（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

傳染性造血器官壞死?。╥nfectious hematopoietic necrosis，IHN）是嚴(yán)重威脅野生和人工養(yǎng)殖鮭鱒的急性、全身性傳染病[1,2]。根據(jù)感染宿主、病毒株和鮭鱒魚(yú)養(yǎng)殖環(huán)境的不同，IHN 造成的死亡率超過(guò)90%[3,4]。20 世紀(jì)50年代，美國(guó)華盛頓和俄勒岡州的紅鮭Oncorhynchus nerka 養(yǎng)殖場(chǎng)首次報(bào)道了該病，并迅速沿太平洋海岸擴(kuò)散至北加州及愛(ài)達(dá)荷州[5]。隨著魚(yú)苗及成魚(yú)的貿(mào)易流通，目前IHN 已經(jīng)蔓延到全世界多個(gè)國(guó)家，如日本[6]、伊朗[7]、加拿大[8]、韓國(guó)[9]、俄羅斯[10]、荷蘭[11]等。1985年我國(guó)遼寧省的一個(gè)虹鱒魚(yú)幼仔孵化場(chǎng)首次發(fā)現(xiàn)IHN 疫情，目前已經(jīng)擴(kuò)散至多個(gè)鮭鱒主養(yǎng)區(qū)，給我國(guó)的鮭鱒養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[12]。

IHN 的病原為傳染性造血器官壞死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV）。它由不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA 組成，歸屬于彈狀病毒科Rhabdoviridae，鮭科諾拉彈狀病毒屬Salmonid Novirhabdovirus[5,13]。IHNV 全基因組大小約為11100 nts，共編碼6 個(gè)病毒蛋白，分別為5 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、表面糖蛋白（G）、聚合酶蛋白（L），以及1 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NV）[14]。病毒基因組與核蛋白N 緊密連接，形成病毒粒子的核心結(jié)構(gòu)后與磷蛋白P 和聚合酶蛋白L 一起參與病毒的復(fù)制[15]。目前，世界各地發(fā)現(xiàn)的IHNV 分別以N、G、NV 基因的部分或全部核苷酸序列，進(jìn)行詳細(xì)的系統(tǒng)進(jìn)化分析[5,16,17]。

本課題組于2012年從中國(guó)東部的某虹鱒養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到IHNV-Sn1203 病毒株，對(duì)其進(jìn)行了大量研究，包括疫苗、致病機(jī)理和免疫學(xué)研究等。為了更好地了解該病毒株的分子生物學(xué)特征，對(duì)IHNV-Sn1203 病毒株的全基因組序列進(jìn)行克隆及測(cè)序，并結(jié)合生物信息學(xué)分析該毒株的全基因組序列、基因組編碼蛋白、基因組末端和未翻譯序列、以及病毒基因同源性和系統(tǒng)發(fā)育，以期為我國(guó)IHNV病毒株的分子生物學(xué)特性及分子進(jìn)化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒株和細(xì)胞株

自中國(guó)東部某虹鱒養(yǎng)殖場(chǎng)分離的IHNV-Sn1203 病毒株（GenBank No:KC660147.1）經(jīng)分離鑒定后保存于本實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)用鯉上皮瘤細(xì)胞（epithelium papulosum cyprini，EPC）由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所魚(yú)類病害教研室曾令兵教授惠贈(zèng)。

1.2 引物設(shè)計(jì)

用DNAMAN 軟件，比對(duì)GenBank 中收錄的IHNV 基因組全序列信息。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，利用Primer Premier version 5 軟件，在IHNV-HLJ09 株（Accession number JX649101）全基因組序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)覆蓋全基因組序列的重疊引物，用于IHNV-Sn1203 病毒株全基因組序列克隆。所有引物均由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成（表1）。

表1 IHNV-Sn1203 基因組克隆所用引物Tab.1 Primers sequences used in IHNV-Sn1203 genomic sequence clone

1.3 IHNV-Sn1203 病毒株全基因組序列克隆

本研究將IHNV-Sn1203 基因組序列分成5 個(gè)片段進(jìn)行克隆。使用GenEluteTM總RNA 提取試劑盒（Sigma 公司），從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取IHNV-Sn1203 病毒株總RNA。以病毒總RNA 為模板，利用SuperScript III One-Step RT-PCR Platinum Taq HiFi Kit 試劑盒，及表1 中引物分段克隆IHNV-Sn1203 全基因組序列。為了保證IHNV-Sn1203基因組末端序列的準(zhǔn)確性，采用SMARTTMRACE 試劑盒（Takara，Dalian）克隆IHNV-Sn1203 基因組序列的5’和3’末端序列?？寺∷卯a(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用凝膠回收試劑盒（Omega）純化回收目的片段。膠回收產(chǎn)物連接至pMD18-T simple 載體后，送吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 IHNV-Sn1203 全基因組序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

IHNV-Sn1203 基因組分段克隆片段中，每個(gè)片段至少隨機(jī)選擇3 個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用SeqBuilder 軟件進(jìn)行正向序列和反向序列的裝配驗(yàn)證。利用Lasergene、MEGA 5.0 軟件，采用ClustalW 多重比對(duì)法和鄰位相連法（Neighbor-Joining method），分析IHNV-Sn 1203 株的全基因組序列、基因組編碼蛋白、基因組末端和未翻譯序列、以及病毒基因同源性和系統(tǒng)發(fā)育，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IHNV-Sn1203 株的全基因組信息

IHNV-Sn1203 株的基因組全長(zhǎng)11131 nts，共編碼6 個(gè)病毒蛋白，依次為核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、表面糖蛋白（G）、非結(jié)構(gòu)蛋白（NV）和聚合酶蛋白（L），其基因組結(jié)構(gòu)與已經(jīng)發(fā)表的彈狀病毒及IHNV 病毒基因組結(jié)構(gòu)組成相似。表2 列出了IHNV-Sn1203 株的基因組特征及預(yù)測(cè)蛋白信息，IHNV-Sn1203 的所有蛋白編碼基因均被稱為基因連接區(qū)的非翻譯序列（UTR）分隔開(kāi)（圖1）。

2.2 IHNV-Sn1203 株的6 個(gè)基因分析

IHNV-Sn1203 株編碼的六個(gè)基因及其組成如表2 所示。其中，N 基因的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1176nts，位于基因組的175～1350nts 之間，包含391 個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白大小約為42.36kDa。N 基因的兩端分別含有112nts（63～174） 的5' 非翻譯區(qū)，及80nts（1351～1430）的3' 非翻譯區(qū)（表2）。N 基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于保守轉(zhuǎn)錄起始序列（CGUG，63～66nts）的下游，轉(zhuǎn)錄終止序列位于1415～1430nts處，其中包含推測(cè)的多腺化信號(hào)（UCUUUUUUU）。

P 基因的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)693nts，位于基因組的1466～2158nts 之間，包含230 個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白大小約為25.99kDa。P 基因的兩端分別含有33nts（1433～1465）的5' 非翻譯區(qū)，及41nts（2159～2199）的3' 非翻譯區(qū)。P 基因轉(zhuǎn)錄起始序列位于1433～1436nts，轉(zhuǎn)錄終止序列位于2184～2199nts 處。

M 基因的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)588nts，位于基因組的2255～2842nts 之間，包含195 個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白大小約為21.86kDa。M基因的兩端分別含有53nts（2202～2254）的5' 非翻譯區(qū)和103nts（2843～2945）的3' 非翻譯區(qū)。M 基因轉(zhuǎn)錄起始序列位于2202～2205nts，轉(zhuǎn)錄終止序列位于2930～2945nts。

表2 IHNV-Sn1203 株的基因組特征和蛋白預(yù)測(cè)Tab.2 Genomic characteristics and protein prediction of IHNV-Sn1203

G 基因的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1527nts，位于基因組的2948～2998nts 之間，包含508 個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白大小約為56.37kDa。G 基因的兩端分別含有51nts（2948～2998）的5' 非翻譯區(qū)和42nts（4526～4567）的3' 非翻譯區(qū)。G 基因轉(zhuǎn)錄起始序列位于4552～4567nts，轉(zhuǎn)錄終止序列位于2930～2945nts 處。

NV 基因的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)336nts，位于基因組的4596～4931nts 之間，包含111 個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白大小約為13.30kDa。NV 基因的兩端分別含有26nts（4570～4595） 的5' 非翻譯區(qū)和7nts（4932～4938）的3'非翻譯區(qū)。NV 基因轉(zhuǎn)錄起始序列位于4570～4573nts，轉(zhuǎn)錄終止序列位于4923～4938nts處，與NV 基因的開(kāi)放閱讀框有9nts（4923～4931）重疊。

L 基因的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)5961nts，位于基因組的5016～10976nts 之間，包含1986 個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白大小約為224.73kDa。L 基因的兩端分別含有75nts（4941～5015） 的5' 非翻譯區(qū)和54nts（10977～11030）的3' 非翻譯區(qū)。L 基因轉(zhuǎn)錄起始序列位于 4941～4944nts，轉(zhuǎn)錄終止序列位于11015～11030nts 處。

2.3 基因組末端和未翻譯序列

為了實(shí)現(xiàn)病毒蛋白的最佳翻譯，彈狀病毒的開(kāi)放閱讀框之間都含有非常保守的非翻譯區(qū)域。這些區(qū)域通常以一個(gè)假定的轉(zhuǎn)錄停止/聚腺苷酸化基序[UCUA/GUCU7]開(kāi)始，通過(guò)U 序列的重復(fù)復(fù)制向mRNA 加入poly（A）尾巴。這一序列后緊連著一個(gè)非轉(zhuǎn)錄的基因間二核苷酸AC 或GC 和一個(gè)保守的假定轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)CGUG。圖2-A 為IHNV-Sn1203株基因間的保守UTR 結(jié)構(gòu)，各基因間均含有保守的基因終止序列（Geneend，GE）、基因間序列（Intergenicregions，IG）和基因起始序列（Genestar，GS）。IHNV-Sn1203 基因組的6 個(gè)基因間的基因連接長(zhǎng)度不同，分別為：N-P （115nts）、P-M（96nts）、M-G（156nts）、G-NV（70nts）和NV-L（84nts）。研究發(fā)現(xiàn)，NV 基因的終止密碼子重疊在其非翻譯區(qū)的GE 中，這一結(jié)果未發(fā)于其他病毒，且其具體的作用也未闡明。IHNV-Sn1203 基因組的3'leader 序列長(zhǎng)60nt，A/T 含量為68.3%，5'trailer 序列長(zhǎng)99nt，A/T 含量為56.6%。同其他彈狀病毒類似，IHNV-Sn1203 基因組RNA 的3'端，前16 個(gè)核苷酸均與5'端核苷酸互補(bǔ)（如圖2-B 所示），而已報(bào)道的病毒株220-90 和Ch20101008 中分別有15 個(gè)和13 個(gè)互補(bǔ)，這種基因組末端的互補(bǔ)性質(zhì)對(duì)彈狀病毒的復(fù)制至關(guān)重要。

已有報(bào)道表明，Kozak 序列對(duì)保證真核生物基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率至關(guān)重要，特別是起始密碼前-3 位的A 堿基[18]。本文分析了IHNV-Sn1203 基因組中的Kozak 序列（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IHNV-Sn1203株6 個(gè)病毒基因的起始密碼子前面均含有嚴(yán)格的Kozak 序列，其-3 位堿基均為A。這一結(jié)果與已報(bào)道的IHNV 220-90 株的N 基因不同（-3 位堿基為G）。

2.4 同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4.1 全基因組進(jìn)化分析

本研究首先分析了IHNV 同其他彈狀病毒全基因組的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果顯示IHNV 與HIRRV（Hirame rhabdovirus,HIRRV）進(jìn)化關(guān)系最近，其次為SHRV（Snakehead rhabdovirus,SHRV）、VHSV（Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV）和SVCV（Spring viraemia of carp virus,SVCV）。IHNV-Sn1203 株同Ch20101008、BJSY 和HLJ-09 聚為一簇（圖4），其核苷酸同源性分別為99.67%、99.52%和99.76%；同BjLL、220-90、WRAC、lambda ZAPII 聚為一簇，同Sn1203 株的核苷酸同源性分別為96.34%、94.89%、95.41%和95.88%。（表3）

表3 IHNV-Sn1203 基因組序列同源性分析（%）Tab.3 Homology analysis of IHNV-Sn1203 genome sequence（%）

2.4.2 Sn1203 株病毒糖蛋白（Glycoprotein,G）基因進(jìn)化分析

IHNV 病毒糖蛋白G 基因序列的變異系數(shù)小，又與病毒的毒力強(qiáng)弱直接相關(guān)，目前IHNV 的基因分型及進(jìn)化分析多以G 蛋白序列為主。本研究對(duì)包括IHNV-Sn1203 株在內(nèi)的100 株IHNV 的G 基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明：IHNV 主要分為5個(gè)基因型，即E、U、M、L 和J，其中J 基因型又包含J Nagano 和J Shizuoka 兩個(gè)基因亞型。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，Sn1203 株同我國(guó)已報(bào)道的SD-12、YN-13、CJ-13、Ch20101008 和HLJ-09 等聚為一簇，共同歸屬于J Nagano 基因亞型，并且Sn1203 株與CJ-13 株的親緣關(guān)系較近（圖5）。

2.4.3 Sn1203 株各病毒基因進(jìn)化分析

本研究同時(shí)利用GenBank 中IHNV 病毒株N基因、P 基因的全序列及L 基因、M基因和NV 基因的部分序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖6 所示。N 基因全序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Sn1203 株同LQN131107、CJ-13、zyx、HLJ-09 和Ch20101008 聚為一簇（圖6-A），核苷酸同源性分別為99.32%、99.49%、99.66%、99.83%和99.83%；而中國(guó)分離株BjLL 則與美國(guó)株RB-76 及Round Butte 1 等聚為一簇，與Sn1203 株的核苷酸同源性為95.75%。P 基因全序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Sn1203 株同CJ-43、HLJ-09、Ch20101008 和BJSY 聚為一簇（圖6-B），與HLJ-09 親緣關(guān)系最近，其核苷酸同源性為99.86%，與BjLL 中國(guó)分離株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，核苷酸同源性為94.37%。L 基因部分序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Sn1203 株同HLJ-09、Ch20101008 和BJSY 聚為一簇（圖6-C），與HLJ-09 親緣關(guān)系最近，其核苷酸同源性為99.80%，與BjLL 中國(guó)分離株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，核苷酸同源性為97.30%。M基因及NV 基因部分序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Sn1203 株同CJ-13、HLJ-09、Ch20101008 和BJSY 聚為一簇（圖6-D、圖6-E），與HLJ-09 及Ch20101008 親緣關(guān)系最近，M 基因核苷酸同源性均為99.49%，NV 基因核苷酸同源性分別為99.70%和99.40%，與BjLL 中國(guó)分離株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。以上結(jié)果表明：Sn1203 株與HLJ-09 株及Ch20101008 的親緣關(guān)系最近，而與中國(guó)分離株BjLL 親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討論

1985年我國(guó)東北部某虹鱒魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)首次暴發(fā)了IHN 疫情，次年IHN 暴發(fā)15d 就導(dǎo)致該養(yǎng)殖場(chǎng)60 萬(wàn)尾虹鱒死亡，從此IHN 成為嚴(yán)重威脅我國(guó)鮭鱒養(yǎng)殖的主要疫病[12,19]。2012年本課題組分離得到IHNV-Sn1203 病毒株，以該病毒株為對(duì)象開(kāi)展了大量的研究工作，包括疫苗、致病機(jī)理及免疫學(xué)研究等[1,13,20,21]，但未詳細(xì)分析IHNV-Sn1203 病毒株的基因組成、分子生物學(xué)特征等。為更清楚地了解該病毒株的分子生物學(xué)特性，本研究克隆了IHNV-Sn1203 病毒株的全基因組序列，分析了其全基因組序列、基因組編碼蛋白、基因組末端和未翻譯序列、以及病毒基因同源性和系統(tǒng)發(fā)育。

IHNV-Sn1203 病毒株全基因組長(zhǎng)度為11131 nts，與其他諾拉彈狀病毒屬病毒的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在其基因組的3' 末端和5' 末端均含有與其他諾拉彈狀病毒屬病毒相同的保守序列：3' 末端為CAUAU，5'末端為GUAUA。在其基因組的3'末端的前16 個(gè)核苷酸均與5' 末端核苷酸互補(bǔ)，與已報(bào)道的220-90病毒株及Ch20101008 病毒株不同（220-90 有15 個(gè)互補(bǔ)，Ch20101008 有13 個(gè)互補(bǔ)）。所有諾拉彈狀病毒屬病毒基因組3' 末端的核苷酸長(zhǎng)度基本保持一致（51～60nts），但5' 末端核苷酸長(zhǎng)度卻呈高度可變性（42～116nts）。已有的研究認(rèn)為，病毒基因組3'末端和5' 末端核苷酸序列的互補(bǔ)性，及5' 末端均具有一定的功能意義，可能與病毒的復(fù)制密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚[22]。對(duì)IHNV-Sn1203 病毒株各蛋白編碼基因前后序列的分析發(fā)現(xiàn)，所有蛋白編碼基因前均含有一段長(zhǎng)度為4 個(gè)核苷酸的保守基因啟動(dòng)序列（CGUG，GS），蛋白編碼基因后均含有一段長(zhǎng)度為16 個(gè)核苷酸的保守基因終止序列（G/UGG/UUCUA/GUCU7，GE），所有的基因均以7個(gè)尿嘧啶（U）殘基引入聚腺苷酸化信號(hào)的方式終止。在7 個(gè)尿嘧啶殘基后，有2 個(gè)不參加轉(zhuǎn)錄的核苷酸（A/GC，IG），作為兩個(gè)基因間的間隔序列。聚合酶跳過(guò)這兩個(gè)核苷酸序列，進(jìn)入下一個(gè)基因啟動(dòng)序列，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄下一個(gè)基因。本研究發(fā)現(xiàn)，IHNV 病毒株的6 個(gè)基因中，N、P、M、G 和L 基因前后均含有完整的基因啟動(dòng)序列和基因終止序列，而NV 基因后的基因終止序列與其編碼序列有9nts（4923～4931）重疊（表2），目前關(guān)于這種序列重疊現(xiàn)象的功能仍未有相關(guān)報(bào)道。

對(duì)IHNV-Sn1203 病毒株全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，除BjLL 外，中國(guó)毒株Ch20101008、BJSY、HLJ-09 和Sn1203 均聚為一簇。IHNV-Sn1203 病毒株N 基因、P 基因的全序列及L 基因、M基因和NV基因的部分序列系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，Sn1203 株與中國(guó)株HLJ-09 親緣關(guān)系最近，各核苷酸的同源性依次為99.83%、99.86%、99.80%、99.49%和99.70%。

G 基因作為病毒表面主要抗原蛋白基因，與病毒的毒力強(qiáng)弱直接相關(guān)[23]。目前IHNV 的基因分型及進(jìn)化分析多以G 基因序列為主，本研究分析了G基因的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的IHNV 病毒株主要分為5 個(gè)基因型，即E、U、M、L、J，其中J 基因型又包含J Nagano 和J Shizuoka 兩個(gè)基因亞型。其中廣泛研究的毒株220-90 和WRAC 屬于M基因型，Baker Lake 94 屬于U 基因型，strain K 屬于E 基因型，LR-73、Col-85 屬于L 基因型。Sn1203 株同我國(guó)已報(bào)道的 SD-12、YN-13、CJ-13、Ch20101008 和HLJ-09 等聚為一簇，共同歸屬于J Nagano 基因亞型；Sn1203 株與CJ-13 株的親緣關(guān)系較近。由G 基因的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，J 基因型的病毒與U 基因型親緣關(guān)系最近，猜測(cè)IHNV 病毒最初可能是通過(guò)進(jìn)口魚(yú)卵的方式由U 基因型引入，隨時(shí)間的推移逐漸進(jìn)化為J 基因型。因此，對(duì)進(jìn)口魚(yú)卵的監(jiān)控是做好外源病毒防控的關(guān)鍵手段。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：Sn1203 株同我國(guó)已報(bào)道的SD-12、YN-13、CJ-13、Ch20101008 和HLJ-09 病毒株等聚為一簇，共同歸屬于J 基因型中的Nagano 基因亞型。本研究可為我國(guó)IHNV 病毒株的分子生物學(xué)特性研究及分子進(jìn)化研究提供重要參考。