李云峰，孫巍，周賀，李玉龍，鮑相渤

（1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023）

海蜇Rhopilema esculentum 隸屬于腔腸動(dòng)物門，缽水母綱根口水母科海蜇屬，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的大型食用水母，主要分布于中國(guó)、日本、朝鮮沿岸及前蘇聯(lián)遠(yuǎn)東沿岸[1]。海蜇味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、抗逆性強(qiáng)，已成為我國(guó)海水養(yǎng)殖的重要種類。目前，有關(guān)海蜇的研究主要集中在基礎(chǔ)生物學(xué)[2-4]，營(yíng)養(yǎng)及加工[5-7]、分子遺傳學(xué)[8-10]、人工養(yǎng)殖技術(shù)[11-14]等，對(duì)其細(xì)胞遺傳學(xué)研究很少。

染色體是細(xì)胞核中重要的組成部分，是生物發(fā)育、進(jìn)化、遺傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ)。染色體組型具有物種特異性和相對(duì)穩(wěn)定性，能反映生物的遺傳組成、遺傳變異規(guī)律、發(fā)育機(jī)制、物種起源和進(jìn)化歷史。郭平[15]研究表明海蜇染色體數(shù)2n=42。由于海蜇染色體體積微小，呈短棒狀，屬于微小染色體，進(jìn)行染色體的核型分析比較困難，因此尚無(wú)對(duì)其核型方面的研究報(bào)道。本研究利用空氣干燥法制備海蜇的囊胚細(xì)胞染色體標(biāo)本，采用Giemsa 和DAPI 兩種染色方法，首次獲得了較清晰的細(xì)胞有絲分裂中期的分裂相，并對(duì)其進(jìn)行了數(shù)目統(tǒng)計(jì)及核型分析，旨在補(bǔ)充海蜇細(xì)胞遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方面研究的不足，并為海蜇品種選育和遺傳改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海蜇取自營(yíng)口現(xiàn)代漁業(yè)產(chǎn)業(yè)園，均為傘徑（40±0.53）cm、體質(zhì)量（5±0.47）kg 的性成熟個(gè)體。海蜇取回后暫養(yǎng)于遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院生物育種實(shí)驗(yàn)室的孵化池，暫養(yǎng)期間停止投喂餌料。當(dāng)孵化池底部出現(xiàn)大量受精卵時(shí)，將受精卵收集于燒杯中，置于顯微鏡下觀察，待海蜇胚胎發(fā)育至囊胚期收集于10mL 離心管中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染色體制備

（1）秋水仙素處理：將發(fā)育至囊胚期的胚胎細(xì)胞收集于10mL 管內(nèi)，加入終濃度為0.4g/L 的秋水仙素（無(wú)菌海水配置）于24℃處理45min，反復(fù)吸打。

（2）低滲：將細(xì)胞懸液于1000r/min 離心10min，去除上清后加入0.075mol/L 的KCl 溶液，27℃低滲45min，輕輕吹打數(shù)次。

（3）固定：去上清后，加入-20℃冰箱中預(yù)冷的現(xiàn)配置的卡諾固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定3次，每次15min，后置于-20℃中過(guò)夜處理。

（4）解離：-20℃中取出已經(jīng)固定好的細(xì)胞懸液于1000r/min 離心2min，去上清，加入預(yù)冷的50%冰醋酸1～2 滴進(jìn)行解離后，加入-20℃預(yù)冷的新配置的卡諾固定液。

（5）滴片：將細(xì)胞懸液在距冰凍載玻片上1m 左右的高度滴下，酒精燈火焰干燥。

（6）染色：將載玻片置于現(xiàn)配置的10%Giemsa（pH=6.8）染缸內(nèi)染色30min，用蒸餾水沖洗干凈，或?qū)⑤d玻片用DAPI 染色，封片，染色24h，-20℃保存。

（7）觀察，將染色體標(biāo)本在顯微鏡下觀察，在油鏡下拍照。

1.2.2 染色體核型分析

選取60 個(gè)數(shù)目清楚，形態(tài)清晰的染色體中期分裂相進(jìn)行染色體眾數(shù)統(tǒng)計(jì)。選取5 個(gè)染色體數(shù)目完整且形態(tài)良好的中期分裂相，用Photoshop 軟件進(jìn)行染色測(cè)量和配對(duì)，分析核型。依據(jù)Levan 等[16]的分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)染色體進(jìn)行分組和命名：臂比值為1.0～1.7 為中部著絲粒染色體（m），臂比值為1.7～3.0為亞中部著絲粒染色體（sm），臂比值為3.0～7.0 為亞端部著絲粒染色體（st），臂比值大于7.0 為端部著絲粒染色體（t）。

2 結(jié)果與分析

2.1 海蜇胚胎細(xì)胞染色體數(shù)目

實(shí)驗(yàn)選取60 個(gè)分散良好，形態(tài)清晰的海蜇囊胚期染色體中期分裂相計(jì)數(shù)染色體數(shù)目，由表1 可知染色體數(shù)目及所出現(xiàn)頻率，其中染色體數(shù)目2n=42 出現(xiàn)52 次，占有絲分裂細(xì)胞總數(shù)的86.7%，由此認(rèn)為海蜇染色體數(shù)目為2n=42。

表1 海蜇囊胚期染色體數(shù)目Tab.1 The number of chromosome in blastula stage of R.esculentum

2.2 染色體核型分析

表2 海蜇染色體組型數(shù)據(jù)Tab.2 Karyotypes of R.esculentum

實(shí)驗(yàn)選取海蜇胚胎細(xì)胞制備染色體標(biāo)本，經(jīng)Giemsa 和DAPI 染色后，在顯微鏡下觀察到了清晰的有絲分裂中期分裂相。海蜇囊胚期有絲分裂中期的染色體形狀為短棒狀（圖1），由染色體相對(duì)長(zhǎng)度（相對(duì)長(zhǎng)度=每條染色體長(zhǎng)度/單倍染色體長(zhǎng)度×100）和臂比值可知，海蜇染色體組成為中部著絲粒染色體（m）10 條，亞中部著絲粒染色體（sm）14 條，亞端部著絲粒染色體（st）12 條，端部著絲粒染色體（t）6 條（表2），海蜇染色體核型公式為2n=42=10m+14sm+12st+6t，NF=78。

3 討論

目前，制備腔腸動(dòng)物染色體所用組織，主要有胚胎[17]、螅狀體、碟狀體[15]、觸手[18]及整體浸泡[19]等。本研究采用海蜇發(fā)育至囊胚期的胚胎細(xì)胞做為實(shí)驗(yàn)材料，因其具有細(xì)胞大，有較高的有絲分裂指數(shù)，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好的特點(diǎn)，因此制片中了獲得大量清晰的細(xì)胞分裂中期分裂相。關(guān)于海蜇染色體核型的研究很少，早期研究者[15]只報(bào)道了海蜇染色體數(shù)目，未提供核型公式。本研究除采用Giemsa 染色方法以外，還采用DAPI 染色制備海蜇染色體圖譜。DAPI 是一種特異性強(qiáng)，靈敏度高的熒光染料，其與DNA 形成的復(fù)合物能發(fā)出穩(wěn)定的淺藍(lán)色熒光，便于顯微照相觀察[20,21]。將圖1 中a、b 及已報(bào)道的圖片相比較可以發(fā)現(xiàn)相比于Giemsa 不容易上色，DAPI染色方法使染色體輪廓更為明顯，更有利于染色體的核型分析，為海蜇等染色體形態(tài)小、著絲點(diǎn)位置不明顯的種類的染色體數(shù)目確定及染色體定位等細(xì)胞學(xué)研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)[22]。

本實(shí)驗(yàn)選取60 個(gè)分散良好、形態(tài)清晰的海蜇囊胚期染色體中期分裂相計(jì)數(shù)染色體數(shù)目，研究確定了海蜇染色體數(shù)目為2n=42，染色體呈短棒狀，這一數(shù)目與郭平[15]的研究結(jié)果相同，而少于海月水母Aurelia aurita[18]2n=44，多于水螅綱的廈門隔膜水母Leuckartiara hoepplii Hsu 2n=30[19]。有研究表明[22,23]染色體的數(shù)目可以作為物種進(jìn)化過(guò)程中親緣關(guān)系判定的依據(jù)，本研究總結(jié)出相對(duì)準(zhǔn)確的海蜇核型公式為2n=10m+14sm+12st+6t，NF=78，染色體大小差別不明顯，這與海月水母Aurelia aurita 2n=44m，NF=88 及國(guó)外學(xué)者[24,25]報(bào)道的水螅Pelmatohydra oligactis 和P.baikalensis，2n=30，NF=56，且染色體大多為中部和亞中部著絲粒染色體的結(jié)果有很大差別。有研究[26]指出在分類階元中，具有較多端部著絲粒染色體的是原始類群，而具有較多中部或亞中部著絲粒染色體的是特化類群，這一觀點(diǎn)證明了海蜇在腔腸動(dòng)物中是原始類群。

本研究獲得了海蜇染色體的準(zhǔn)確數(shù)目及核型，此結(jié)果將為染色體操作育種、雜交育種等育種方法在海蜇遺傳改良方面提供依據(jù)，并為海蜇染色體基因定位、細(xì)胞遺傳學(xué)等遺傳基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。