張思宇 祁小旭 張玲玲 劉紅梅 楊殿林 王 慧

(1農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所， 天津 300191；2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 遼寧 沈陽 100161)

隨著人類活動(dòng)和工業(yè)的發(fā)展，土壤重金屬污染問題日益嚴(yán)峻[1]。 目前我國農(nóng)田土壤重金屬嚴(yán)重超標(biāo)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，耕地土壤的點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)19.4%[2]，受鎘(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、鉻(Cr)、鉛(Pb)污染的耕地面積約20×107hm2[3]。 黃頂菊(Flaveria bidentis)為菊科黃頂菊屬一年生菊科雜草，原產(chǎn)于南美洲，于2001年傳入我國河北、天津等地，對該地區(qū)的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)造成了極大的破壞，包括與周圍植物爭水、爭肥和爭空間等，大幅度降低了作物產(chǎn)量[4]。 黃頂菊還具有較強(qiáng)的侵略性和排他性，其適應(yīng)性廣，入侵環(huán)境極為復(fù)雜，農(nóng)田是其主要入侵生境之一，約占黃頂菊主要發(fā)生面積的17%，玉米、棉花、菜地和果園等管理粗放地是黃頂菊多發(fā)區(qū)域[5]。 研究發(fā)現(xiàn)，我國典型農(nóng)田土壤Cd、Hg、As 等重金屬含量均高于背景值，且Cd 的潛在危害程度最高[6]。 因此，研究黃頂菊對重金屬Cd 污染生境的耐受性可為預(yù)測該入侵種在農(nóng)田潛在的分布擴(kuò)散范圍和制定防控策略提供一定的理論依據(jù)。

外來植物能夠快速適應(yīng)新入侵環(huán)境的各種非生物和生物條件變化是其實(shí)現(xiàn)成功入侵的前提[7]。 表觀遺傳學(xué)是環(huán)境適應(yīng)性獲得的重要基礎(chǔ)，外界環(huán)境誘導(dǎo)的表型變異涉及表觀遺傳學(xué)控制基因表達(dá)的過程，且這種變異的表觀遺傳信息可傳遞給后代[8-10]。 胞嘧啶的第5 位碳原子和甲基間發(fā)生共價(jià)結(jié)合，稱為5-甲基胞嘧啶(5-Me C)，是植物基因組DNA 的一種主要表觀遺傳修飾方式，目前在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域研究最為廣泛，在植物基因表達(dá)、基因組防御以及系統(tǒng)發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用[11]。 植物可以通過基因組DNA 甲基化變化控制其相關(guān)抗逆基因的表達(dá)，進(jìn)而適應(yīng)新環(huán)境[12]。 表型可塑性是指物種本身遺傳多樣性水平可能較低，但可通過產(chǎn)生不同表型以適應(yīng)不同的環(huán)境，是物種在特定環(huán)境下產(chǎn)生較高適合度的一種表現(xiàn)形式[13]。 植物適應(yīng)性反應(yīng)和表型可塑性變異發(fā)生均涉及到基因組表觀遺傳變異[14]。

前人對黃頂菊的研究多集中于不同環(huán)境條件下黃頂菊種子萌發(fā)特性、形態(tài)、化感效應(yīng)強(qiáng)弱及生理生化指標(biāo)變化規(guī)律等方面[15-18]，很少關(guān)注生態(tài)適應(yīng)性機(jī)理方面的研究。 DNA 表觀遺傳學(xué)方法為深入理解入侵性的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)提供了重要工具，也為了解植物入侵性發(fā)生機(jī)制提供了新思路。 遺傳變異在研究入侵植物與環(huán)境的相互作用以及物種的適應(yīng)性進(jìn)化中具有重要作用[19]。 此外，植物也可以通過發(fā)生甲基化在基因組序列不變的情況下調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)節(jié)表型可塑性變異來響應(yīng)環(huán)境條件的變化[14]。 然而DNA 表觀遺傳多樣性變異是否是黃頂菊對重金屬和復(fù)雜鹽堿生境適應(yīng)性獲得的潛在機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。 本研究采用網(wǎng)室試驗(yàn)，人工模擬天津地區(qū)農(nóng)田Cd 污染生境，探討在重金屬污染下黃頂菊表觀遺傳多樣性變化特征，以期為入侵植物黃頂菊的防控提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃頂菊種子采自天津靜海團(tuán)泊水庫，為2016 年收獲的新種。 試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所網(wǎng)室(39°05′N，117°08′E)內(nèi)進(jìn)行，供試土壤類型為潮土，裝盆前統(tǒng)一過篩，將過篩后的土壤與CdCl2·2.5H2O粉末混勻(土壤中Cd 含量為土壤本底含量＋處理添加含量)，確保盆中土壤粒徑均勻，平衡2 個(gè)月后備用，供試土壤理化性質(zhì)詳見表1。

表1 供試土壤基本理化性狀Table 1 The main fertility characteristics of the soil used in the experiment

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2017 年4-9 月開展網(wǎng)室盆栽試驗(yàn)，采用直徑25 cm，高35 cm 的塑料花盆，每盆裝土7.5 kg。 選擇健康飽滿的黃頂菊種子播種于育苗盤上，培養(yǎng)至2 ～3 片真葉，選擇長勢一致的幼苗移栽至花盆中，每盆定苗2株。 設(shè)4 個(gè)不同Cd 濃度[0(CK)、2(Cd-1)、4(Cd-2)和8(Cd-3) mg·kg-1]脅迫處理，每個(gè)處理10 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2 個(gè)單株。 基肥中N 含量為175 mg·kg-1，P2O5含量為120 mg·kg-1，K2O 含量為50 mg·kg-1。各處理每2 d 澆1 次水，每15 d 隨機(jī)轉(zhuǎn)盆一次以消除局部環(huán)境條件差異的影響。

1.3 植物樣品采集

2017 年8 月20 日，于黃頂菊生長盛期(脅迫處理61 d)每處理隨機(jī)選取3 株植株，采集第4～第6 對完全展開葉片，用錫箔紙包裹迅速用液氮速凍后，-70℃保存?zhèn)溆茫糜诤罄m(xù)DNA 甲基化及酶活指標(biāo)的測定。 2017年9 月中旬，采集整株植株用于生長指標(biāo)、重金屬富集與轉(zhuǎn)移等指標(biāo)的測定，并計(jì)算其表型可塑性指數(shù)。

1.4 基因組DNA 提取與測定

采用改良CTAB 法[20]提取黃頂菊葉組織基因組DNA，并用Nano Drop 2000 核酸蛋白分析儀(基因有限公司，中國香港)測定DNA 濃度。

1.5 MSAP 體系建立與優(yōu)化

甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorphism， MSAP)體系建立與優(yōu)化參照全志星等[21]方法，并加以改進(jìn)。EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ雙酶切、預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增各步驟中所用接頭和引物序列詳見表2。

表2 本研究中接頭和引物序列信息Table 2 Sequence information of adaptor and primers used in this study

1.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染

1.6.1 樣品前處理 取8 μL 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物于95℃變性7 min，取5 μL 變性產(chǎn)物與2 μL 10×Loading buffer 混勻離心，置于冰上冷卻5 min。

1.6.2 5% PAGE 凝膠制備 尿素(分析純)33.6 g，5×TBE 16 mL，40%丙烯酰胺貯液(19 ∶1，v/v)10 mL，超純水20.4 mL，N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(N，N，N′，N′- tetramethylethylenediamizne， TEMED) 75 μL 和10% 過硫酸銨(ammonium persulfate， APS) 320 μL 于灌膠前加入，均勻攪拌并迅速灌膠，約2 h 膠完全凝固后進(jìn)行垂直電泳。

1.6.3 垂直電泳 55 W 恒定功率下預(yù)電泳30 min使膠面溫度達(dá)55℃，取樣品6 μL 點(diǎn)樣，繼續(xù)電泳2 h對選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物做進(jìn)一步分離。

1.6.4 銀染 電泳結(jié)束后剝離2 塊玻璃板，將帶有凝膠的長玻璃板置于染液(4 g AgHNO3、30 mL 37%甲醛溶于1 L 去離子水)中染色2 min，再放入30% NaOH溶液中進(jìn)行顯色至條帶完全顯現(xiàn)，用清水緩慢沖洗晾干用于后續(xù)條帶分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Quantity One 軟件統(tǒng)計(jì)甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性圖譜在100 ～800 bp 區(qū)間的條帶，并轉(zhuǎn)換成表型數(shù)據(jù)0/1 矩陣，用POPGene 軟件分析引物組合的表觀遺傳多樣性指數(shù)，采用Origin 9.1 繪圖，并采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，Pearson 法進(jìn)行表型可塑性與甲基化水平的相關(guān)性分析，甲基化帶型分類參照潘雅姣等[22]的方法。 甲基化模式類型詳見表3。

表3 MSAP 甲基化模式類型Table 3 MSAP methylation pattern types

2 結(jié)果與分析

2.1 植物葉片DNA 提取及MSAP 體系建立

模板DNA 的OD260/OD280值均在1.7 ～1.9 之間，且DNA 條帶清晰完整，無拖尾現(xiàn)象，說明DNA 純度較高，無大分子蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，可用于后續(xù)酶切連接(圖1-A)；產(chǎn)物無主條帶，且呈刷狀，說明酶切充分可進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)(圖1-B)；條帶整體呈彌散狀，且少許亮帶集中在150～800 bp 之間，可用于后續(xù)選擇性擴(kuò)增(圖1-C)；片段在150 ～800 bp 之間的條帶較亮，無拖尾現(xiàn)象，且重復(fù)性較好，可進(jìn)行下一步反應(yīng)(圖1-D)。

2.2 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物通過5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，獲得甲基化MSAP 圖譜。 部分引物的MSAP擴(kuò)增結(jié)果，條帶清晰且均勻，可用于后續(xù)甲基化條帶統(tǒng)計(jì)與分析(圖2)。 利用Quantity One 軟件統(tǒng)計(jì)重金屬脅迫下黃頂菊葉片甲基化擴(kuò)增條帶(表4)，篩選出的15 對引物共擴(kuò)增出726 條條帶，平均每對引物約擴(kuò)增出49 條條帶，其中，引物EhHM2 擴(kuò)增條帶數(shù)最多，為66 條；引物EhHM7 擴(kuò)增的條帶數(shù)最少，為28 條。 引物組合EaHM13 擴(kuò)增條帶的多態(tài)性百分比最高，為96.55%，表明引物EaHM13 對黃頂菊表觀遺傳變異貢獻(xiàn)率最大；引物EhHM7 擴(kuò)增條帶的多態(tài)性百分比最低，為75.00%，表明引物EhHM7 對黃頂菊表觀遺傳變異貢獻(xiàn)率最小。

2.3 Cd 脅迫對黃頂菊葉片DNA 甲基化的影響

由圖3 可知，黃頂菊葉片半甲基化、全甲基化和整體甲基化的發(fā)生比例均隨著Cd 脅迫濃度的增加呈逐漸增加的趨勢。 其中各處理間半甲基化的發(fā)生比例差異不顯著；Cd 脅迫處理的全甲基化發(fā)生比例均顯著高于CK，Cd-1、Cd-2 和Cd-3 全甲基化發(fā)生比例分別為CK 的1.51、1.95 和2.11 倍；Cd 脅迫處理下整體甲基化發(fā)生比例也均明顯高于CK，Cd-1、Cd-2 和Cd-3 處理組整體甲基化發(fā)生比例分別為37.52%、41.30 和44.17%，分別較CK 升高了39.28、53.30 和63.97 個(gè)百分點(diǎn)，其中Cd-2 和Cd-3 處理組整體甲基化發(fā)生比例顯著高于CK。

圖1 Cd 處理下黃頂菊葉片MSAP體系瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of MSAP system of leaves of Flaveria bidentis under Cd treatment

圖2 引物EaHM13 對Cd 處理下黃頂菊葉片DNA的MSAP 擴(kuò)增圖譜Fig.2 DNA MSAP amplification patterns of leaves of Flaveria bidentis under Cd treatment by primer EaHM13

表4 Cd 脅迫下黃頂菊葉片引物組合的序列信息及擴(kuò)增條帶數(shù)Table 4 Sequence information and the number of bands amplified by primer combination of Flaveria bidentis under Cd stress

2.4 Cd 脅迫下黃頂菊葉片DNA 甲基化狀態(tài)變化

由表5 可知，利用MSAP 法分析Cd 處理下黃頂菊葉片基因組DNA 可能出現(xiàn)的甲基化狀態(tài)變化共有13種。 其中A、B、C、D 類均為與重金屬脅迫相關(guān)的甲基化條帶類型，而E 類為無變化帶型。 Cd-1、Cd-2、Cd-3 處理下黃頂菊去甲基化類型位點(diǎn)數(shù)分別為91、87 和92，分別占基因組DNA 總擴(kuò)增位點(diǎn)的14.15%、13.16%和13.65%；重新甲基化類型位點(diǎn)數(shù)分別為158、169 和165，分別占基因組DNA 總擴(kuò)增位點(diǎn)的24.57%、25.57%和24.48%；不定類型位點(diǎn)數(shù)分別為63、74 和74，分別占基因總擴(kuò)增位點(diǎn)的9.80%、11.20%和10.98%。 表明，在不同濃度Cd 脅迫下黃頂菊葉片基因組DNA 發(fā)生甲基化變異位點(diǎn)占總擴(kuò)增點(diǎn)位均依次表現(xiàn)為重新甲基化類型＞去甲基化類型＞不定類型，均以重新甲基化為主要變異類型。

2.5 黃頂菊各指標(biāo)表型可塑性指數(shù)與表觀遺傳的相關(guān)性分析

圖3 不同濃度Cd 脅迫下黃頂菊葉片各甲基化類型發(fā)生比例Fig.3 Proportion of methylation types in Flaveria bidentis leaves under different concentrations of Cd stress

黃頂菊各指標(biāo)表型可塑性指數(shù)的數(shù)據(jù)來源于前期試驗(yàn)研究(未公布)。 由于表觀遺傳變異是表型可塑性和適應(yīng)性反應(yīng)發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)，故進(jìn)一步將黃頂菊各指標(biāo)表型可塑性指數(shù)與甲基化水平做相關(guān)性分析。 由表6 可知，黃頂菊葉片DNA 全甲基化水平與總生物量和地上部耐受性指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、過氧化物酶(peroxidase，POD) 活性、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、根組織Cd 含量、莖組織Cd 含量、葉組織Cd 含量、地上部富集系數(shù)、根部富集系數(shù)及轉(zhuǎn)移系數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)；黃頂菊葉片整體甲基化水平與根長、總生物量及地上部耐受性指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與地上部富集系數(shù)呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，與SOD 活性、POD 活性、CAT 活性、MDA 含量、根組織Cd 含量、莖組織Cd 含量、葉組織Cd 含量、根部富集系數(shù)及轉(zhuǎn)移系數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。 上述結(jié)果表明， 黃頂菊在生長發(fā)育過程中， 主要發(fā)生5′-CCGG-3′胞嘧啶內(nèi)側(cè)全甲基化和5′-CCGG-3′胞嘧啶內(nèi)側(cè)外側(cè)全甲基化2 種變異，即DNA 全甲基化和整體甲基化水平升高，以增強(qiáng)Cd 脅迫下保護(hù)酶系統(tǒng)的表型可塑性及各組織對Cd 的富集與轉(zhuǎn)移能力，從而提高其耐受性；DNA 全甲基化和整體甲基化水平升高的同時(shí)可能抑制某些與植物生長發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致其生物量與地上部耐受性降低。

3 討論

研究表明，在外界環(huán)境的刺激下植物會(huì)產(chǎn)生表觀遺傳上的變異，DNA 甲基化是表觀遺傳的一種作用方式，其可在不改變基因組序列的情況下調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[23]。 基因的表達(dá)與甲基化水平密切相關(guān)，基因處于表達(dá)狀態(tài)時(shí)甲基化水平相對較低，而當(dāng)其受到逆境脅迫或者生長發(fā)育需要時(shí)，其啟動(dòng)子區(qū)域或者編碼區(qū)會(huì)發(fā)生重新甲基化來終止基因表達(dá)[24]。 植物調(diào)控甲基化的方式一般有2 種，一是通過體內(nèi)的甲基轉(zhuǎn)移酶控制甲基轉(zhuǎn)移到各種化合物上發(fā)生甲基化；二是在逆境條件下，發(fā)生氧化脅迫產(chǎn)生大量甲基自由基對胞嘧啶進(jìn)行取代，對DNA 造成損傷形成甲基化[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)普遍存在胞嘧啶甲基化現(xiàn)象，植物體內(nèi)有6%～25%的胞嘧啶會(huì)發(fā)生甲基化修飾的現(xiàn)象，且同一植物的不同器官及同一器官的不同發(fā)育階段胞嘧啶甲基化水平也存在差異[27-29]。 逆境脅迫也會(huì)影響植物的甲基化水平，環(huán)境刺激會(huì)誘導(dǎo)植物的甲基化多態(tài)性，如葛才林等[30]研究發(fā)現(xiàn)0.025～0.1 mmol·L-1的重金屬Cd2＋、Cu2＋和Hg2＋會(huì)提高小麥或者水稻葉片DNA 中的5-甲基胞嘧啶含量；過量的Cd2＋會(huì)抑制種子萌發(fā)及幼苗生長，且會(huì)導(dǎo)致植物膜脂過氧化，產(chǎn)生大量活性氧，進(jìn)而改變整體甲基化水平[31]；重金屬Cr6＋能提高小麥根部DNA 胞嘧啶甲基化水平，從而影響其生長發(fā)育[32]。 本研究中，黃頂菊在不同Cd 濃度脅迫下半甲基化水平、全甲基化水平及整體甲基化水平均隨著Cd 脅迫濃度的升高呈逐漸增加的趨勢，且全甲基化和整體甲基化水平顯著增加。

表5 不同濃度Cd 脅迫下黃頂菊葉片甲基化狀態(tài)變化Table 5 Changes of methylation status of Flaveria bidentis leaves under different concentrations of Cd stress

植物主要通過重新甲基化和去甲基化2 種模式調(diào)節(jié)其基因表達(dá)，體內(nèi)甲基化模式的改變，是抵御逆境脅迫的一種保護(hù)方式[33]。 殷欣[34]研究發(fā)現(xiàn)大豆在重金屬Cd 處理下，其DNA 甲基化模式的改變主要以發(fā)生重新甲基化為主，基因組DNA 可能通過甲基化關(guān)閉某些相關(guān)基因的表達(dá)并抑制轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)機(jī)體對不良環(huán)境的抵抗；楊金蘭等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬Cd 脅迫下蘿卜主要通過重新甲基化模式啟動(dòng)對脅迫的能動(dòng)應(yīng)激機(jī)制，降低Cd 的毒害作用。 本研究中在2、4 和8 mg·kg-1Cd 濃度脅迫下黃頂菊DNA 重新甲基化的發(fā)生位點(diǎn)數(shù)分別占基因總擴(kuò)增位點(diǎn)的24.57%、25.57%和24.48%，而去甲基化類型位點(diǎn)數(shù)僅占基因組DNA總擴(kuò)增位點(diǎn)的14.15%、13.16%和13.65%，以發(fā)生重新甲基化類型為主，其原因可能是黃頂菊在重金屬Cd脅迫下通過發(fā)生DNA 重新甲基化關(guān)閉某些基因的表達(dá)，或?qū)S頂菊造成了氧化脅迫，導(dǎo)致其特定位點(diǎn)發(fā)生甲基化，這與前人研究結(jié)果一致[36]。

表6 黃頂菊各指標(biāo)的表型可塑性與甲基化水平的相關(guān)性Table 6 Correlation between phenotypic plasticity and methylation level of various indexes of Flaveria bidentis

表型可塑性會(huì)影響外來入侵植物的形態(tài)和地理分布特征，這也是其蔓延擴(kuò)張的重要機(jī)制，是表觀遺傳學(xué)研究重要的一部分，表型可塑性越強(qiáng)，其資源獲得性就越強(qiáng)，植物適應(yīng)新環(huán)境的能力也越強(qiáng)[13，37]。 本研究中，黃頂菊各生長指標(biāo)和地上部耐受性指數(shù)的表型可塑性指數(shù)與葉片全甲基化水平和整體甲基化水平均呈負(fù)相關(guān)，其原因可能是甲基化水平的增強(qiáng)關(guān)閉了某些基因的表達(dá)，從而抑制了黃頂菊的生長；Karan 等[38]研究發(fā)現(xiàn)基因組甲基化水平發(fā)生變化的同時(shí)也會(huì)影響其他調(diào)節(jié)機(jī)制的功能。 本研究中抗氧化酶活性、植株各組織內(nèi)Cd 含量及富集系數(shù)與轉(zhuǎn)移系數(shù)的表型可塑性與甲基化水平呈正相關(guān)，表明甲基化水平的增強(qiáng)可能減弱逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子修飾或轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用，從而增強(qiáng)其調(diào)控的抗氧化酶活性及對Cd 的轉(zhuǎn)移能力。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，重金屬Cd 脅迫下黃頂菊葉片的甲基化水平與模式均發(fā)生了變化，Cd 濃度的增加會(huì)誘導(dǎo)甲基化水平的升高，且主要發(fā)生重新甲基化模式變化；黃頂菊對Cd 污染生境具有一定的耐受性，黃頂菊主要通過調(diào)節(jié)保護(hù)酶系統(tǒng)的表型可塑性及各組織對Cd 的富集與轉(zhuǎn)移能力來提高其耐受性，而DNA 全甲基化和整體甲基化水平升高引起的生長指標(biāo)表型可塑性的降低導(dǎo)致植物生長和生物量積累的減弱，為該生境下黃頂菊的適應(yīng)性生長提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，但其葉片甲基化變異發(fā)生的具體基因位點(diǎn)及對重金屬生境的適應(yīng)性的詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。