劉文文 楊巍

[摘要]目的：觀察脈沖電磁場(chǎng)刺激對(duì)新型低彈多孔鈦合金支架表面的成骨效應(yīng)。方法：使用3D打印技術(shù)制備多孔鈦合金（Ti-24Nb-4Zr-8Sn，Ti2448）支架，并使用掃描電鏡對(duì)支架的表面形貌進(jìn)行觀察;將成骨細(xì)胞接種于支架表面，給予脈沖電磁場(chǎng)刺激的支架為實(shí)驗(yàn)（PMEF）組，不給予脈沖電磁場(chǎng)刺激的支架為對(duì)照組;使用CCK-8（Cell Counting Kit-8）試劑盒檢測(cè)兩組細(xì)胞的增殖能力;使用活/死細(xì)胞染色觀察兩組細(xì)胞在支架上的活性;使用掃描電鏡觀察兩組細(xì)胞在支架上的形態(tài);通過實(shí)時(shí)定量PCR觀察兩組細(xì)胞相關(guān)成骨基因分化;通過兔股骨外側(cè)髁缺損模型進(jìn)行體內(nèi)骨長(zhǎng)入分析，分別使用熒光標(biāo)記和Van Gieson染色觀察兩組支架的骨長(zhǎng)入情況。結(jié)果：使用3D打印技術(shù)成功制備實(shí)驗(yàn)所需的多孔鈦合金支架;PMEF組成骨細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞活性明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;PMEF組成骨細(xì)胞可見明顯細(xì)胞偽足，細(xì)胞狀態(tài)良好;PMEF組成骨細(xì)胞的成骨相關(guān)基因表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P<0.05）;術(shù)后4周和12周，PMEF組新生骨沉積速率（兩種熒光間距）均高于對(duì)照組（P<0.05），Van Gieson染色發(fā)現(xiàn)PMEF組骨長(zhǎng)入明顯多于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：脈沖電磁場(chǎng)刺激和多孔Ti2448植入物的組合可為骨科、口腔和整形等領(lǐng)域的骨修復(fù)重建提供一種新方法和新思路。

[關(guān)鍵詞]鈦合金;脈沖電磁場(chǎng);多孔材料;骨整合;成骨

Abstract： Objective? Observe the osteogenic effect of PEMF stimulation on the surface of the new low-elasticity porous titanium alloy scaffold. Methods? The new low-elasticity porous titanium alloy （Ti-24Nb-4Zr-8Sn， Ti2448） scaffolds were prepared by 3D printing technology. The surface morphology of the scaffolds were characterized by scanning electron microscopy （SEM）. The osteoblast-like cell line MC3T3-E1 was cultured in the absence （control） or presence of PEMF stimulation on porous Ti2448 disc surface， and the adhesion and proliferation of the cells were investigated by SEM， live/dead cell imaging kit and CCK-8 assay. Furthermore， the expression of osteogenesis-related genes was also examined by quantitative real-time PCR. The porous Ti2448 scaffolds for animal experiment were implanted into the lateral femoral epicondyle of female New Zealand white rabbits. All of the 24 rabbits were then randomly divided equally into two groups， one group with PEMF stimulation for 2 h everyday and the other with no stimulation as control. After 4 weeks and 12 weeks， fluorescent markers and Van Gieson staining were used to observe the bone ingrowth of the two groups of scaffolds. Results? The porous titanium alloy scaffolds required for the experiment were successfully prepared. The proliferation ability and cell activity of MC3T3-E1 in PMEF group were significantly higher than those in control group （P<0.05）. The cells in the PMEF group showed obvious cell pseudopodia， the osteoblast-related genes expression of cells in PMEF group were significantly higher than that in control group （P<0.05）. At 4 and 12 weeks after surgery， the rate of new bone deposition （two types of fluorescence spacing） in the PMEF group was higher than that in the control group （P<0.05）. Van Gieson staining showed that the bone growth in the PMEF group was significantly more than that in the control group （P<0.05）. Conclusion? The combination of PMEF and porous Ti2448 implant can provide a new idea for bone repair and reconstruction in the fields of orthopedics， oral cavity and plastic surgery.

Key words： titanium alloy; pulsed electromagnetic field; porous material; osseointegration; osteogenesis

多孔鈦合金與實(shí)體鈦合金相比能夠明顯改善植入物的骨整合，是近年金屬植入物研究熱點(diǎn)[1-3]。但是多孔鈦合金（Ti6Al4V）孔隙結(jié)構(gòu)內(nèi)部骨長(zhǎng)入不是十分理想，特別是體積較大多孔材料的中心骨長(zhǎng)入較少[4-5]。而多孔Ti6Al4V材料骨長(zhǎng)入不佳的可能原因?yàn)椋孩俣嗫捉Y(jié)構(gòu)的采用僅能降低鈦合金部件表觀彈性模量，而材料本身力學(xué)性能沒有實(shí)質(zhì)變化，與骨組織微觀力學(xué)性能不匹配的問題依然存在[6];②正常骨組織具有壓電效應(yīng)，其力與電轉(zhuǎn)換特性可將外界應(yīng)力刺激轉(zhuǎn)換為內(nèi)部電磁信號(hào)，電信號(hào)對(duì)于骨修復(fù)與改建至關(guān)重要，而植入部位由于正常骨組織的缺失，無法產(chǎn)生骨修復(fù)所需的相應(yīng)電磁信號(hào)[7-8]。為解決上述問題，本研究采用3D打印技術(shù)，以新型低彈性模量Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn（Ti2448）合金粉末制備新型低彈性模量多孔鈦合金[9];同時(shí)，引入外源性脈沖電磁場(chǎng)（Pulsed electromagnetic fields，PEMF）進(jìn)行干預(yù)，模擬正常骨組織產(chǎn)生的內(nèi)源性電磁信號(hào)。本研究通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物骨缺損模型對(duì)PEMF促進(jìn)多孔Ti2448合金材料內(nèi)部的成骨效應(yīng)進(jìn)行觀察，旨在為骨科、口腔和整形等領(lǐng)域的骨修復(fù)重建提供一種新方法和新思路。

1? 材料和方法

1.1 多孔Ti2448植入物的制備及表征：使用3D打印的電子束熔融技術(shù)（Electron beam melting，EBM）制備實(shí)驗(yàn)所需的多孔Ti2448支架，其中體外實(shí)驗(yàn)為直徑10mm，高3mm的多孔圓盤，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為直徑6mm，高10mm的多孔圓柱體。本研究所用支架由沈陽金屬研究所制備。使用掃描電鏡（FE-SEM;S-4800，Hitachi，Japan）觀察支架表面形貌及其表面元素。使用Qualitative micro-computed tomography （Micro-CT）（Y. Cheetah，YXLON，Germany）對(duì)材料的孔隙結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)。所有支架使用之前在121℃（103.4kPa）環(huán)境下進(jìn)行高溫高壓滅菌。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）在加有10%胎牛血清（Gibco）和抗生素（青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml，Sigma）的α-MEM（Hyclone）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為含5% CO2的37℃溫箱。

1.3 脈沖電磁場(chǎng)（PEMF）刺激系統(tǒng)：PEMF刺激系統(tǒng)由一個(gè)PEMF發(fā)生器和兩個(gè)螺線管組成，他們以5cm的間隔放置在一條線上。將一個(gè)包含帶有MC3T3-E1細(xì)胞的Ti2448圓盤的24孔培養(yǎng)板放置在兩個(gè)螺線管之間。將螺線管連接到PEMF發(fā)生器（中國(guó)西安，F(xiàn)MMU，GHY-Ⅲ;中國(guó)專利號(hào)ZL02224739.4），以產(chǎn)生特定的開路輸出波形PEMF，已證明對(duì)成骨有積極作用[10]。使用高斯計(jì)（455 DSP高斯計(jì)，美國(guó)Lake Shore Cryotronics型號(hào)）將螺線管兩端的峰-峰磁場(chǎng)確定為20高斯。在對(duì)照組中，將培養(yǎng)板也放置在相同的螺線管之間，但沒有輸出波形。將PEMF組和對(duì)照組每天放置在螺線管之間2h。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：將1ml等分試樣的MC3T3-E1細(xì)胞懸液（1×105個(gè)細(xì)胞）接種到24孔培養(yǎng)板中的每個(gè)多孔Ti2448圓盤上。12h后，將圓盤用PBS洗滌3次，然后轉(zhuǎn)移至每個(gè)孔中含1ml培養(yǎng)基的新培養(yǎng)板中。PEMF刺激1、4或7d后，按照Cell Counting Kit-8（CCK-8，Dojindo）的說明評(píng)估細(xì)胞增殖水平。使用分光光度計(jì)（Labsystems Dragon Wellscan Mk3）測(cè)量450nm處的吸光度。

1.5 活/死細(xì)胞染色檢測(cè)細(xì)胞活性：激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscopy，CLSM;Olympus Fluo View FV-1000）用于檢查接種在多孔Ti2448光盤表面上的MC3T3-E1細(xì)胞的活力。在PEMF刺激48h后，按照說明（綠色熒光為活細(xì)胞;紅色熒光為死細(xì)胞;Life Technologies），用活/死細(xì)胞成像試劑盒對(duì)細(xì)胞染色，并使用CLSM成像。

1.6 掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：將1ml細(xì)胞懸液的等分試樣以1×105細(xì)胞/ml的密度接種到多孔Ti2448圓盤上。48h后，將圓盤用PBS輕輕清洗3次，然后在4℃的1ml 2.5%戊二醛溶液中固定過夜。將圓盤用PBS沖洗3次，并在一系列乙醇洗滌中脫水。將所有樣品進(jìn)行干燥，涂鉑，并通過掃描電鏡（Hitachi S-4800）進(jìn)行觀察。

1.7 成骨相關(guān)基因表達(dá)：使用實(shí)時(shí)PCR評(píng)估成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平。將細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種。培養(yǎng)4或7d后，使用Trizol試劑（TaKaRa）分離總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒（TaKaRa）將每個(gè)樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)系統(tǒng)）和SYBR Premix Ex TaqⅡ定量檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP（alkaline phosphatase），Col-1（type 1 collagen），OCN（osteocalcin），OPN（osteopontin），Runx2（runt-related transcription factor 2）和BMP-2（bone morphogenetic protein-2）的表達(dá)水平。表1列出了靶基因的引物。將β-actin基因表達(dá)作為參照。

1.8 兔股骨外側(cè)髁缺損模型的建立：將24只新西蘭白兔（3±0.5）kg隨機(jī)分為兩組，麻醉并暴露股骨外側(cè)髁。制作直徑6mm，高10mm的圓柱形缺陷，并隨機(jī)植入Ti2448支架。每天將PEMF組暴露于PEMF刺激下2h，將對(duì)照組也置于未通電的線圈中而不暴露于PEMF。

1.9 順序熒光染料標(biāo)記：在處死動(dòng)物前14d，肌肉注射四環(huán)素（50mg/kg），連續(xù)2d，1次/d;取材前2d，肌注鈣黃綠素（8mg/kg）。

1.10 定量組織學(xué)分析：在第4周和12周通過耳靜脈空氣栓塞處死實(shí)驗(yàn)兔，并分離雙側(cè)股骨。在制備組織切片前，將樣品固定2周（75%乙醇）。準(zhǔn)備組織切片，并使用共聚焦激光掃描顯微鏡獲得熒光色素標(biāo)記圖像，Image-Pro Plus 6.0軟件用于定量分析新骨組織。同時(shí)，進(jìn)行Van Gieson染色。檢查所有染色的切片，并獲得圖像。使用image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算新形成的骨骼的體積分?jǐn)?shù)（骨骼體積/支架的總體積，BV/TV）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析，再進(jìn)行兩次樣本t檢驗(yàn)，確定顯著性水平。結(jié)果以（x?±s）表示。P<0.05被認(rèn)為有顯著差異，P<0.01被認(rèn)為有高度顯著差異。

2? 結(jié)果

2.1 材料表面掃描電鏡結(jié)果：通過掃描電鏡檢查多孔Ti2448圓盤的表面形態(tài)。由于金屬粉末顆粒部分熔化到多孔Ti2448圓盤的支桿上，因此在支架上觀察到一個(gè)粗糙的表面（見圖1A～B）。對(duì)三個(gè)隨機(jī)選擇區(qū)域的表面進(jìn)行能譜分析發(fā)現(xiàn)，Ti2448支架由Ti，Nb，Zr和Sn組成（見圖1E和表2）。從體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用的支架大體觀可以發(fā)現(xiàn)，Ti2448支架呈金黃色，具有明顯開放孔徑結(jié)構(gòu)（見圖1C～D）。支架的孔徑大小為（710±42）μm，孔隙率為（68±5.3）%。

2.2 兩組細(xì)胞增殖能力比較：如圖2所示，在培養(yǎng)1d后，在PEMF組和對(duì)照組間細(xì)胞粘附和增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。然而，在第4天和第7天，PEMF組的細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組，PEMF組的吸光度分別較對(duì)照組高144%和126%（P<0.01）。

2.3 兩組細(xì)胞活性比較：在對(duì)照組和PEMF組中，大多數(shù)具有綠色熒光（活細(xì)胞）的細(xì)胞都具有成骨細(xì)胞樣的形狀，并且延伸良好。在綠色細(xì)胞中檢測(cè)到紅色熒光的偶發(fā)斑點(diǎn)，代表死亡細(xì)胞。與對(duì)照組相比（見圖3A～B），PEMF組觀察到綠色熒光的細(xì)胞更多，紅色熒光的細(xì)胞更少，且PEMF組中形成了更多的細(xì)胞簇（見圖3C～D）。

2.4 兩組細(xì)胞形態(tài)比較：使用掃描電鏡觀察支架表面細(xì)胞形態(tài)。在低倍視野下，對(duì)照組（見圖4A）支架表面細(xì)胞數(shù)量明顯少于PEMF組（見圖4C），且PEMF組支架表面細(xì)胞形成了明顯的細(xì)胞簇。在高倍視野下，對(duì)照組（見圖4B）細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)明顯較PEMF組（見圖4D）差，且PEMF組細(xì)胞偽足更明顯，更具有成骨樣細(xì)胞的典型形態(tài)。

2.5 成骨相關(guān)基因表達(dá)：圖5顯示了成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括ALP，Col-1，OCN，OPN，Runx2和BMP-2。PEMF刺激通常會(huì)上調(diào)所有目標(biāo)基因的mRNA水平。在第4天，對(duì)照組和PEMF組ALP和BMP-2的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但PEMF組的Col-1，OCN，OPN和Runx2 的mRNA的表達(dá)較對(duì)照組分別上調(diào)了1.3倍，3.3倍，1.7倍和1.4倍。在第7天，PEMF刺激后，ALP，Col-1，OCN，Runx2和BMP-2分別上調(diào)了4.2倍，1.9倍，2.0倍，1.3倍和4.0倍， 而對(duì)照組和PEMF組之間的OPN表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.6 順序熒光染料標(biāo)記分析：熒光標(biāo)記結(jié)果示如圖6（100×）所示。在顯微鏡下，材料周圍的新骨頭在同一時(shí)間點(diǎn)以線性排列沉積。術(shù)后4周，PEMF組（見圖6B）中多孔Ti2448周圍四環(huán)素標(biāo)記的（黃色熒光）新骨與鈣黃綠素標(biāo)記的（綠色熒光）新骨之間的間隔（45.37±6.29）μm大于對(duì)照組的（24.12±3.08）μm的間隔（見圖6A），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;術(shù)后第12周，PEMF組（見圖6D）材料周圍熒光雙標(biāo)記新骨沉積的距離為（66.18±5.97）μm，也高于對(duì)照組[（41.45±4.25）μm，P<0.05，見圖6C]，見圖6E。

2.7 兩組支架的Van Gieson染色分析結(jié)果：Van Gieson 染色結(jié)果如圖7（10×）所示，可以發(fā)現(xiàn)新形成的骨（紅色）直接從骨骼缺損的邊界向支架內(nèi)部發(fā)散。術(shù)后4周，對(duì)照組（見圖7A）和PEMF組（見圖7B）中的多孔Ti2448材料被新的骨骼組織包圍，新骨與材料之間存在明顯的間隙。在對(duì)照組中，只有少量不規(guī)則的新骨在多孔材料邊緣形成，而PEMF組在材料邊緣的中有更多的新骨，兩組材料孔隙內(nèi)部均為出現(xiàn)明顯的新生骨。術(shù)后12周，兩組多孔材料的新骨形成明顯更多。與對(duì)照組（見圖7C）相比，PEMF組（見圖7D）有更多的骨進(jìn)入材料內(nèi)部。對(duì)照組中材料與新骨之間仍然存在很小的間隙。在PEMF組中，新骨和材料緊密結(jié)合，并且骨整合良好。進(jìn)一步對(duì)骨體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在4周和12周PEMF組的骨體積分?jǐn)?shù)均明顯大于對(duì)照組（P<0.05，見圖7E）。

3? 討論

多孔鈦合金因其在較好保留鈦合金機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí)具有更低的彈性模量和多孔特性，從而成為骨修復(fù)重建領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)材料[1]。隨著金屬3D打印技術(shù)的出現(xiàn)，不僅可以實(shí)現(xiàn)多孔鈦合金材料的精確空間構(gòu)型設(shè)計(jì)與制造，同時(shí)可以制備出仿真的個(gè)性化金屬骨骼，達(dá)到骨缺損精準(zhǔn)修復(fù)重建的目的，由此具有極為良好的應(yīng)用前景。近年來，國(guó)內(nèi)外先后研發(fā)出可應(yīng)用于不用部位的多孔鈦合金植入修復(fù)體并成功應(yīng)用于臨床。例如，國(guó)內(nèi)張慶福等[3]采用EBM技術(shù)制備個(gè)體化3D打印多孔鈦合金下頜骨修復(fù)體實(shí)現(xiàn)了下頜骨缺損的精確重建，獲得了滿意的外形和功能恢復(fù)效果。有學(xué)者[11]將EBM技術(shù)制備的3D打印多孔鈦合金人工椎體應(yīng)用于脊柱腫瘤切除后骨缺損修復(fù)，術(shù)后脊柱外形與功能得到良好重建。盡管多孔鈦合金植入物取得了較好的早期臨床效果，但是對(duì)于多孔鈦合金內(nèi)部骨形成不良和應(yīng)力遮擋導(dǎo)致骨吸收的問題仍然是目前多孔鈦合金臨床應(yīng)用亟待解決的問題。

多孔結(jié)構(gòu)只是降低了鈦合金材料的整體表觀彈性模量，鈦合金材料本身較高彈性模量并未得到實(shí)質(zhì)改善，導(dǎo)致多孔鈦合金內(nèi)部孔隙之間依然存在應(yīng)力遮擋效應(yīng)，孔隙的應(yīng)力依然由彈性模量高的金屬小梁承受，引發(fā)的應(yīng)力遮擋效應(yīng)可以導(dǎo)致多孔材料內(nèi)部骨吸收，影響材料內(nèi)部骨整合，發(fā)生植入體松動(dòng)[12]。因此，研發(fā)新型低彈鈦合金，獲得與人體組織更佳的力學(xué)匹配，一直是鈦合金材料研發(fā)的熱點(diǎn)。本研究采用的一種新型Ti2448合金，彈性模量?jī)H42GPa，遠(yuǎn)低于目前臨床常用Ti6Al4V合金的彈性模量（110GPa），經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)該新型低彈鈦合金材料與傳統(tǒng)Ti6Al4V合金相比能夠顯著減輕應(yīng)力遮擋效應(yīng)導(dǎo)致的骨吸收[13]。本研究以Ti2448合金為原材料，采用EBM技術(shù)進(jìn)行3D打印制備，從而使多孔鈦合金材料力學(xué)性能更好的匹配天然骨組織。當(dāng)前對(duì)于支架的物理參數(shù)，如孔隙率、孔徑大小以及孔徑結(jié)構(gòu)仍然沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這還需要在下一步的科研中進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)當(dāng)前研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著孔隙率及孔徑尺寸的增加，可長(zhǎng)入材料內(nèi)部的骨與血管的量會(huì)增加，但這會(huì)降低材料的力學(xué)強(qiáng)度，且過于開放的孔徑結(jié)構(gòu)不利于骨組織在材料支架上結(jié)合;同時(shí)如果孔隙率及孔徑尺寸過小，雖然對(duì)維持材料的力學(xué)強(qiáng)度有明顯優(yōu)勢(shì)，但是過小的孔徑會(huì)使得細(xì)胞或骨組織在材料內(nèi)部的遷移變得困難。綜合當(dāng)前的研究結(jié)果認(rèn)為孔徑400～1 200μm可以確保孔隙內(nèi)部細(xì)胞保持足夠活力[14-15]。本研究制備的支架材料孔徑為（710±42）μm，對(duì)于促進(jìn)骨組織向材料內(nèi)部長(zhǎng)入具有較好的優(yōu)勢(shì)。

天然骨組織可以通過機(jī)械應(yīng)力改變產(chǎn)生電磁場(chǎng)，而此種微電磁環(huán)境對(duì)于骨修復(fù)和重塑的調(diào)控至關(guān)重要[16]。然而，由于各種原因造成的骨缺損會(huì)導(dǎo)致上述微電磁環(huán)境的缺失，這會(huì)使得植入物材料的成骨作用和骨整合不令人滿意。因此有學(xué)者提出，在使用骨植入物時(shí)，應(yīng)充分考慮模仿骨骼的微電磁特征[17]。根據(jù)之前的發(fā)現(xiàn)，PEMF刺激是實(shí)現(xiàn)此目的的一種有價(jià)值的方法[18]。自從Bassett于1974年發(fā)表報(bào)告稱PEMF對(duì)骨不連骨折的有益作用以來[19]，PEMF在骨科的可能的用法和潛在機(jī)制中引起了極大的關(guān)注。許多研究表明，PEMF促進(jìn)骨組織修復(fù)的作用主要是通過增加成骨細(xì)胞的活性，抑制骨重塑的吸收相，刺激鈣化和增加血液供應(yīng)來完成的。還有研究表明，PEMF對(duì)成骨細(xì)胞的粘附，增殖，分化和轉(zhuǎn)錄具有明顯的促進(jìn)作用。但是，PEMF對(duì)多孔鈦合金支架骨形成的作用的研究未見報(bào)道。

Ti2448作為一種新開發(fā)的植入材料，應(yīng)首先考慮其生物相容性。在本研究中，使用活/死細(xì)胞成像試劑盒直接確定了Ti2448支架上的細(xì)胞的活力。對(duì)照組和PEMF組中的大多數(shù)細(xì)胞均存活。SEM圖像進(jìn)一步表明，Ti2448支架表面上的細(xì)胞看起來很健康，并具有良好的細(xì)胞延伸性。以上所有結(jié)果表明，Ti2448合金具有高生物相容性和極低的細(xì)胞毒性。為進(jìn)一步提高Ti2448植入物表面的成骨能力，使用PEMF對(duì)Ti2448支架表面細(xì)胞進(jìn)行刺激。研究發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因在PEMF刺激下普遍的到了上調(diào)，同時(shí)PEMF也增加了Ti2448支架表面成骨細(xì)胞的增殖能力。隨后又通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)這兩種組合的骨再生效果。熒光標(biāo)記和Van Gieson染色結(jié)果均證實(shí)，PEMF刺激可起到更好的骨整合和成骨作用。

綜上，本研究結(jié)果為多孔Ti2448合金植入材料的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，并有望為骨科、口腔和整形等領(lǐng)域骨缺損的修復(fù)重建提供一種新方法。最后，盡管本研究在體外和體內(nèi)均證實(shí)了PEMF對(duì)多孔鈦合金支架具有良好的促骨形成作用，但研究中仍尚有不足之處，例如PEMF刺激的參數(shù)優(yōu)化以及PEMF促進(jìn)多孔鈦合金支架內(nèi)部骨形成的機(jī)制等方面尚需下一步深入研究加以揭示。

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