姜 珊，馬青琳，張康華，張 芳，代 龍，高 鵬

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南 250300）

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）主要含有木犀草苷、忍冬苷等黃酮類成分，綠原酸、異綠原酸等酚酸類成分和以馬錢苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類成分（劉嬋娟等，2010）。研究表明金銀花具有抗病原微生物、抗氧化、解熱消炎、抗病毒、降血糖（劉敬盛等，2016；潘秋文等，2004）等藥理作用。近年來金銀花作為藥源需求量日益增加（董熙嘏等，1984）。它的副產(chǎn)品金銀花葉為忍冬的干燥葉，本品產(chǎn)量很高，但其被認(rèn)為是非藥用部分，并且長期未被利用（武雪芬等，2001）。不同歷史時期忍冬藥用部位各異，在梁代時期藥用部位為莖和葉（朱姮等，2016） 。武雪芬（1997）研究表明，金銀花越冬老葉中黃酮含量分別為金銀花的2.78 倍、 藤的6.98 倍。山東和河南等地區(qū)金銀花葉片的綠原酸含量和金銀花相當(dāng)。華金6 號金銀花是山東中醫(yī)藥大學(xué)經(jīng)過10 余年培育出的金銀花新品種。該品種金銀花葉資源豐富，成本較低，可作為飼料添加劑，具有很高的開發(fā)價值。

研究表明，干燥方法會影響藥材的品質(zhì)。金銀花葉不同干燥方式對綠原酸、馬錢苷、木犀草苷、總酚酸、 總黃酮和總環(huán)烯醚萜苷成分含量的影響鮮見報道。本試驗考察陰干法，真空干燥法、烘干40、50、60、70、80、100 ℃條件下，金銀花葉主要成分的含量變化，以期為金銀花葉的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 高效液相色譜儀（島津LC-2030，自動進樣，UVD 檢測器），COSMOSIL 5C18-MS-II色譜柱 （4.6×250 mm，5 μm），Welch Ultimate XBPhenyl （4.6×250 mm，5 μm），紫外-可見光光度儀（上海儀電分析儀器廠，L3S），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司 ，KQ-250），高速粉碎機（上海兆申科技有限公司，XS-02），電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，AL-204），移液槍（Dragon-Lab），真空干燥箱 （上海精宏試驗設(shè)備廠，DZF-6051），電熱鼓風(fēng)干燥箱（林茂科技，101 型）。

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 （中檢院，批號 110753-201716），馬 錢苷 對 照品 （中 檢 院 ，111640-201606），木犀草苷對照品（中檢院，批號111720-201609），甲醇（色譜純），乙醇（分析純），乙腈（色譜純），冰乙酸（色譜純），磷酸（色譜純），娃哈哈純凈水。

1.2 金銀花葉采集 2018 年6 月于山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園采集金銀花枝條中部葉片，樣品經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)鑒定為華金六號金銀花葉。取適量金銀花葉經(jīng)干燥粉碎后，于索氏提取器中回流至石油醚無色，金銀花葉粉末揮干石油醚后備用。

1.3 干燥方法 將華金六號金銀花鮮葉分為8組，每組約150 g，按表1 條件進行干燥。

表1 金銀花葉干燥方式及條件

1.4 指標(biāo)成分含量測定

1.4.1 綠原酸含量測定 對照品溶液的制備：取適量綠原酸對照品，精密稱定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇制成0.04 mg/mL 的溶液，10 ℃以下保存（中國藥典，2015）。

供試品溶液的制備：取約0.5 g 金銀花葉粉末（過四號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理 （功率250 W，頻率 35 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL 棕色量瓶中，加入50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

色譜條件：使用C18 柱；以乙腈-0.4%磷酸溶液（13 : 87）為流動相。檢測波長為 327 nm，流速1 mL/min，柱溫 30 ℃。色譜圖見圖1。

1.4.2 木犀草苷含量測定 對照品溶液的制備：取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成 0.04 mg/mL 的溶液，即得（中國藥典，2015）。

圖1 綠原酸對照品（A）和綠原酸供試品（B）HPLC 色譜圖

供試品溶液的制備：取約2 g 金銀花葉粉末（過四號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率 35 kHz）1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，回收溶劑至干，殘渣用70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

色譜條件：使用苯基硅烷鍵合硅膠色譜柱；以乙腈作為流動相A 和0.5%冰醋酸溶液作為流動相B 進行梯度洗脫；檢測波長為350 nm。流速1 mL/min，柱溫 30 ℃。色譜圖見圖2。

圖2 木犀草苷對照品（A）和木犀草苷供試品（B）HPLC 色譜圖

1.4.3 馬錢苷含量測定 對照品溶液的制備：取適量馬錢苷對照品，精密稱定，加50%甲醇制成每 0.04 mg/mL 的溶液，即得（中國藥典，2015）。

供試品溶液的制備： 取約1 g 金銀花葉粉末（過三號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理 （功率500 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

色譜條件： 使用苯基硅烷鍵合硅膠色譜柱；以乙腈-0.4%磷酸溶液（12:88）為流動相。檢測波長為 236 nm，流速 1 mL/min，柱溫 25 ℃。色譜圖見圖3。

圖3 馬錢苷對照品（A）和馬錢苷供試品（B）HPLC 色譜圖

1.4.4 總黃酮含量測定 對照品溶液的制備：精密稱取木犀草苷對照品適量，加60%乙醇溶解并配制成約0.2 mg/mL 的溶液，即得。

供試品溶液的制備：金銀花葉經(jīng)干燥粉碎后，精密稱取約1 g 粉末（過三號篩），置于具塞錐形瓶后精密加入25 倍量60%乙醇，超聲處理（功率500 W，頻率 40 kHz）50 min，用 60%的乙醇補足減失的重量，放冷至室溫，抽濾后將濾液置于100 mL 容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，即得。

含量測定：參照李志明等（2006）總黃酮含量測定方法并稍作修改。分別取陰干金銀花葉醇提液0.5 mL、 真空60 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、40 ℃烘干金銀花葉醇提液 0.4 mL、50 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、60 ℃烘干金銀花葉醇提液 1 mL、70 ℃烘干金銀花葉醇提液 0.9 mL、80℃烘干金銀花葉醇提液1 mL、100 ℃烘干金銀花葉醇提液0.8 mL 于25 mL 容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，于350 nm 測吸光度，計算總黃酮濃度。

1.4.5 總酚酸含量測定 對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，加70%乙醇溶解并配制成約0.2 mg/mL 的溶液，即得。

供試品溶液的制備：金銀花葉經(jīng)干燥粉碎后，精密稱取約1 g 粉末（過三號篩），置于具塞錐形瓶后精密加入25 倍量70%乙醇，超聲處理（功率500 W，頻率 40 kHz）30 min，用 70%的乙醇補足減失的重量，放冷至室溫，抽濾后將濾液置于100 mL 容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，即得。

含量測定：參照宋琳琳等（2013）總酚酸含量測定方法并稍作修改。分別取陰干金銀花葉醇提液0.4 mL、真空60 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、40 ℃烘干金銀花葉醇提液0.3 mL、50 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、60 ℃烘干金銀花葉醇提液0.8 mL、70 ℃烘干金銀花葉醇提液 0.8 mL、80 ℃烘干金銀花葉醇提液1 mL、100 ℃烘干金銀花葉醇提液0.8 mL 于25 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，于327 nm 測吸光度，計算總酚酸濃度。

1.4.6 總環(huán)烯醚萜苷含量測定 對照品溶液的制備：精密稱取馬錢苷對照品適量，加90%乙醇溶解并配制成約0.2 mg/mL 的溶液，即得。

供試品溶液的制備：金銀花葉經(jīng)干燥粉碎后，精密稱取約1 g 粉末（過三號篩），置于具塞錐形瓶后精密加入15 倍量90%乙醇，超聲處理（功率500 W，頻率 40 kHz）30 min，用 90%的乙醇補足減失的重量，放冷至室溫，抽濾后將濾液置于100 mL 容量瓶中，用90%乙醇稀釋至刻度，即得。

含量測定：參照王赟等（2011）總環(huán)烯醚萜苷含量測定方法并稍作修改。分別取陰干金銀花葉醇提液0.5 mL、 真空60 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、40 ℃烘干金銀花葉醇提液 0.4 mL、50 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、60 ℃烘干金銀花葉醇提液0.8 mL、70 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、80 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL、100 ℃烘干金銀花葉醇提液0.5 mL 于25 mL 容量瓶中，用90%乙醇定容至刻度，于236 nm 測吸光度，計算總環(huán)烯醚萜苷濃度。

1.5 各指標(biāo)成分方法學(xué)考察

1.5.1 綠原酸、馬錢苷、木犀草苷含量測定方法學(xué)考察

1.5.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取綠原酸、 馬錢苷、木犀草苷對照品，按各成分色譜條件注入色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)進行回歸分析，見表2。

1.5.1.2 精密度試驗 分別取 “2.3.1”、“2.3.2”、“2.3.3”中制備的供試品溶液，按各指標(biāo)成分色譜條件，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，綠原酸、馬錢苷、木犀草苷含量的RSD 值見表3，結(jié)果表明方法精密度良好。

表2 線性關(guān)系考察

1.5.1.3 穩(wěn)定性試驗 分別取“2.3.1”“2.3.2”“2.3.3”中制備的供試品溶液，按各指標(biāo)成分色譜條件，分別于 2、4、6、8、12、24 h 進樣，記錄峰面積，綠原酸、馬錢苷、木犀草苷含量的RSD 值見表3。

1.5.1.4 重復(fù)性試驗 分別取6 份金銀花葉供試品溶液，按各指標(biāo)成分色譜條件，進樣后綠原酸、馬錢苷、木犀草苷峰面積的RSD 值見表3，表明重復(fù)性良好。

1.5.1.5 加樣回收率試驗 分別取已測定指標(biāo)成分量的金銀花葉樣品溶液6 份，精密稱定，加入對照 品 0.0412 mg/mL 綠 原 酸 、0.0388 mg/mL 馬 錢苷、0.04164 mg/mL 木犀草苷各0.4 mL，按照各指標(biāo)成分色譜條件進樣測定。計算得綠原酸、 馬錢苷、 木犀草苷平均回收率分別為 99.61%、100.05%、 99.78%，RSD 值見表3。

1.5.2 總黃酮、總酚酸、總環(huán)烯醚苷含量測定方法學(xué)考察

1.5.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取綠原酸、 馬錢苷、木犀草苷對照品，在 327、236、350 nm 下測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)進行回歸分析，見表2。

1.5.2.2 精密度試驗 分別取 “2.3.4”、“2.3.5”、“2.3.6”中制備的供試品溶液，在 350、327、236 nm下測定總黃酮、總酚酸、總環(huán)烯醚萜苷的吸光度，連續(xù)測定 6 次，RSD 值見表3。

1.5.2.3 穩(wěn)定性試驗 分別取 “2.3.4”、“2.3.5”、“2.3.6”中制備的供試品溶液，在 350、327、236 nm下分別測定總黃酮、總酚酸、總環(huán)烯醚萜苷2、4、6、8、12、24 h 后供試品溶液的吸光度，RSD 值見表3。

1.5.2.4 重復(fù)性試驗 取金銀花葉供試品溶液6份，分別在 350、327、236 nm 下測定總黃酮、 總酚酸、總環(huán)烯醚萜苷吸光度，RSD 值見表3。

1.5.2.5 加樣回收率試驗 分別取已測定指標(biāo)成分量的金銀花葉樣品溶液6 份，加入0.1816 mg/mL木犀草苷對照品0.4 mL、0.1936 mg/mL 綠原酸對照品 0.2 mL、0.1928 mg/mL 馬錢苷對照品0.5 mL，分別在 350、327、236 nm 下測定總黃酮、總酚酸、總環(huán)烯醚萜苷吸光度，計算的平均回收率分別為98.76%、99.06%、101.1%。RSD 值見表3。

表3 指標(biāo)成分方法學(xué)考察RSD 值 %

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用Graphpad Prism 繪制相應(yīng)的圖表，IBM SPSS Statistics 21 分別對綠原酸、馬錢苷、木犀草苷、總酚酸、總黃酮、總環(huán)烯醚萜苷進行單因素方差分析和多重比較，Microsoft excel 2016 對數(shù)據(jù)進行處理。

2 試驗結(jié)果

2.1 干燥方法對金銀花葉失水率及外觀的影響從表4 可以看出，不同烘干溫度對金銀花葉外觀存在影響，溫度越高，金銀花葉顏色越深。

表4 不同干燥方法金銀花葉失水率及外觀顏色

2.2 綠原酸、馬錢苷和木犀草苷的含量測定結(jié)果由圖4 可知，金銀花葉中綠原酸、馬錢苷和木犀草苷的含量因不同干燥方式而存在顯著差異。綠原酸含量在40 ℃烘干時最高，為40.9692 mg/g。在陰干和100 ℃烘干條件下，綠原酸含量無顯著性差異。真空 60 ℃和 50、60、80、70 ℃烘干條件下綠原酸含量存在顯著性差異，其中70 ℃烘干處理時綠原酸含量最低。馬錢苷含量以40 ℃烘干含量最高，為35.3032 mg/g。八種不同干燥方式下馬錢苷含量存在顯著性差異，馬錢苷含量由高到低排序為 40 ℃烘干＞真空 60 ℃烘干＞50 ℃烘干＞100 ℃烘干＞陰干＞60 ℃烘干＞80 ℃烘干＞70 ℃烘干。木犀草苷在陰干條件下含量最高，為15.4562 mg/g。真空60 ℃烘干、80 ℃烘干和100 ℃烘干干燥方式對木犀草苷含量無顯著影響且木犀草苷含量最低。八種不同干燥方式下，綠原酸、馬錢苷含量總體趨勢一致，從陰干、 真空60 ℃烘干到40 ℃烘干，含量逐步上升。50、60、70 ℃烘干時綠原酸和馬錢苷含量呈現(xiàn)遞減趨勢，且在70 ℃烘干時含量達到最低水平，隨著溫度的升高，在80 ℃烘干和100 ℃烘干條件下，兩者含量逐步增加。木犀草苷含量在70 ℃烘干條件下最低，為0.9554 mg/g，在80 ℃烘干和100 ℃烘干時呈現(xiàn)增長趨勢。

圖4 綠原酸、馬錢苷、木犀草苷含量測定

2.3 總酚酸、總黃酮、總環(huán)烯醚萜苷含量測定結(jié)果 結(jié)果見圖5，不同干燥方式對金銀花葉總酚酸、總黃酮和總環(huán)烯醚萜苷的含量影響顯著?？偡铀岷恳?0 ℃烘干時最高，其次為陰干，二者無顯著性差異，其含量在60 ℃烘干時最低，為18.5333 mg/g，與70 ℃烘干無顯著性差異?？傸S酮含量以40 ℃烘干最高，為54.0721 mg/g，其次為陰干法，二者無顯著性差異，60 ℃烘干時總黃酮含量最低?？偔h(huán)烯醚萜苷含量因烘干方法不同明顯分為四組，四組間差異顯著。其含量以陰干和40 ℃烘干最高，二者無顯著性差異。其次為真空60 ℃烘干，50 ℃烘干和 100 ℃烘干，三者之間無顯著性差異。70 ℃烘干和80 ℃烘干時總環(huán)烯醚萜苷含量最低，二者之間無顯著性差異，分別為54.7235 mg/g 和 56.2156 mg/g。

圖5 總酚酸、總黃酮、總環(huán)烯醚萜含量測定

3 分析與討論

葉綠素主要有 2 種，葉綠素 a 在 645 nm 和663 nm 處均有吸收，在645 nm 處吸光系數(shù)較?。蝗~綠素b 在645 nm 和663 nm 處亦都有吸收，但在645 nm 處吸光系數(shù)較大，在663 nm 處較小。本試驗總黃酮、 總酚酸和總環(huán)烯醚萜苷含量測定所用吸光度分別為350、327 nm 和236 nm，處于葉綠素吸收曲線波谷位置，且樣品經(jīng)25 倍稀釋，影響甚微。本試驗前期預(yù)試驗取金銀花葉經(jīng)干燥粉碎后，精密稱取約1 g 粉末（過三號藥典篩），于索氏提取器中回流至石油醚無色，后置于具塞錐形瓶后精密加入25 倍量70%乙醇，超聲處理（功率 500 W，頻率 40 kHz）30 min，用 70%的乙醇補足減失的重量，放冷至室溫，抽濾后將濾液置于100 mL 容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度。后取1 mL 提取液于25 mL 棕色容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度。取未脫色金銀花葉粉末按上述條件進行制備提取液后稀釋相同倍數(shù)。測石油醚脫色后和未脫色總酚酸吸光度分別為0.361 和0.362相差不大，可以接受，故用醇提液直接測總成分含量。參考宋琳琳等（2013）和羅海青等（2018）報道方法，紫外分光光度法測定蒼耳草總酚酸和黃皮葉總黃酮含量中，經(jīng)50%甲醇提取液和70%乙醇提取液后用比色法在波長326 nm 和503 nm 處測定總酚酸和總黃酮含量，也不涉及脫去醇溶性葉綠素的步驟?？梢姶既苄匀~綠素對試驗結(jié)果的影響可忽略不計。

總酚酸、 總黃酮和總環(huán)烯醚萜苷的含量用紫外分光光度計法分別以綠原酸、 木犀草苷和馬錢苷為對照品于 327、350 nm 和 236 nm 處測定。李志明等（2006）測得金銀花和葉總黃酮樣品提取液最大吸收位置為363 nm 左右。本課題組對金銀花葉總黃酮提取液進行全波長掃描測定，金銀花葉總黃酮提取液最大吸收波長在355 nm左右，因木犀草苷在350 nm 處有最大吸收，故本試驗以木犀草苷為對照品于350 nm 測定總黃酮樣品提取液的吸光度，進而測得總黃酮含量。宋琳琳等（2013）和王赟等（2011）研究表明，總酚酸提取液在326 nm 處、總環(huán)烯醚萜苷提取液在238 nm 處有最大吸收。綠原酸和馬錢苷最大吸收波長分別為327 nm 和236 nm，故本試驗分別以綠原酸和馬錢苷為對照品于327 nm 和236 nm 處測定總酚酸和總環(huán)烯醚萜苷樣品提取液的吸光度，進而測定含量。

通常認(rèn)為，金銀花葉顏色越深，其有效成分含量越低。但是本試驗測得在80 ℃烘干和100℃烘干時，金銀花葉中大多數(shù)有效成分含量反而呈現(xiàn)遞增趨勢，與張永清等（1999）得出的干燥后藥材外觀色澤深淺與其綠原酸含量呈負(fù)相關(guān)，即藥材色澤越深，綠原酸含量越低的結(jié)論有差異。此外，不同厚度下干燥金銀花葉對其外觀性狀及有效成分含量也有影響。較薄時金銀花葉干燥過度，導(dǎo)致色澤發(fā)黑、蜷縮嚴(yán)重，金銀花外觀形狀較差同時單層物料內(nèi)的氧化酶對溫度變化敏感，易被激活，從而使多種有效成分含量降低而影響金銀花葉質(zhì)量。金銀花葉太厚時，干燥不均勻，水分含量較高且干燥程度不均勻，干燥時間過長導(dǎo)致金銀花葉顏色變深，影響金銀花葉品質(zhì)（趙桂明，2013）。

綠原酸含量的高低是金銀花質(zhì)量好壞的標(biāo)準(zhǔn)，也是干燥后成品檢驗的一個重要指標(biāo)（吉永奇等，2008）。綠原酸屬于植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，其極易在多酚氧化酶的作用下氧化縮合成高分子的有色物質(zhì)發(fā)生褐變 （張永清等，1998）。當(dāng)溫度低于氧化酶的變性溫度時，溫度越高，多酚氧化酶的活性越高，綠原酸由于酶的作用含量逐步減少。當(dāng)溫度過高使酶失去活性，綠原酸氧化縮合作用減少，含量呈現(xiàn)上升趨勢（彭菊艷等，2006）。金銀花葉含有較多的氧化酶，高溫能滅活金銀花葉中各種酶，使綠原酸、木犀草苷的損失達到最小化（陳燕文等，2017）。然而，綠原酸是一種極性有機酸酯，其性質(zhì)不穩(wěn)定且易于分解（謝娟平等，2015） 。長時間強光及高溫干燥使綠原酸結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而使其含量降低（何希瑞等，2013）。與綠原酸類似，木犀草苷結(jié)構(gòu)中也含有多個酚羥基，對熱的穩(wěn)定性也較差。從干燥工藝來看，真空干燥應(yīng)該優(yōu)于其他干燥方式，但試驗結(jié)果恰恰相反，這可能是由于真空干燥后得到的產(chǎn)品膨松多孔而使金銀花葉極易被氧化所致（陳德經(jīng)，2006）。金銀花葉中的氧化酶對有機酸類成分的氧化起到了催化作用，所以總有機酸的損失相對較多。高溫還可促使金銀花葉中分解黃酮的氧化酶失活，又進一步減少了黃酮類成分的破壞（石曉晨等，2018）。但是過高的溫度會破壞總酚酸和總黃酮結(jié)構(gòu)，使其含量降低。總黃酮、總酚酸和總環(huán)烯醚萜苷含量于70 ℃烘干時含量達到最低，80 ℃和100℃烘干后含量上升，可能是由于在加熱過程中某些物質(zhì)發(fā)生了成分的分解轉(zhuǎn)化，影響了總黃酮、總酚酸和總環(huán)烯醚萜苷的含量。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，除木犀草苷外，在40 ℃烘干時5 種成分含量均呈現(xiàn)出最大值，此外總黃酮、總酚酸、總環(huán)烯醚萜苷三種成分同時在陰干和40 ℃烘干時呈現(xiàn)出較高含量。隨著烘干溫度的升高，大多數(shù)有效成分的含量在70 ℃烘干時最低，80 ℃和100 ℃烘干時含量呈現(xiàn)上升趨勢，這個上升過程是否是由于加熱使金銀花葉內(nèi)的成分發(fā)生分解轉(zhuǎn)化，或是由于高溫使金銀花葉結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，釋放出所測成分還有待于進一步試驗研究。