代明笠 邱先進 陳 凱 黃來健 盧宗強 聞乃強 邢丹英 徐建龍

(1長江大學/主要糧食作物產業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊州 434025；2中國農業(yè)科學院農業(yè)基因組研究所，廣東 深圳 518210；3廣東省惠州市惠陽區(qū)農業(yè)科學研究所，廣東 惠陽 516100；4中國農業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081)

水稻(Oryza sativaL)是世界上最主要的糧食作物之一，高產始終是最重要的育種目標[1-2]。 水稻產量的高低主要取決于源、庫、流的大小及彼此之間的協(xié)調程度，其中穗粒數(shù)和籽粒大小或重量是光合產物積累的主要庫性狀，上三葉特別是劍葉是光合產物生產的主要源性狀[3-5]。 充分挖掘已克隆的產量相關基因的優(yōu)異單倍型，鑒定不同基因優(yōu)異單倍型的聚合效應，通過分子聚合育種手段培育超高產的品種是未來水稻育種的重要研究方向。

迄今已有不少控制源、庫相關性狀的主效基因被精細定位或克隆，如籽粒大小或粒重基因GS3[6]、GW2[7]、qSW5[8]/GW5[9]，葉片大小和穗粒數(shù)基因qFSR4[10]、qFL1.1[11]、SS1 (NAL1 )[12-13]、SS2(GNP1)[13-14]，株高、抽穗期和穗粒數(shù)基因Ghd7[15-16]和Ghd8[17]等。 其中Ghd7 和Ghd8 是2 個多效性基因，同時控制抽穗期、株高和穗粒數(shù)，分別位于水稻第7 和第8 染色體。Ghd7 編碼一個CCT(CO、COL、TOC1)結構蛋白，其表達和功能受光周期調控。 該基因的編碼蛋白不僅參與開花的調控，而且對植株的生長、分化及生物學產量有普遍的促進效應。 在長日照條件下，Ghd7 基因的表達增強，從而推遲抽穗，植株增高，穗子變大，穗粒數(shù)增多[16]。 此外，Ghd7 還控制水稻劍葉長寬和葉面積，影響源性狀[18]。Gdh8 編碼一個含有CBFD＿NFYB＿HMF 結構域的多肽。 長日照條件下，Ghd8 通過調節(jié)Ehd1、RFT1 和Hd3a延遲水稻開花，但短日照條件下可促進水稻開花[17]。 此外，Ghd8能夠上調水稻分蘗發(fā)生基因MOC1 的表達，從而增加水稻的分蘗數(shù)、一次枝梗數(shù)和二次枝梗數(shù)[17]。NAL1位于第4 染色體，包含5 個外顯子，編碼蛋白由582 氨基酸組成，通過影響水稻生長素的極性運輸調控植物葉寬和株高[13]，同時也調控葉綠素含量、每穗粒數(shù)和穗型[19]。GNP1 編碼一個GA20 氧化酶，它是催化赤霉素生物合成倒數(shù)第二步反應的關鍵酶。GNP1 基因在水稻營養(yǎng)生長階段促進植株長高和葉鞘伸長，在生殖生長階段通過增加水稻穗部分生組織中的細胞分裂素活性，提高籽粒數(shù)量和產量[15]。 上述4 個基因均直接調控水稻源、庫相關性狀的形成，對提高水稻產量具有重要的應用價值。 但是，它們聚合后的產量效應和對產量組成性狀的影響還沒有系統(tǒng)的報道。

前期中國農業(yè)科學院作物科學研究所水稻分子育種實驗室從華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室引進Ghd7 和Ghd8 2 個基因導入珍汕97B 背景的近等基因系材料[16-17]，并構建了特青背景的NAL1 和Lemont 背景的GNP1 近等基因導入系。 本研究將這4個基因的近等基因系兩兩相互雜交，構建6 個雙基因聚合的分離群體，利用這4 個基因的功能標記或緊密連鎖的標記對分離群體進行基因型鑒定，比較不同雙基因聚合系的源庫性狀表現(xiàn)，分析基因聚合效應，旨在為分子標記輔助聚合改良水稻庫源性狀和進一步提高產量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

前期以美國優(yōu)質粳稻品種Lemont(LT)、我國高產秈稻品種特青(TQ)為親本，構建了NAL1 位點LT 等位基因導入TQ 背景的近等基因系TQ-NAL1LT，GNP1位點TQ 等位基因導入LT 背景的近等基因系LTGNP1TQ。 引進Ghd7 位點明恢63 等位基因和Ghd8 位點9311 等位基因導入珍汕97B(ZS97)背景的近等基因系ZS97-Ghd7MH63和ZS97-Ghd89311。 其中NAL1 的有利等位基因來源于LT，增加劍葉寬、每穗粒數(shù)和產量；GNP1 的有利等位基因來源于TQ，增加劍葉長、每穗粒數(shù)和產量；Ghd7 和Ghd8 的有利等位基因分別來源于明恢63 和9311，在長日照條件下延遲開花，增加株高、穗粒數(shù)和產量。 本研究以上述4 個單基因近等基因系作為親本，兩兩雜交構建6 個組合的F2分離群體，即TQ-NAL1LT/LT-GNP1TQ(Pop1)、TQ-NAL1LT/ZS97-Ghd7MH63(Pop2)、TQ-NAL1LT/ZS97-Ghd89311(Pop3)、LT-GNP1TQ/ZS97-Ghd7MH63(Pop4)、LT-GNP1TQ/ZS97-Ghd89311(Pop5) 和 ZS97 -Ghd7MH63/ZS97 -Ghd89311(Pop6)，用于不同雙基因聚合體的篩選。

1.2 DNA 提取和標記輔助選擇

試驗地點在深圳市中國農業(yè)科學院深圳生物育種創(chuàng)新研究院試驗農場，2016 年6 月20 日播種，7 月15日單本移栽上述6 個F2分離群體，每行10 株，每個群體的雙親各種植3 行，每個F2群體種植30 ～40 行不等，單本種植，種植行株距為20 cm×15 cm。 在水稻移栽返青后，每群體單株按對應株行位置編號，逐株取嫩葉，參照CTAB 法[20]提取DNA。

查找公開發(fā)表的4 個基因的緊密連鎖標記或功能標記，獲得了26 個緊密連鎖的SSR 和InDel 標記，經雙親多態(tài)性篩選最終得到7 個在雙親間有多態(tài)性的標記(表1)，用于PCR 擴增和電泳，進行分子標記輔助鑒定篩選聚合群體中的單基因純合和雙基因純合個體，選收目標單株種子用于F3性狀考查。 PCR 反應和凝膠電泳參照Murry 等[20]的方法。

表1 用于標記輔助選擇的多態(tài)標記信息Table 1 Information of polymorphic markers used for marker-assisted selection

1.3 F3 株系的田間種植與性狀考察

試驗地點在海南省三亞市崖州區(qū)南濱農場中國農業(yè)科學院作物科學研究所試驗基地，于2016 年11 月25 日播種，12 月20 日單本移栽所有組合入選的F3家系及親本株系。 每個組合的F3家系和對應的雙親挨在一起，F(xiàn)3家系和雙親完全隨機排列，每份材料單本種植2 行，每行10 株，3 次重復，種植行株距為20 cm×15 cm，田間管理同常規(guī)大田管理。 齊穗后每株選其最高的穗測量其劍葉長、寬，測量株高和考查單株有效穗數(shù)，根據劍葉長×劍葉寬×0.75 計算劍葉面積[21]。 成熟后每株收取上述1 個主穗，考察穗長、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、每穗穎花數(shù)、每穗實粒數(shù)和千粒重等性狀，最后按株系混收測產，加上穗部取樣的谷重合并計算單株平均產量。

1.4 雙基因聚合系的選育及在多個環(huán)境下的產量評價

對產量聚合效應明顯的3 對聚合系NAL1LT＋Ghd7MH63、NAL1LT＋Ghd89311和Ghd7MH63＋Ghd89311，2017年春季，從每種雙基因聚合及對應的單基因F3株系中分別選擇株高、抽穗期較一致且產量表現(xiàn)最好的1 個株系，從中選收5 個代表單株，采用每個基因緊密連鎖的分子標記鑒定目標單基因和雙基因的純合性。 2017年夏季，在廣東省惠州市惠陽區(qū)農業(yè)科學研究所基地種植F4株系，同樣從每種雙基因聚合系及對應的單基因系中選綜合性狀整齊一致且產量最好的1 個株系，選收5 個代表單株并進行目標基因型的標記輔助鑒定。 入選的單株于2017 年冬季在海南加代種植F5株系，從每種雙基因聚合系及對應的單基因系中選綜合性狀表現(xiàn)穩(wěn)定一致且產量最好的1 個株系混收。 2017年夏季在浙江杭州、江西萍鄉(xiāng)和廣東惠州進行小區(qū)品比試驗，3 個試驗點的播種期分別為5 月25 日、5 月26 日和7 月10 日，播種25 d 秧齡單本移栽，以黃華占為對照，每小區(qū)種植1.3 × 10-3hm2，行株距20 cm ×15 cm，3 次重復，大田管理遵循當?shù)厣a習慣。 成熟后小區(qū)實測產量，分析不同基因聚合系在不同環(huán)境下的產量表現(xiàn)。

1.5 數(shù)據分析

取株系內各單株測量值的平均值，代表株系的性狀值用于統(tǒng)計分析；小區(qū)測產時以小區(qū)的平均產量用于統(tǒng)計分析。 采用SAS 9.2 軟件進行多重比較和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 標記輔助鑒定不同基因聚合體

由表2 可知，利用RM3534 和SL40 從TQ-NAL1LT/LT-GNP1TQ(Pop1) 的F2分離群體中，篩選到帶有NAL1LT單基因純合且不帶GNP1TQ基因的單株20 株，帶有GNP1TQ單基因型純合且不帶NAL1LT基因的單株21 株，同時帶有雙基因(NAL1LT＋GNP1TQ)純合的單株15 株。 利用RM3534 和RM5436 從TQ-NAL1LT/ZS97-Ghd7MH63(Pop2)的F2群體中篩選到NAL1LT單基因型純合但不帶Ghd7MH63基因的單株17 株，Ghd7MH63單基因型純合但不帶NAL1LT基因的單株15 株，同時帶有雙基因(NAL1LT＋Ghd7MH63)純合的單株14 株。 同樣地，利用各基因的多態(tài)性連鎖或功能標記從其他(Pop3～Pop6)4 個F2群體中分別篩選到18、20、22 和15 株NAL1LT＋Ghd89311、GNP1TQ＋Ghd7MH63、GNP1TQ＋Ghd89311和Ghd7MH63＋Ghd89311不同雙基因純合聚合單株。 上述各群體中入選的單基因和雙基因純合體收獲自交種子用于F3株系性狀評價。

2.2 不同源庫基因兩兩聚合的效應分析

在2 個單基因系雜交的F2群體中利用與每個基因的緊密連鎖或功能標記輔助選擇單基因個體和雙基因聚合體，比較只有2 個基因位點差異的個體性狀值，可以在近似遺傳背景下分析雙基因的聚合效應。 由表3 可知，在海南種植環(huán)境下，NAL1 單基因系的劍葉寬與雙基因(NAL1 ＋GNP1)聚合系相似，但顯著寬于GNP1 單基因系；雙基因聚合系的千粒重顯著低于雙親，聚合后的單株產量低于雙親，但未達到顯著水平。

NAL1 單基因系的劍葉長、穗長和千粒重顯著小于Ghd7 單基因系(表3)。 與雙親單基因系相比，雙基因聚合系的一次枝梗數(shù)和每穗穎花數(shù)較NLA1 單基因系顯著增加，二次枝梗數(shù)和每穗實粒數(shù)較Ghd7 單基因系顯著增加，但穗長顯著減??；雙基因聚合系的單株產量較NAL1 和Ghd7 單基因系分別顯著增加37.01%和26.45%，表明NAL1 與Ghd7 聚合后具有顯著的增產效果。

NAL1 單基因系的劍葉寬顯著寬于Ghd8 單基因系，但單株有效穗數(shù)顯著少于Ghd8(表3)。 與雙親單基因系相比，NAL1 和Ghd8 基因聚合系在9 個性狀存在差異顯著。 雙基因聚合系的單株有效穗數(shù)顯著多于NAL1 單基因系，株高、劍葉寬、每穗穎花數(shù)和每穗實粒數(shù)則顯著高于Ghd8 單基因系；此外，雙基因聚合系的劍葉長、劍葉面積、二次枝梗數(shù)和單株產量均顯著高于雙親單基因，其中雙基因聚合系的單株產量分別較NAL1 和Ghd8 單基因系顯著增加73.72%和45.47%，表明NAL1 和Ghd8 聚合的產量效應顯著。

GNP1 單基因系的劍葉寬、劍葉面積和千粒重分別比Ghd7 單基因系顯著小0.18 cm、6.68 cm2和2.70 g(表3)。 雙基因聚合后有9 個性狀與單基因親本具有顯著差異，其中雙基因聚合系的株高、劍葉長、劍葉寬和劍葉面積分別較GNP1 單基因系顯著增加但每穗穎花數(shù)則顯著減少；一次枝梗數(shù)和千粒重比Ghd7 單基因系顯著減少；雙基因聚合系的穗長較GNP1 和Ghd7 2 個單基因系顯著增長但每穗實粒數(shù)均顯著減少。 雙基因聚合系的單株產量與2 個單基因系均無顯著差異，表明GNP1 和Ghd7 聚合無明顯的增產效應。

表2 6 個F2 聚合群體中篩選出的純合單基因和雙基因個體數(shù)Table 2 Number of individuals with homozygous single and two genes selected from six F2 pyramiding populations

GNP1 和Ghd8 2 個單基因系之間在所有考查的性狀上均無顯著差異(表3)。 雙基因聚合系的每穗穎花數(shù)和每穗實粒數(shù)較GNP1 單基因系分別顯著減少，株高較Ghd8 單基因系顯著增加，穗長比GNP1 和Ghd8 2個單基因系均顯著增長；雙基因聚合系的單株產量與GNP1 單基因系基本持平，但較Ghd8 單基因系顯著降低(29.40%)，表明GNP1 和Ghd8 聚合對產量沒有正向效應。

除Ghd7 單基因系的株高和千粒重顯著高于Ghd8單基因系外，其他性狀兩者間均無顯著差異(表3)。雙基因聚合系的株高和千粒重均較Ghd8 單基因系顯著增加，單株有效穗數(shù)和結實率均較Ghd7 和Ghd8 2個單基因系顯著增加，最終導致雙基因聚合系的單株產量比2 個單基因系分別顯著增加63.15% 和48.03%，表明Ghd7 與Ghd8 聚合具有顯著的增產優(yōu)勢。

2.3 優(yōu)良聚合系的產量表現(xiàn)

由表4 可知，NAL1LT＋Ghd7MH63聚合系在杭州、萍鄉(xiāng)和惠州3 個環(huán)境下的平均產量分別為570.93、560.30 和544.60 kg·667m-2，分別較對照品種黃華占顯著增加6.63%、6.43%和5.06%；NAL1LT＋Ghd89311在3 個環(huán)境下的平均產量分別為582.07、573.63 和561.17 kg·667m-2，分別較對照極顯著增加8.71%、8.96%和8.26%；Ghd7MH63＋Ghd89311在3 個環(huán)境下的平均產量分別為585.07、570.20 和555.87 kg·667m-2，分別較對照顯著或極顯著增加9.27%、8.31%和7.23%。 3 對雙基因聚合系之間相比發(fā)現(xiàn)，NAL1LT＋Ghd89311在杭州、萍鄉(xiāng)和惠州3 個環(huán)境下的平均產量分別比NAL1LT＋Ghd7MH63增加1.95%、2.38%和3.04%，但與Ghd7MH6＋Ghd89311在3 個環(huán)境下的產量基本持平。

表3 不同源庫相關基因聚合系的源、庫及產量相關性狀的表現(xiàn)Table 3 Performances of sink-， source- and yield-related traits in pyramiding F3 lines

表4 3 種雙基因聚合系在不同溫光環(huán)境下的產量表現(xiàn)Table 4 Performances of grain yield of three types of pyramiding lines in different thermo-photoperiod conditions

3 討論

3.1 水稻源庫流大小及其協(xié)調性對產量的影響

提高單產一直是全世界范圍水稻育種的最重要目標。 水稻產量的高低取決于源大小、庫容量和光合產物運輸能力(流大小)及三者間的協(xié)調程度[3-5]。 水稻高產基因NAL1[12]、GNP1[14]、Ghd7[16]和Ghd8[17]均表現(xiàn)一因多效，影響不同的源庫性狀，如劍葉長、劍葉寬、劍葉大小、穗粒數(shù)、抽穗期和株高等。 在海南短日照條件下，從產量要素的單株有效穗數(shù)、每穗穎花數(shù)、千粒重和結實率來看(表3)，4 個單基因系的源庫流比較協(xié)調，彼此間的單株產量無顯著差異。 通過對2 個單基因系雜交的F2群體中每個基因的標記進行輔助鑒定，篩選出單基因個體和雙基因聚合體，由于F2個體的遺傳背景是隨機的，因此由一定數(shù)量組成的單基因個體與雙基因聚合體之間只是目標基因區(qū)段的差異，單株之間的背景差異已基本相互抵消。 所以，通過比較雙基因聚合體與2 個單基因親本之間的性狀差異，可以在近似遺傳背景下解析雙基因的聚合效應。 本研究發(fā)現(xiàn)這4 個源庫相關基因兩兩聚合后對源、庫構成因子及產量相關性狀的影響不盡相同，導致單株產量存在顯著差異。 如NAL1LT與GNP1TQ聚合后的單株有效穗數(shù)不足，造成植株水平的光合作用葉面積(源)小，盡管每穗粒數(shù)不少但千粒重低，庫容量受到限制，導致較低的單株產量。 盡管GNP1TQ與Ghd7MH63和GNP1TQ與Ghd89311聚合后的源庫相關性狀協(xié)調，但可能由于光合產物從葉片向籽粒輸送的流不暢，表現(xiàn)結實率低，造成每穗實粒數(shù)不高，同樣導致單株產量不高。 相 反，NAL1LT＋Ghd7HM63、NAL1LT＋Ghd89311和Ghd7HM63＋Ghd89311這3 種基因聚合方式表現(xiàn)出較明顯的增產效應，聚合系的單株產量分別較高親值顯著增加26.45%、45.47%和48.03%。 分析認為，這3 種聚合系的產量提高得益于基因聚合后的源、庫及產量相關性狀都有不同程度的提高，而且彼此間的協(xié)調性較好。 相對而言，NAL1LT＋Ghd7HM63和NAL1LT＋Ghd89311聚合體屬大穗類型，表現(xiàn)單株有效穗數(shù)偏少但每穗粒數(shù)較多；而Ghd7HM63＋Ghd89311屬多穗類型，表現(xiàn)單株有效穗較多，每穗粒數(shù)相對偏少。 在實際生產上，大穗型品種和多穗型品種都有高產的事例[21-22]，前者趨向在高肥條件下易獲得高產，而后者在較低肥料投入下也有較好的產量表現(xiàn)。 通過在浙江杭州、江西萍鄉(xiāng)和廣東惠州的不同溫光環(huán)境下測試聚合系的產量發(fā)現(xiàn)，上述3 種源庫相關基因(NAL1LT、Ghd7HM63和Ghd89311)兩兩聚合均表現(xiàn)出穩(wěn)定的產量水平，單位產量(hm2)均顯著高于目前大面積種植的優(yōu)質常規(guī)品種黃華占。 因此，將NAL1LT、Ghd7HM63和Ghd89311這3 個高產有利等位基因按上述組合方式導入到高產秈稻品種背景，有望進一步提高其產量水平。

3.2 有利基因聚合是復雜性狀改良的有效途徑

基因聚合不論對簡單的質量性狀如抗病蟲性[23-28]，還是對復雜的數(shù)量性狀如抗旱[29]、耐鹽性[30]、耐冷[31]等都有明顯的改良效果。 本研究中，NAL1LT是來自美國熱帶粳稻Lemont 的高產基因[13]，GNP1TQ是來自我國廣東的高產品種特青的高產基因[13-14]，Ghd7HM63和Ghd89311則分別是來自明恢63 和9311 的高產基因[16-17]。 不同有利基因聚合后如果在功能上能互補，那么提高性狀的正向聚合效應就明顯，如NAL1LT、Ghd7HM63和Ghd893113 個高產基因兩兩間聚合，其產量均較聚合雙親顯著增加。 而另外3 種聚合方式(NAL1LT＋GNP1TQ、GNP1TQ＋Ghd7MH63和GNP1TQ＋Ghd89311)的源、庫和產量相關性狀與雙親相比，有增、有減或基本持平，聚合后的產量未明顯提升，說明這3種基因的聚合對產量性狀不具備互補性優(yōu)勢。 目前聚合育種大多局限于2～3 對少數(shù)主基因的聚合。 2 個基因聚合的互作分為加性×加性、加性×顯性、顯性×加性和顯性×顯性4 種互作模式，作物育種上基因聚合一般考慮的是加性×加性互作。 如果基因互作表現(xiàn)為正向協(xié)同作用，則基因聚合會表現(xiàn)出累加效應。 反之，如果基因互作表現(xiàn)為負向拮抗作用，則基因聚合往往與單基因效果一致，甚至還不如單基因的效果。 Wang等[32]通過抗旱QTL 聚合研究發(fā)現(xiàn)，只有將遺傳上和生理上具有協(xié)同作用的不同有利基因聚合，才有可能獲得性狀明顯增加的聚合效應。 因此，在實施聚合育種之前，有必要先鑒定雙親基因聚合是否具有遺傳和生理上的協(xié)同效應，選擇互為協(xié)同作用明顯的有利基因聚合方式應用于品種改良實踐，方能達到預期的效果。

4 結論

本研究利用4 個產量相關基因NAL1LT、GNP1TQ、Ghd7MH63和Ghd89311兩兩雜交篩選出的單基因和不同雙基因聚合的純合F3株系，在海南短日照條件下考察了單基因系及雙基因聚合系的14 個源、庫和產量相關性狀，發(fā)現(xiàn)不同源、庫基因聚合的增產效果不同，其中NAL1LT＋Ghd7MH63、NAL1LT＋Ghd89311和Ghd7MH63＋Ghd89311聚合系增產效果顯著，聚合系在不同溫光條件下表現(xiàn)穩(wěn)定高產，聚合系可以作為高產育種的親本利用。 另外3 種聚合方式NAL1LT＋GNP1TQ、GNP1TQ＋Ghd7MH63和GNP1TQ＋Ghd89311的聚合效果不佳。 研究指出，復雜性狀基因的聚合育種，需要首先開展基因間的聚合效應研究，明確不同基因之間的聚合效應，以確保聚合育種獲得預期的效果。