程劍，羅鳴鐘，魏巍，李銳

（1.上饒幼兒師范高等?？茖W(xué)校，江西 上饒 334000；2.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌），浙江 杭州 310021）

黑斑蛙Rana nigromaculata 是我國分布最廣的水產(chǎn)養(yǎng)殖兩棲動物之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。2018年，我國蛙類總產(chǎn)量已超過10 萬t，比2017年增長了11.57%，在全國水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量中增長迅速[2]。黑斑蛙肌肉中粗蛋白含量高于中國林蛙R.Chensinensis、虎紋蛙R.tigrina、棘胸蛙R.spinosa等經(jīng)濟(jì)蛙類，而脂肪含量僅為0.35%，鮮味氨基酸含量高于牛蛙R.catesbeina，具有高蛋白、低脂肪、味道鮮美的特點(diǎn)[3,4]。水域生態(tài)環(huán)境污染以及過度捕撈使黑斑蛙自然資源量急劇減少，1989年野生黑斑蛙已列為我國的二級野生保護(hù)動物。黑斑蛙的人工養(yǎng)殖業(yè)逐步發(fā)展起來，主要以稻田圍網(wǎng)、仿生態(tài)養(yǎng)殖為主，也有池塘精養(yǎng)、大棚養(yǎng)殖等模式。藥物和水產(chǎn)消毒劑如高錳酸鉀、硫酸錳等的濫用，嚴(yán)重影響了黑斑蛙養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

黑斑蛙為兩棲動物，皮膚具有滲透水分和交換氣體的能力，其繁殖活動和幼體（蝌蚪）發(fā)育均在水中進(jìn)行，水域的污染直接影響其生長、生殖、發(fā)育、內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)和血液循環(huán)等。黑斑蛙蝌蚪階段細(xì)胞分裂旺盛，對環(huán)境的變化極為敏感，因此常用作水環(huán)境質(zhì)量指示生物[1,5-7]。目前，利用黑斑蛙蝌蚪及胚胎評估化學(xué)品生態(tài)毒性，已有大量研究。急性毒性研究發(fā)現(xiàn)，常見重金屬離子對黑斑蛙蝌蚪的毒性大小依次為：Hg2+＞Cu2+＞Cd2+＞Cr6+＞Pb2+[8]；養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)也表明，隨著鎘離子濃度的升高，蝌蚪的體質(zhì)量和長度的增長率降低，完全變態(tài)所需時間增長[9]。在農(nóng)藥殺蟲劑方面，報(bào)道了氯氰菊酯[10]、三唑酮[11]、環(huán)丙唑醇[12]、甲胺磷[13]、三氯殺螨醇[14]和異噻唑啉酮類殺菌劑[15]等對黑斑蛙蝌蚪的急性和慢性毒性效應(yīng)。有機(jī)化合物雙酚A[5]、壬基酚[6]、苯胺[7]、離子液體[C8mim]Br[16]等的毒性也做了研究。

消毒劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮著重要作用，主要用于養(yǎng)殖水體清塘、苗種下塘前藥浴、疾病防治等，合理、科學(xué)使用消毒劑，能有效殺滅養(yǎng)殖環(huán)境中的病原微生物，防止疾病的發(fā)生。目前，關(guān)于硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀[17]、氯化鈉等常見消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的急性毒性研究罕見報(bào)道。

通過了解常用水產(chǎn)消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的毒性效應(yīng)，對于規(guī)范用藥，完善黑斑蛙生態(tài)繁養(yǎng)技術(shù)具有重要的實(shí)踐意義。本實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)水生生物急性毒性實(shí)驗(yàn)法，研究生產(chǎn)中常用的硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀和氯化鈉對黑斑蛙蝌蚪的急性毒性效應(yīng)，得出半致死濃度、安全濃度以及藥物毒性蓄積程度系數(shù)，以期為黑斑蛙野生資源的保護(hù)以及人工繁育技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用蝌蚪體質(zhì)量為（0.31±0.04）g，體長為（2.55±0.27）cm，由長江大學(xué)水產(chǎn)基地提供，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室塑料箱中，用曝氣的自來水，連續(xù)充氣，溫度為（20.0±1.5）℃，pH 為（7.25±0.25），溶氧≥6.0mg/L，光照周期12 h 光照∶12 h 黑暗。挑選外觀正常，體質(zhì)健康，規(guī)格接近的個體用于實(shí)驗(yàn)。

聚維酮碘購自山西華坤生物科技有限公司，有效成分10%；硫酸銅、高錳酸鉀和氯化鈉購自湖北康盛醫(yī)藥科技有限公司，分析純，有效成分99%。按4 種消毒劑的使用說明上的有效濃度用雙蒸水配置母液，實(shí)驗(yàn)時由母液稀釋成試驗(yàn)液。

1.2 方法

48h 的預(yù)實(shí)驗(yàn)得出蝌蚪的最大無死亡質(zhì)量濃度和全部致死濃度。依此設(shè)計(jì)了6 個等對數(shù)間距的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度梯度（表1）。每組設(shè)3 個平行組，1 個空白對照組，每組10 尾蝌蚪。

實(shí)驗(yàn)期間不投餌，每隔24h 更換藥液1 次，實(shí)驗(yàn)期間各組水質(zhì)一致。實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)方式水生生物急性毒性實(shí)驗(yàn)法[18]。實(shí)驗(yàn)開始后12h 連續(xù)觀察蝌蚪的反應(yīng)及運(yùn)動情況并記錄，在24h、48h、72h、96h觀察蝌蚪的死亡數(shù)據(jù)并及時清出死亡個體。

表1 4 種水產(chǎn)消毒劑的實(shí)驗(yàn)濃度Tab.1 The concentrations of four aquaculture disinfectants in the experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用寇式法（Karber）計(jì)算半致死濃度（LC50）、安全濃度（SC）和半致死濃度的95%置信區(qū)間（CI），并以實(shí)驗(yàn)濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)與死亡率為縱坐標(biāo)做直線回歸方程[18]，利用藥物毒性蓄積程度系數(shù)（MAC）來分析蝌蚪體內(nèi)對藥物蓄積和降解的變化，相關(guān)計(jì)算公式如下：

半致死濃度（LC50，mg/L）：LogLC50=Xm-d（∑p-0.5）；

安全濃度（SC，mg/L）：SC=48hLC50×0.3/（24hLC50/48hLC50）2；

半致死濃度95%置信區(qū)間（CI，mg/L）：95%CI=LogLC50±1.96×d［∑（pg/n）］0.5；

藥物毒性蓄積程度系數(shù)（MAC，%）：MAC=100%×（t1LC50-t2LC50）/（t0LC50-tmLC50）。

上式中：Xm為消毒劑最大濃度的對數(shù)，d 為相鄰濃度的對數(shù)差值，P 為死亡率（%），∑p 為各組死亡率之和，g 為存活率（%），n 為每組實(shí)驗(yàn)蝌蚪的尾數(shù)；t1LC50和t2LC50為t1和t2時的半致死濃度值（mg/L），t0LC50和tmLC50分別為實(shí)驗(yàn)初始和結(jié)束時半致死濃度（mg/L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 中毒癥狀

實(shí)驗(yàn)前6h，4 種水產(chǎn)消毒劑高濃度組（濃度Ⅴ和Ⅵ）的蝌蚪開始興奮，游動迅速、上下攪動水體、趨邊游動或沖撞塑料箱沿壁；高錳酸鉀組中蝌蚪反應(yīng)較為強(qiáng)烈，劇烈游動，肛門有淺紅色絲狀粘稠物排出，體表出現(xiàn)粘液；中低濃度組（濃度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）的蝌蚪出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，如浮頭、靜止不動、呼吸不暢等癥狀，但過一段時間后逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)，而氯化鈉組中蝌蚪分泌粘液最為明顯。6h 后高濃度組的蝌蚪身體逐漸地失去平衡，漂浮于水面，呼吸逐漸減弱，身體扭曲，翻轉(zhuǎn)，游動緩慢，有部分側(cè)翻，最后沉底死亡。4 種消毒劑中死亡蝌蚪癥狀存在不同：硫酸銅組中毒死亡的蝌蚪腹部膨大，嘴部出現(xiàn)白色絮狀黏濁物，尾部僵硬彎曲，逐漸脫水，體積縮小，體色呈淡藍(lán)色；聚維酮碘組中毒死亡的大部分蝌蚪肛門有糞便排出；高錳酸鉀中死亡個體尾梢上翹，縮水變小，蝌蚪體色微呈淡紅色；而氯化鈉組中毒死亡的蝌蚪脫水嚴(yán)重，體型縮小明顯，尾部彎曲，泄殖孔排泄出白色的絮狀粘稠物，體表有大量粘液附著。

表2 4 種水產(chǎn)消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的致死率Tab.2 Mortalities of tadpoles of frog R.nigromaculata exposed to the four aquaculture disinfectants

2.2 急性致死效應(yīng)

在96 h 的急性毒性實(shí)驗(yàn)中，對照組的蝌蚪均未發(fā)生死亡，各消毒劑處理組蝌蚪的死亡率隨藥物濃度增加、實(shí)驗(yàn)時間的延長而上升（表2）。

低濃度組（濃度Ⅰ和Ⅱ）的氯化鈉對黑斑蛙蝌蚪的急性致死效應(yīng)最小，96 h 的死亡率不超過10%；高錳酸鉀的急性致死效應(yīng)較小，96 h 的死亡率為36.67%；硫酸銅和聚維酮碘對黑斑蛙蝌蚪的急性致死效應(yīng)較大，96 h 的死亡率均超過為50%。中高濃度組（濃度Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ）中，四種水產(chǎn)消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的急性致死效應(yīng)較大，96 h 時各組均存在100%的死亡率。在最高濃度的實(shí)驗(yàn)中，除24 h時的聚維酮碘，其余時間各組均100%死亡。

2.3 半致死濃度和毒性蓄積效應(yīng)

硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀、氯化鈉對黑斑蛙蝌蚪的24h、48h、72h 和96h 的半致死濃度LC50、半致死濃度的95%置信區(qū)間CI、藥物毒性蓄積程度系數(shù)MAC 和安全濃度SC 見表3。由表3 可知：半致死濃度均隨實(shí)驗(yàn)時間的延長而下降，硫酸銅對黑斑蛙蝌蚪24h、48h、72h 和96h 的半致死濃度分別為3.503 mg/L、3.061 mg/L、2.183 mg/L 和1.689mg/L，聚維酮碘為20.261 mg/L、15.489 mg/L、10.864 mg/L 和9.347mg/L，高錳酸鉀 為3.221 mg/L、2.109 mg/L、1.905 mg/L 和1.803mg/L，氯化鈉為8818.652 mg/L、8298.550 mg/L、7928.583 mg/L 和7348.559mg/L。安全濃度由低到高為：高錳酸鉀＞硫酸銅＞聚維酮碘＞氯化鈉。四種水產(chǎn)消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的藥物毒性蓄積程度系數(shù)（MAC）隨實(shí)驗(yàn)時間延長而產(chǎn)生的變化存在差異。聚維酮碘和高錳酸鉀的MAC 值隨實(shí)驗(yàn)時間的延長而下降，聚維酮碘下降較慢，而高錳酸鉀下降較快。硫酸銅和氯化鈉的MAC 值在96h 內(nèi)變化相反，硫酸銅先升高后降低，氯化鈉先降低后升高。

根據(jù)藥物濃度對數(shù)和死亡率-概率單位的關(guān)系計(jì)算出4 種藥物24h、48h 和96h 的回歸方程（表4）。

表3 4 種水產(chǎn)消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的急性毒性特征分析Tab.3 Analysis of acute toxicity of four aquaculture disinfectants to tadpoles of frog R.nigromaculata

表4 4 種水產(chǎn)消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的回歸方程Tab.4 Regression equations of four aquaculture disinfectants to tadpoles of frog R.nigromaculata

3 討論

3.1 4 種水產(chǎn)消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的急性毒性特征

半致死濃度（LC50）是評價(jià)藥物對水產(chǎn)動物急性毒性的重要指標(biāo)，根據(jù)國家環(huán)境保護(hù)總局發(fā)布的毒性分類標(biāo)準(zhǔn)[20]，急性毒性96hLC50＜0.1mg/L 為劇毒，0.1～1.0mg/L為高毒，1.0～10.0mg/L 為中毒，＞10.0mg/L為低毒。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：氯化鈉對黑斑蛙蝌蚪的96hLC50為7348.559mg/L 屬低毒藥物，硫酸銅、聚維酮碘和高錳酸鉀的96hLC50分別為1.689mg/L、9.347mg/L 和1.803mg/L，均屬中毒藥物。4 種水產(chǎn)消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的毒性由強(qiáng)至弱依次為：硫酸銅＞高錳酸鉀＞聚維酮碘＞氯化鈉。

在本試驗(yàn)中，硫酸銅對黑斑蛙蝌蚪的96hLC50為1.689mg/L，換算為Cu2+對黑斑蛙蝌蚪的96hLC50為0.676 mg/L，高于澤陸蛙Fejervarya multistriata（0.118 mg/L）[22]、牛蛙（0.24 mg/L）[23]、中華蟾蜍Bufo gargarizans（0.3625 mg/L）[24]，而低于昆明裂腹魚Schizothorax grahami（2.275 mg/L）[25]、厚頜魴Megalobrama pellegrini（4.45 mg/L）[26]。黑斑蛙蝌蚪對硫酸銅的耐受性在無尾兩棲類蝌蚪中較高，與魚類幼苗比較，則耐受性較差。在本試驗(yàn)中，聚維酮碘對黑斑蛙蝌蚪的96 h LC50為9.347 mg/L，低于葛氏鱸塘鱧Perccottus glehni（65.7 mg/L）[27]、暗紋東方鲀Takifugu obscurus （151.09 mg/L）[28]、大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus（388.47 mg/L）[29]。在本試驗(yàn)中，高錳酸鉀對黑斑蛙蝌蚪的96hLC50為1.803 mg/L，低于昆明裂腹魚（2.267 mg/L）[25]、厚頜魴（5.28 mg/L）[26]，高于褐鱒Salmo trutta（0.75 mg/L）[30]，而與鱖Siniperca chuatsi（1.80 mg/L）[31]接近。在本試驗(yàn)中，氯化鈉對黑斑蛙蝌蚪的96h LC50為7348.559 mg/L，即7.35 g/L，低于福壽螺Pomacea canaliculata（11.64 mg/L）[32]。

3.2 4 種水產(chǎn)消毒劑在黑斑蛙蝌蚪體內(nèi)的蓄積與降減的特征分析

在研究生物對毒物的蓄積與降減動態(tài)時，常用MAC 即藥物毒性蓄積程度系數(shù)作為生物對毒物敏感程度差異的指示參數(shù)[19]。一般認(rèn)為，MAC 為正值時，蓄積作用強(qiáng)于降減作用，MAC 為負(fù)值時，降減作用強(qiáng)于蓄積作用；MAC 值越大，即毒效蓄積幅度越大，生物抗毒能力下降，致死率就越大。

對4 種水產(chǎn)消毒劑的比較發(fā)現(xiàn)，MAC 最大和最小值均出現(xiàn)在高錳酸鉀實(shí)驗(yàn)中，表明黑斑蛙蝌蚪對高錳酸鉀敏感性較強(qiáng)，其降解毒效能力也較強(qiáng)。在48～72h 實(shí)驗(yàn)中，蝌蚪對聚維酮碘的MAC 值下降明顯，48～72h 的MAC 值是24～48h 的18.27%；在72～96h 實(shí)驗(yàn)中，蝌蚪對聚維酮碘的MAC 值下降明顯，72～96 h 的MAC 值是48～72h 的32.82%，說明其降解毒效能力較強(qiáng)，毒效蓄積速度下降，聚維酮碘實(shí)驗(yàn)尤為明顯。實(shí)驗(yàn)在各時間段，黑斑蛙蝌蚪對硫酸銅和氯化鈉的蓄積幅度較為均衡，說明其毒效蓄積較強(qiáng)，降解毒效能力較差。因此，建議在探討藥物對生物的毒性效應(yīng)時，應(yīng)分析藥物毒性蓄積變化，充分考慮時效性才能更全面評估藥物的毒性效應(yīng)。

3.3 4 種水產(chǎn)消毒劑對黑斑蛙蝌蚪的用藥安全

水產(chǎn)消毒劑主要用于苗種、養(yǎng)殖水體和生產(chǎn)用具的消毒滅菌，定期使用消毒劑類藥物是預(yù)防出血、爛鰓等細(xì)菌性疾病以及寄生蟲病的有效方法。本實(shí)驗(yàn)中，黑斑蛙蝌蚪對硫酸銅的安全濃度為0.701 mg/L，與全池潑灑的常用劑量為0.75 mg/L 相當(dāng)，理論上可以使用硫酸銅作為黑斑蛙蝌蚪疾病治療的漁藥，但考慮到重金屬銅離子可在生物體內(nèi)積累，因此在養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)慎用。聚維酮碘的安全濃度為2.715 mg/L，在全池潑灑常用劑量2～4mg/L 范圍內(nèi)，可以使用。高錳酸鉀的安全濃度為0.271 mg/L，遠(yuǎn)低于生產(chǎn)上常用的潑灑濃度（1～2mg/L），不建議使用高錳酸鉀潑灑消毒。目前，生產(chǎn)上僅用氯化鈉下塘前浸泡消毒苗種，而少見用于水體潑灑。氯化鈉在水中溶解度高，造成水體鹽度變化，不僅作用于水產(chǎn)動物的滲透壓調(diào)節(jié)，還刺激或抑制其攝食、新陳代謝及激素傳導(dǎo)等[33]。不同淡水生物對鹽度的適應(yīng)性不同，如弓斑東方鲀Fugu obscurus[34]、小鋸蓋魚Centropomus parallelus[35]和金魚Carassius auratus[36]在低鹽度時特定生長率和飼料轉(zhuǎn)化率較高，而花鰻鱺Anguilla marmorata 和太平洋雙色鰻鱺A.bicolor pacifica 在淡水中生長良好，在鹽度5、10 和18 水體中生長受抑制[37]。氯化鈉來源廣，價(jià)格便宜，研究低鹽度的潑灑消毒以及對水生動物生長的影響，具有重要的實(shí)踐意義。

基于本研究結(jié)果，建議在黑斑蛙蝌蚪消毒以及疾病防治中，使用聚維酮碘安全，硫酸銅需慎用，高錳酸鉀不宜使用，而氯化鈉可浸泡使用，潑灑使用尚需進(jìn)一步研究。黑斑蛙蝌蚪對毒物反應(yīng)敏感性高于一般魚類苗種，有良好的劑量與效應(yīng)關(guān)系，用黑斑蛙蝌蚪輔助傳統(tǒng)的理化監(jiān)測儀器監(jiān)測水質(zhì)，能在一定程度上反映出環(huán)境污染的綜合生物學(xué)效應(yīng)。利用黑斑蛙蝌蚪作為模式生物，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，對于規(guī)范我國水產(chǎn)藥物的毒性評價(jià)具有一定意義。