岳金榮 叢玉婷 邢震宇 高相楠 王明芳 柴曉杰

(大連海洋大學(xué)/遼寧省省級(jí)高校水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116023)

杜氏鹽藻(Dunaliella salina)，簡(jiǎn)稱鹽藻，屬于綠藻門(Chlorophyta) 綠藻綱(Chlorophyceae) 團(tuán)藻目(Volvocales) 多 鞭 藻 科(Polyblepharidaceae) 鹽 藻 屬(Dunaliella)，廣泛分布于海洋、鹽田及鹽湖中。 鹽藻細(xì)胞形體微小，形狀多樣，兩條等長(zhǎng)的鞭毛位于細(xì)胞前端，可自由游動(dòng)，無(wú)細(xì)胞壁[1]。 鹽藻是已知最耐鹽的單細(xì)胞真核生物，能夠在0.05 ～5.00 mol·L-1NaCl 的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)、繁殖，是研究植物抗鹽生理及其分子機(jī)制最理想的模式生物[2]。 因此，深入探討鹽藻適應(yīng)高鹽環(huán)境的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。研究表明，在高鹽脅迫下，鹽藻通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞體積[3]、離子轉(zhuǎn)運(yùn)[4-6]以及大量合成甘油[7-9]，以適應(yīng)外界環(huán)境滲透壓的變化。 但有關(guān)其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未明確。

大多數(shù)真核生物中都存在有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它由三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)組成[10]，即絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)、MAPK 激酶和MAPKK 激酶，這三類激酶都屬于絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。 植物細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，先對(duì)Ser/Thr 進(jìn)行磷酸化修飾，使MAPKKK-MAPKK-MAPK 相繼激活，將上游信號(hào)進(jìn)行傳遞，最終傳遞至下游。 細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂和分化，以及細(xì)胞死亡等多個(gè)生理過(guò)程，都有MAPK 的參與，MAPK 激活后通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子或者多種蛋白(酶)等底物參與上述介導(dǎo)過(guò)程。 MAPK 廣泛參與植物對(duì)各種逆境脅迫的應(yīng)答過(guò)程，如干旱[11-13]、溫度[14-15]及鹽脅迫[16-18]等均有報(bào)道，但在水生植物藻類中的研究鮮有報(bào)道。 張婷等[19]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)證實(shí)，DsMAPK的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，當(dāng)3 mol·L-1NaCl 脅迫處理0.5 h 時(shí)，DsMAPK的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05)；脅迫處理1 h 時(shí)，DsMAPK的表達(dá)量是正常對(duì)照組的5 倍，達(dá)到最大值，差異達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。 Lei 等[20]也證明杜氏鹽藻MAPK基因?qū)Ω邼B脅迫有響應(yīng)。 Zhao 等[21]認(rèn)為杜氏藻MAPK 基因(DtMAPK)調(diào)節(jié)3-磷酸甘油脫氫酶基因(GPDH)的表達(dá)及甘油的合成，說(shuō)明MAPK在杜氏藻應(yīng)答高鹽脅迫的滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。 因此，進(jìn)一步研究鹽藻MAPK基因的功能及其互作蛋白，對(duì)于闡明鹽藻耐高鹽的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

前期研究采用反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)成功從鹽藻中克隆了促有絲分裂活化蛋白激酶基因(GenBank 登錄號(hào): JQ782412)， 命名為DsMAPK，并成功構(gòu)建了DsMAPK的原核表達(dá)載體[19，22]。 本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)使鹽藻MAPK基因在大腸桿菌中成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)His 柱純化獲得了高純度的融合蛋白，以該融合蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，制備了多克隆抗體，然后采用免疫共沉淀技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù) ( liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)及生物信息學(xué)的方法篩選鹽藻MAPK 互作蛋白，在蛋白質(zhì)組學(xué)的水平上研究DsMAPK的功能，以期為進(jìn)一步闡明DsMAPK在鹽藻應(yīng)答鹽脅迫信號(hào)分子途徑中的作用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

杜氏鹽藻(Dunaliella salina)由大連海洋大學(xué)水生生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，其培養(yǎng)液為甲液與乙液，比例為1 000 ∶1[23]， 25℃，1 250 lx 光強(qiáng)，12 h 光照12 h 黑暗交替靜置培養(yǎng)。

菌種:E.coliBL21 (DE3) 購(gòu)自北京TIANGEN 公司。

載體質(zhì)粒: 空載體pGS21a 質(zhì)粒、重組質(zhì)粒pGS21a-DsMAPK均由大連海洋學(xué)院/遼寧省省級(jí)高校水生生物學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactosine，IPTG)、His60 Ni SuperflowTMResin，購(gòu)自美國(guó)Clontech公司；硝酸纖維素膜(NC 膜)、Anti-His Antibody、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔IgG HRP、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Mancer Protein Marker Mid Range，購(gòu)自生工生物工程(上海) 有限公司。 其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及復(fù)性

將空載體pGS-21a 質(zhì)粒(對(duì)照組)和重組質(zhì)粒pGS-21a (＋)-Ds MAPK(試驗(yàn)組)分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)， 37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑單菌落，接種于LB 液體培養(yǎng)基[含50 mg·L-1氨芐青霉素(ampicillin，Amp)]中，37℃條件下190 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600介于0.6 ～0.8 之間，加入IPTG 誘導(dǎo)6 h，收集菌體[23]。 用PBS緩沖溶液重懸菌體并在冰上進(jìn)行超聲波破碎(功率30 W，工作5 s，間歇5 s)[23]。 12 000 r·min-1離心20 min后用尿素緩沖溶液(尿素、100 mmol·L-1磷酸二氫鈉和10 mmol·L-1Tris-Cl，pH 值8.0)復(fù)溶沉淀，并將其置于4℃過(guò)夜。 2 mol·L-1尿素緩沖液沖洗沉淀之后再用8 mol·L-1尿素緩沖液重懸，過(guò)濾(0.45 μm 濾膜)后收集上清液，即為變性的重組蛋白粗品。

用His60 Ni SuperflowTMResin 純化變性的重組蛋白粗品。 Ni-純化柱經(jīng)過(guò)平衡緩沖液(8 mol·L-1尿素緩沖液)平衡后，重組蛋白粗品上柱，用平衡液洗3 ～5次去除雜蛋白，最后由8 mol·L-1尿素緩沖液配置的洗脫液(2、30、40、50、200、500 mmol·L-1咪唑，pH 值8.0)洗脫3 次并收集。 取所有洗脫液各10 μL 分別加入等量的2×SDS 上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

將純化后的融合蛋白洗脫液用尿素進(jìn)行復(fù)性。 將蛋白洗脫溶液轉(zhuǎn)移至透析袋，放置于尿素緩沖液[依次為6、4、2、0 mo1·L-1(pH 值8.0)]中，4℃保持12 h，隨后在相同條件下依次更換低度濃度尿素緩沖液，最后轉(zhuǎn)移到不含尿素的緩沖液中。

1.4 融合蛋白Western blotting 檢測(cè)

純化后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(200 mA，2 h)，5%牛血清白蛋白封閉，以Anti-His Antibody 為一抗(1 ∶2 000)，37℃孵育1 h，PBST 洗滌3 次，每次5 min，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1 ∶200) 二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌，每次5 min，然后加入沉淀型單組分3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液顯色。

1.5 多克隆抗體的制備及純化

將純化后的DsMAPK 樣品與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻，皮下注射免疫4 月齡健康雌性新西蘭大白兔，初次免疫20 d，然后使用DsMAPK 與弗氏不完全佐劑混合物進(jìn)行第2 次免疫，二次免疫14 d 后進(jìn)行第3 次免疫，三免7 d 后進(jìn)行耳靜脈采血1 mL，間接ELISA 檢測(cè)抗血清效價(jià)，未達(dá)到要求的進(jìn)行第4 次免疫，四免8 d 后間接ELISA 檢測(cè)抗血清效價(jià)達(dá)到要求，頸動(dòng)脈采全血。 初免劑量為0.4 mg/只，二、三、四次免疫劑量為0.2 mg/只。

采用純化介質(zhì)Protein A SepharoseTMCL-4B 純化抗血清，將純化后的抗血清稀釋至1 mg·mL-1后置于-80℃保存。

1.6 鹽藻總蛋白的提取及Western blot 檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 NaCl 鹽藻(含 1.0 mol·L-1)， 加入NaCl 使其終濃度達(dá)到3 mol·L-1，置于恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(25℃、光強(qiáng)1 250 lx)，分別于培養(yǎng)1、3、6、12、24 h 取培養(yǎng)液。 培養(yǎng)液經(jīng)8 000×g離心5 min 收集鹽藻細(xì)胞。 用Sangon Biotech RIPA 裂解液Ⅳ提取總蛋白。 取10 μL 少量蛋白進(jìn)行電泳檢測(cè)，其余保存?zhèn)溆谩?/p>

取20 μg 鹽藻上清蛋白質(zhì)，加入上樣緩沖液后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)至NC 膜，封閉后與多克隆抗體共孵育(1 ∶1 000 稀釋)，二抗采用HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(1 ∶2 000 稀釋)，進(jìn)行TMB 底物溶液顯色，拍照記錄。

1.7 免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)篩選相互作用蛋白

取5.978 mg 對(duì)照組鹽藻總蛋白，加入60 μg 普通兔的IgG；取5.978 mg 試驗(yàn)組鹽藻總蛋白，加入60 μg DsMAPK 多克隆抗體，各自混合均勻，4℃孵育過(guò)夜。向鹽藻總蛋白與抗體混合物中加入1/20 體積的蛋白A/G 瓊脂糖珠并充分混勻，4℃孵育2 ～4 h。 1 000×g離心2 min，保留沉淀。 沉淀中加入1 mL PBS，1 000×g離心洗滌3 min。 重復(fù)上述離心操作3 次，然后向沉淀中加入50 μL 2×loading buffer，靜置1 h 后沸水浴10 min，再經(jīng)8 000×g離心5 min，保留上清液。 吸取20 μL 上清液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。

1.8 LC-MS/MS 質(zhì)譜分析

對(duì)1.7 中獲得的上清液進(jìn)行超濾、還原烷基化、酶解處理。 將凍干的肽段重溶于0.1%甲酸(formic acid， FA)中，進(jìn)行在線液質(zhì)聯(lián)用分析。 色譜系統(tǒng)為nano ACQUITY UPLC(Waters Corporation，英國(guó))，與色譜相連的質(zhì)譜為Q Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific，美國(guó))。 樣品先以10 μL·min-1的流速將其結(jié)合在trap 柱上(Thermo Scientific Acclaim PepMap C18 column，100 μm×2 cm， 3 μm particle size)，然后再于分析柱(Acclaim PepMap C18，75 μm×15 cm) 上進(jìn)行分離。梯度分離條件:在40 min 內(nèi)將乙腈濃度由5%升至45%。 質(zhì)譜條件:納升級(jí)電噴霧電離方式(nano-ESI)，正離子模式掃描，掃描范圍m/z 350 ～1 500。 采用PEAKS STUDIO 軟件(Bioinfor Inc，美國(guó)) 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)庫(kù)為大連海洋學(xué)院/遼寧省省級(jí)高校水生生物學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室提供的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western blotting檢測(cè)

由圖1-A 可知，對(duì)照組表達(dá)菌(含空載體pGS-21a)經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后在35 kDa 左右有一條表達(dá)增強(qiáng)的標(biāo)簽蛋白條帶；2、3 號(hào)泳道為試驗(yàn)組表達(dá)菌(含重組質(zhì)粒pGS-21a-Ds MAPK)，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌體經(jīng)超聲波破碎得到的上清液和沉淀，2 號(hào)泳道未見(jiàn)清晰的目的條帶，3 號(hào)泳道在87 kDa 左右有一條表達(dá)增強(qiáng)的目的蛋白條帶，此條帶在對(duì)照組未出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果相符，即融合蛋白包括預(yù)計(jì)分子量為52 kDa 的DsMAPK 融合蛋白和35 kDa 的His 標(biāo)簽蛋白。 此外，上清液中未見(jiàn)清晰的目的蛋白條帶，表明目的蛋白主要是以包涵體的形式表達(dá)。

圖1 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western blotting 檢測(cè)Fig.1 Expression， purfication and Western bloting analysis of induced recombinant protein

對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，純化產(chǎn)物在87 kDa 左右有一條蛋白帶，大小與預(yù)期相符(圖1-B、C)。 將其中純化條帶單一的蛋白樣品收集。 為了進(jìn)一步確定純化蛋白是否為目的蛋白，對(duì)其進(jìn)行了Western blotting 檢測(cè)(圖1-D)，可見(jiàn)1 號(hào)泳道在87 kDa 左右有一清晰的雜交信號(hào)帶，初步證明純化的蛋白就是帶有His 標(biāo)簽的DsMAPK 融合蛋白。

2.2 鹽藻總蛋白的提取及Western blotting 檢測(cè)

由圖2-A 可知，各處理組均出現(xiàn)多個(gè)清晰的條帶，表明鹽藻總蛋白的提取效果良好。 Western blotting 檢測(cè)結(jié)果表明(圖2-B)，對(duì)照組和鹽脅迫試驗(yàn)組均在50 kDa 左右出現(xiàn)單一條帶，與DsMAPK 蛋白大小相符，初步判定DsMAPK 抗體特異性良好且在鹽脅迫3 h 和6 h 時(shí)鹽藻總蛋白的表達(dá)量較高。

圖2 鹽藻總蛋白提取及Western blotting 檢測(cè)Fig.2 Extraction of total protein of Dunaliella salina and detection by Western blotting

2.3 免疫共沉淀篩選DsMAPK 的相互作用蛋白

由3-A 可知，1、2 號(hào)泳道均為多個(gè)且清晰的條帶，表明鹽藻總蛋白的提取效果良好。 免疫共沉淀產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示，2 號(hào)泳道在約28 kDa 處有明顯的差異條帶，說(shuō)明用免疫共沉淀方法成功篩選出DsMAPK 相互作用蛋白。

2.4 LC-MS/MS 及生物信息學(xué)分析

鹽藻總蛋白免疫共沉淀后經(jīng)脫色、還原、烷基化、酶解、萃取等處理，將制備好的樣品用Q Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，然后將質(zhì)譜鑒定結(jié)果導(dǎo)入PEAKS STUDIO 軟件(Bioinfor Inc.，美國(guó)) 搜索鹽藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。 篩選肽段可信度高(peptide confidence-high) 的肽段，并由軟件根據(jù)同一特異肽段(unique peptide)在各樣本中的報(bào)告離子峰的面積比值計(jì)算蛋白質(zhì)的表達(dá)量。 如果某個(gè)蛋白的差異倍數(shù)(fold change)＞2.0，同時(shí)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P＜0.05，便可認(rèn)為是差異蛋白。 由圖4 可知，試驗(yàn)組鑒定出的特有蛋白165 種。 為了更深入地了解高鹽脅迫下DsMAPK 的生物學(xué)功能，對(duì)篩選的165 差異蛋白進(jìn)行基因本體GO 功能富集分析和KEGG Pathway 分析。

圖3 鹽藻總蛋白提取及免疫共沉淀結(jié)果Fig.3 Total protein of Dunaliella salina and co-immunoprecipitation products identify by SDS-PAGE electrophoresis

圖4 鹽脅迫下鹽藻差異表達(dá)蛋白的分布Fig.4 The distribution of differentially expressed proteins of Dunaliella salina under salt stress

GO 注釋主要是對(duì)蛋白質(zhì)的分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)、生物進(jìn)程(biological process) 進(jìn)行分析。 圖5 是一個(gè)GO 富集分析匯總柱狀圖，展示了MF、CC 和BP 3 種類別富集分析顯著性(P＜0.05)排名前10 的條目。 生物進(jìn)程分析表明，差異蛋白主要參與細(xì)胞凋亡、小分子生物合成過(guò)程以及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)；細(xì)胞組分分析表明，差異蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)、核糖體；分子功能顯示，差異蛋白主要參與了生物小分子、核苷酸、ATP 的結(jié)合?？梢?jiàn)，鹽藻響應(yīng)鹽脅迫的差異表達(dá)蛋白具有多種分子功能，并參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，表明鹽藻鹽脅迫響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程。

KEGG 是一個(gè)利用圖形介紹眾多的代謝途徑及各途徑之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)。 圖6 根據(jù)KEGG 富集匯總表中選擇的調(diào)控通路，展示了顯著性排名前10 的條目，條柱均高于藍(lán)線或紅線，其所代表的調(diào)控通路具有顯著性。 KEGG 代謝通路分析表明，鹽藻差異蛋白主要參與了新陳代謝、遺傳信息的傳遞，外界環(huán)境信息的應(yīng)答，細(xì)胞周期調(diào)控，以及其他未知的途徑等，表明信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白、脅迫相關(guān)蛋白以及代謝相關(guān)蛋白在鹽藻應(yīng)答高濃度鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，為全面了解鹽藻的抗鹽機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

圖5 鹽藻差異表達(dá)蛋白的GO 功能及富集分析結(jié)果Fig.5 GO function and enrichment analysis results of differentially expressed proteins of Dunaliella salina

基于string 數(shù)據(jù)庫(kù)和cytoscape 軟件，制作了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)，表示了KEGG 富集結(jié)果中顯著性較高的前10 個(gè)通路以及與之互作蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)圖中有32 種蛋白。 互作圖是以圓點(diǎn)(基因或蛋白)、多邊形(代謝產(chǎn)物)、三角形(miRNA)、五角形(轉(zhuǎn)錄因子)與圓角矩形(生物過(guò)程、細(xì)胞定位、分子功能或信號(hào)通路)以不同直線(互作關(guān)系虛線為未經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)線為已有相關(guān)驗(yàn)證報(bào)道)進(jìn)行連接展示的分子相互作用機(jī)制與網(wǎng)絡(luò)模型圖。 由圖7 可知，PGK1(3-磷酸甘油酸激酶)、LAS17(肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白)、BCK1(絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶，即為MAKKK)與DsMAPK 互作蛋白得分均在840 以上，URA2 與DsMAPK 互作得分為626，互作的可能性較高。 但PGK1、LAS17、BCK1、URA2 與DsMAPK 是否互作，尚未驗(yàn)證，后續(xù)將通過(guò)酵母雙雜交的方法鑒定以上蛋白質(zhì)之間是否存在互作關(guān)系。

圖6 鹽藻差異蛋白的KEGG 分析Fig.6 KEGG pathway analysis of differentially expressed proteins of Dunaliella salina

圖7 蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Network diagram of protein interactions

3 討論

鹽脅迫反應(yīng)和應(yīng)答是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)會(huì)組成一個(gè)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)成各項(xiàng)生理活動(dòng)的基礎(chǔ)。 因此，研究蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，對(duì)于闡明細(xì)胞高度復(fù)雜的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。 免疫共沉淀是研究蛋白質(zhì)相互作用的有效方法，技術(shù)成熟，可信度高。 該技術(shù)是利用抗原和抗體特異性結(jié)合以及免疫蛋白Fc 片段與蛋白A/G 瓊脂糖珠的結(jié)合，形成“結(jié)合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗體-蛋白A/G 瓊脂糖珠”復(fù)合物，從而獲得與誘餌蛋白相互作用的目的蛋白[24]。 本研究采用免疫共沉淀方法篩選出與DsMAPK 相互作用的蛋白質(zhì)，并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，共檢測(cè)到165 種特有差異蛋白。 通過(guò)GO 和KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白主要參與了新陳代謝、遺傳信息的傳遞以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)調(diào)控過(guò)程。

甘油是鹽藻響應(yīng)鹽脅迫最主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，鹽藻通過(guò)大量合成甘油，以適應(yīng)外界環(huán)境滲透壓的變化[2，7]。 研究表明，在高鹽脅迫初期，光合作用受到抑制，合成甘油所需的磷酸二羥丙酮(dihydroxyacetone phosphate，DHAP)主要來(lái)源于淀粉代謝，而非光合作用[25-26]。 隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的淀粉被消耗，鹽藻細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制逐漸恢復(fù)，光合作用逐漸增強(qiáng)[27]。 本研究鑒定到多種參與光合作用的蛋白質(zhì)，分別是光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心亞基Ⅱ、鐵氧還蛋白、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、3-磷酸酸甘油酸激酶(PGK1)及3-磷酸甘油醛脫氫酶。 光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心亞基Ⅱ和鐵氧還蛋白是光合電子傳遞鏈的組分，參與氧化還原反應(yīng)；RuBisCO 是光合作用中的關(guān)鍵酶，催化羧化反應(yīng)和氧合反應(yīng)，小亞基rbcS 具有調(diào)控RuBisCO 活性的功能，在轉(zhuǎn)基因研究中，RuBisCO 小亞基rbcS 基因的啟動(dòng)子經(jīng)常作為高效表達(dá)的調(diào)控元件[28]；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化磷酸烯醇式丙酮酸不可逆反應(yīng)生成磷酸和草酰乙酸，是光合作用的關(guān)鍵酶，存在于所有光合生物中，同時(shí)還參與氨基酸代謝中碳骨架回補(bǔ)作用[29]；磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變成1，3-二磷酸甘油酸，后者在脫氫酶作用下還原為3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛可以轉(zhuǎn)變成DHAP。 DHAP 通過(guò)3-磷酸甘油脫氫酶轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油，再通過(guò)磷酸酶去磷酸化而合成甘油[2，7]。 因此，推測(cè)DsMAPK 調(diào)控了鹽藻在高鹽脅迫下的光合作用及甘油合成等生物學(xué)過(guò)程。

前期研究發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫下，鹽藻會(huì)發(fā)生鞭毛脫落的現(xiàn)象[30]，但其恢復(fù)機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)DsMAPK 與S-腺苷高半胱氨酸水解酶存在互作關(guān)系。鹽藻S-腺苷高半胱氨酸水解酶參與真核生物最主要的甲基化反應(yīng)，參與鹽藻鞭毛的再生，說(shuō)明DsMAPK可能在鹽藻細(xì)胞鞭毛的再生中起到重要的調(diào)控作用。此外，還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞分裂調(diào)控蛋白48、蛋白激酶C 及肌動(dòng)蛋白。 Ravanti 等[31]認(rèn)為MAPK 通過(guò)上調(diào)某些轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)和生物活性，影響細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞因子的合成。 高鹽脅迫下，鹽藻細(xì)胞快速失水變小，平衡胞內(nèi)外的滲透壓，以適應(yīng)外界的高滲環(huán)境[32]。 肌動(dòng)蛋白組成微絲，普遍存在于真核細(xì)胞中，構(gòu)成細(xì)胞的支架，維持細(xì)胞的形態(tài)。 因此，推斷DsMAPK 可能參與了鹽藻細(xì)胞鞭毛的再生、藻細(xì)胞的增殖及細(xì)胞形態(tài)的恢復(fù)。

本研究結(jié)果還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證，但這些重要蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)豐富和發(fā)展了現(xiàn)有理論，為下一步的研究提供了新思路。 后續(xù)工作將通過(guò)酵母雙雜交的方法進(jìn)一步驗(yàn)定這些蛋白質(zhì)的功能。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)原核表達(dá)純化的DsMAPK 蛋白成功制備出多克隆抗體且特異性良好，經(jīng)過(guò)免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)以及生物信息學(xué)的方法篩選出165 種特有的差異蛋白。 通過(guò)GO 和KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白主要參與了新陳代謝、遺傳信息的傳遞以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)調(diào)控過(guò)程。 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，直接與MAPK 相互作用的蛋白有4 種。 本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究杜氏鹽藻響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制提供了材料。