類似脫水、皺縮等現(xiàn)象。

圖4 對照組(A)與300 μL·L-1丁香精油處理組(B)菌絲的掃描電鏡圖像Fig.4 SEM images of (A) control and (B) 300 μL·L-1 clove oil-treated mycelia

3 討論

結(jié)合形態(tài)和分子生物學(xué)(ITS 序列)鑒定，確定泰安產(chǎn)區(qū)紅燈甜櫻桃采后優(yōu)勢致病菌分別為B. cinerea、A. alternata和C. gloeosporioides，這與國內(nèi)外學(xué)者的報道[23]略有差異，可能是產(chǎn)地、品種、管理條件、氣候等的不同導(dǎo)致不同地區(qū)甜櫻桃采后病原菌種群組成存在差別。

植物精油是一類安全、高效的天然殺菌劑，在果品采后腐爛控制中，發(fā)揮了獨特的作用。 無論在體外抑菌還是體內(nèi)防腐保鮮中，精油都可采用熏蒸和接觸2種作用方式。 劉瑞玲等[24]采用接觸及熏蒸方式比較了3 種精油對火龍果采后腐爛病原真菌的抑制作用，表明2 種作用方式下3 種精油的抑菌效果呈現(xiàn)出不同的變化。 本研究結(jié)果表明，丁香精油的濃度是其體外抑菌效力的決定要素之一，且體外熏蒸方式的有效施用濃度低于接觸作用，這與熏蒸時被作用菌絲的比表面積較大有關(guān)[20]。 但在實際果品體內(nèi)防腐保鮮應(yīng)用中，除精油與病原菌的相互作用外，還應(yīng)考慮精油對果品品質(zhì)的影響，具體選擇哪種精油處理方式及具體施用濃度都有待進一步確定，可以從以下幾點作為參考:首先，要以精油的揮發(fā)氣味不影響果品自身的風(fēng)味和香氣為前提，這與不同作用受體對氣味的吸納力存在差異有關(guān)[25]；另外，精油的施用濃度既要起到抑制病害發(fā)生的效果，又不能對果品產(chǎn)生藥害，Arras 等[26]研究表明，百里香精油濃度較高時，其對橘類水果青霉的防治效果更差，這與高濃度精油會破壞果實中氧化還原相關(guān)的代謝途徑，從而導(dǎo)致對病原菌侵染的抗性能力減弱有關(guān)[27]；另有學(xué)者建議，在實際使用精油時還應(yīng)考慮果品同一樹種不同品種間的抗性及理想儲藏時間的差異[28]。 有研究表明，甜櫻桃均適用于精油熏蒸和接觸2 種處理方式，且抑菌效果顯著[10，29]，但在采后商品化處理中，精油具體的負載形式有待進一步研究，建議結(jié)合新型的生物活性物質(zhì)或包埋技術(shù)，如殼聚糖涂層、皮克林乳液覆膜等[30-31]，使得精油在延長果品貯藏期以及維持果品品質(zhì)、營養(yǎng)成分保持、提高消費者接受度方面發(fā)揮更大作用。

精油是由一大類不同組分構(gòu)成的混合物，其作用于病原菌的方式及靶點也有很多，因此，其抑菌機理較為復(fù)雜[32]。 有研究認為，精油的疏水性使它們能定位于微生物細胞膜及線粒體膜中的脂質(zhì)成分，從而引起膜結(jié)構(gòu)透性增強，胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，并干擾微生物的各種生物進程[33]。 本研究結(jié)果表明，經(jīng)一定濃度丁香精油處理的病原菌，其菌絲體生長和孢子萌發(fā)顯著受到抑制，細胞內(nèi)核酸及蛋白物質(zhì)均出現(xiàn)了流失現(xiàn)象，其中，隨著精油濃度升高，相同菌絲重量的蛋白質(zhì)含量呈顯著下降趨勢，而較高濃度(200 μL·L-1及以上)精油處理時，上清液中核酸的含量差異不顯著，可能是由于隨著精油濃度的升高，菌絲生長總量不斷受到抑制，雖然單個細胞的泄漏量增大，但總的核酸含量變化不顯著。關(guān)于精油抑菌機理多集中在其與膜結(jié)構(gòu)的相互作用方面，對精油功能成分具體靶向病原菌的代謝途徑或信號通路以及關(guān)鍵調(diào)控基因的表達等尚未闡明。 另有研究表明，精油的抑菌性是其含量最多的成分起作用[34]，經(jīng)測定，本試驗所用丁香精油主要成分是丁香酚，含量高達78.952%。 也有學(xué)者認為，精油作為混合物，其整體的抑菌性好于單一成分，推測不同組分之間有協(xié)同作用[35]。 因此，關(guān)于以上問題還需進一步深入研究。

4 結(jié)論

經(jīng)形態(tài)和分子生物學(xué)(ITS 序列)鑒定明確了甜櫻桃采后3 種主要致腐真菌，分別為灰葡萄孢菌(B.cinerea)、鏈格孢菌(A. alternata)和膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)。 體外抑菌試驗表明，一定濃度的丁香精油能顯著抑制3 種致病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)，且熏蒸處理較接觸效果更好。 進一步試驗表明丁香精油破壞了菌絲形態(tài)，可能是其疏水性引起微生物膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)破壞，造成胞內(nèi)主要內(nèi)容物流失，生理代謝功能受到嚴重影響。